[摘要] 目的 探討熊果酸誘導(dǎo)人急性髓性白血病細(xì)胞系（HL-60）細(xì)胞凋亡及抑制增殖作用機(jī)制是否與PTEN-Akt信號(hào)傳導(dǎo)途徑相關(guān)。 方法 體外培養(yǎng)HL-60細(xì)胞。瓊脂糖凝膠電泳觀察DNA梯形條帶。Western Blot探討UA對(duì)HL-60細(xì)胞PTEN、p-Akt蛋白表達(dá)的影響。 結(jié)果 UA可上調(diào)HL-60細(xì)胞PTEN蛋白表達(dá)和抑制P-Akt蛋白表達(dá)并呈時(shí)間依賴方式，PPARγ特異性阻斷劑GW9662預(yù)孵育可拮抗此作用。 結(jié)論 熊果酸抑制HL-60細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)凋亡與其上調(diào)PTEN蛋白表達(dá)，抑制抑制Akt磷酸化相關(guān)。

[關(guān)鍵詞] 人急性髓性白血病；熊果酸；增殖；Akt

[中圖分類號(hào)] R733.710；R735.205 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 2095-0616（2015）17-31-04

Relationship between PTEN-Akt pathway and ursolic acid on apoptosis and in inhibiting the proliferation of HL-60 cells

YUE Jun

Shaoyang Center for Diseas Control and Prevention， Shaoyang 422000， China

[Abstract] Objective To investigat the relationship between PTEN-Akt pathway and ursolic acid in induction the apoptosis and in inhibiting the proliferation of HL-60 cells. Methods HL-60 cells line were cultured in vitro. To observe the DNA ladder bands by DNA agarosegel electrophoresis. To explore the influence of UA about the PTEN and p - Akt protein of HL-60 cells with western Blot. Results The expression of the PTEN protein to be increased and the expression of the P-Akt protein to be inhibited of the HL-60 cells by UA with time dependent manner. this effect to be blocked by GW9662 of PPARγ pre-incubated. Conclusion The proliferation to be inhibited and the apoptosis to be inducted by Ursolic acid with related by raising the PTEN and inhibiting the p-AKt protein.of the HL-60 cells.

[Key words] Human acute myeloid leukaemia； Ursolic acid； Proliferation； Akt

熊果酸（ursolic acid，UA）又名烏索酸，是許多中草藥的主要有效成分[1-2]。熊果酸作為從天然植物中開(kāi)發(fā)的抗炎和降血脂藥物，目前在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中得到很好的驗(yàn)證。最近，熊果酸的抗腫瘤活性越來(lái)越受到關(guān)注。有研究證實(shí)，熊果酸可誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞如乳腺癌[3]、卵巢癌肝癌[4]、BEL-7404[5]、肺癌、胃癌BGC823細(xì)胞[6]等發(fā)生凋亡。熊果酸還可以抑制人早幼粒白血病細(xì)胞增殖[7]，但其作用機(jī)制目前還不完全清楚。PTEN具有雙特異性磷酸酶活性，是一種抑癌基因，目前發(fā)現(xiàn)大多實(shí)體瘤存在PTEN基因突變，血液系統(tǒng)腫瘤中有不同程度的缺失和低表達(dá)，但是突變罕見(jiàn)。PTEN作為PI3K/Akt途徑的反向調(diào)控因子，通過(guò)抑制P I3K/Akt通路的激活抑制腫瘤細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡。本研究旨在探討UA誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞凋亡及抑制增殖作用與PTEN-Akt途徑的相關(guān)性。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)

HL-60細(xì)胞由武漢大學(xué)中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心提供。用RPMI-1640培養(yǎng)基（10%小牛血清）在37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)取采用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞。

1.2 藥品與試劑

Sigmmma公司提供UA及GW9662；p-Akt、PTEN鼠抗人單抗和兔抗人多抗Sigmmma公司生產(chǎn)；PVDF膜購(gòu)于Pall公司；DMSO購(gòu)于Ameresco公司。

1.3 瓊脂糖凝膠電泳觀察DNA梯形條帶

按說(shuō)明書(shū)步驟用凋亡細(xì)胞DNA ladder檢測(cè)試劑盒分別提取未處理組、濃度為0.1，1.0，10.0μM的UA及DMSO 10μM處理細(xì)胞的DNA，提取10μL DNA樣品進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，觀察并攝影DBT-08凝膠圖像。

1.4 Western Blot分析HL-60細(xì)胞PTEN、p-Akt蛋白表達(dá)的影響

在培養(yǎng)板中接種1mL濃度為2×104/mL的

表3 GW9662對(duì)UA上調(diào)HL-60細(xì)胞PTEN蛋白表達(dá)的阻斷作用（，n=3）

參數(shù) 濃度（μM）

空白對(duì)照 1.0 10.0 1.0+GW9662（10） 10.0+GW9662（10）

PTEN蛋白表達(dá) 100 189.000±1.970 219.500±3.666 140.333±2.219 98.900±1.114

t -78.259 -56.458 -31.484 1.711

P 0.000 0.000 0.000 0.162

注：各濃度與空白比較，P<0.05

HL-60細(xì)胞，并加入U(xiǎn)A10.0μM孵育0，4，8，24h；收集細(xì)胞離心，進(jìn)行蛋白定量測(cè)定；用胎牛血清標(biāo)化對(duì)照組，加緩沖液煮沸5min后用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，PVDF膜承載轉(zhuǎn)移蛋白，用PTEN、p-Akt抗體孵育，加入過(guò)氧化物酶標(biāo)記二抗使膠片感光。再用GW9662檢測(cè)UA能否通過(guò)活化PPARγ影響PTEN、p-Akt蛋白表達(dá)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

各組數(shù)據(jù)利用SPSS17.0軟件分析，計(jì)量資料用（）表示，采用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 DNA凝膠電泳觀察UA誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞凋亡作用

凝膠電泳探討UA能否導(dǎo)致HL-60細(xì)胞的DNA發(fā)生非隨機(jī)性剪切。結(jié)果證實(shí)出現(xiàn)典型“梯形”DNA條帶；表明UA確實(shí)能夠誘導(dǎo)人HL-60細(xì)胞凋亡。見(jiàn)圖1。

2.2 Western blotting觀察UA對(duì)對(duì)HL-60細(xì)胞PTEN- Akt信號(hào)途徑影響

對(duì)HL-60細(xì)胞采用UA 1.0μM分別孵育0，4，8和24h后，結(jié)果表明UA能夠上調(diào)HL-60細(xì)胞PTEN蛋白表達(dá)且呈時(shí)間依賴方式，較0h分別上調(diào)（176.33±7.83），（206.50±2.49）和（217.33±10.61），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表1）；UA能夠下調(diào)HL-60細(xì)胞p-Akt蛋白表達(dá)，同樣呈時(shí)間依賴方式，較0h分別下調(diào)（82.800±4.69），（37.16±2.55）和（10.20±1.47），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表2）。用特異性阻斷劑GW9662 10.0μM預(yù)孵育30min后，采用UA（1.0μM，10.0μM）分別作用HL-60細(xì)胞24h，結(jié)果證實(shí)UA上調(diào)HL-60細(xì)胞PTEN蛋白表達(dá)作用能被GW9662有效拮抗，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表3）。

3 討論

腫瘤形成是多種因素、多個(gè)步驟和多種基因突變的過(guò)程，目前已經(jīng)明確多類化學(xué)物質(zhì)能夠誘發(fā)和促進(jìn)腫瘤形成，有許多研究證實(shí)熊果酸對(duì)腫瘤的形成有預(yù)防和抑制作用，且抗瘤譜廣、不良反應(yīng)低[8]；

M A B C D E

圖1 DNA凝膠電泳觀察UA對(duì)HL-60細(xì)胞凋亡的影響

表1 UA對(duì)HL-60細(xì)胞PTEN蛋白表達(dá)的影響（，n=3）

參數(shù) 時(shí)段

0h 4h 8h 24h

PTEN蛋白表達(dá) 100 176.33±7.831 206.500±2.498 217.333±10.617

t -16.883 -73.844 -19.141

P 0.003 0.000 0.003

注：各時(shí)段與0h比較，P<0.05

表2 UA對(duì)HL-60細(xì)胞p-Akt表達(dá)的影響（，n=3）

參數(shù) 時(shí)段

0h 4h 8h 24h

p-Akt表達(dá) 100 82.800±4.690 37.167±2.558 10.200±1.473

t 6.353 42.545 105.586

P 0.003 0.000 0.000

注：各時(shí)段與0h比較，P<0.05

許多人正致力于將其作為一種高效低毒的抗腫瘤藥物用于臨床的研究。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，熊果酸能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，顯著抑制某些惡性腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)。熊果酸能夠作用于HL-60 細(xì)胞周期，周期阻滯作用隨著濃度升高明顯加強(qiáng)；熊果酸能夠誘導(dǎo)BEL-7404細(xì)胞凋亡，認(rèn)為與上調(diào)caspase-9蛋白和抑制procaspase-3蛋白表達(dá)相關(guān)；熊果酸還可引起抗凋亡蛋白Mcl21的表達(dá)下調(diào)，在誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞凋亡中起著重要的作用，分析認(rèn)為熊果酸能降低Mcl21蛋白表達(dá)，從而促發(fā)Caspase23、Caspase29的降解/活化及PARP的降解，促發(fā)細(xì)胞凋亡過(guò)程。本人前期實(shí)驗(yàn)[9]證明熊果酸呈濃度依賴性下調(diào)Bcl-2蛋白、上調(diào)bax蛋白表達(dá)，抑制HL-60細(xì)胞增殖、誘發(fā)凋亡過(guò)程。

PTEN 主要通過(guò)抑制PI3K和PKB（又稱Akt）磷酸化，進(jìn)而影響細(xì)胞生長(zhǎng)及凋亡過(guò)程。目前已經(jīng)明確許多腫瘤發(fā)生與PI3K/Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)。胞質(zhì)中PI3K 一般處在靜息狀態(tài)，相應(yīng)受體與生長(zhǎng)因子結(jié)合后，PI3K的p110催化亞基被激活。被激活的p110 催化亞基再磷酸化磷酸肌醇（PI）肌糖環(huán)的D3位點(diǎn)，使底物Ptd Ins（4，5）P2（PIP2）轉(zhuǎn)化為Ptd Ins（3，4，5）P3（PIP3）。作為第二信使的PIP3激活下游的Akt 蛋白等[10]。AKT 激活是其發(fā)揮促細(xì)胞生存、增殖功能的重要前提，活化的Akt能降低凋亡促進(jìn)因子活性和增加抗凋亡蛋白的活性，Bad蛋白被Akt磷酸化并釋放被其抑制的抗凋亡蛋白Bcl-xL，磷酸化的Bad蛋白通過(guò)阻斷細(xì)胞色素C的釋放參與抗凋亡過(guò)程。如果抑制PI3K/Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，導(dǎo)致明顯下調(diào)細(xì)胞中Akt磷酸化水平，進(jìn)而使細(xì)胞生長(zhǎng)周期的激酶抑制因子P27/kIpI上調(diào)，干擾細(xì)胞生長(zhǎng)信號(hào)，增加細(xì)胞對(duì)凋亡的敏感性。Woenckhaus等[11]的研究提示，在惡性腫瘤中阻斷PI3K活性及其下游靶點(diǎn)Akt，上調(diào)催化亞基p110α的PI3KCA 基因， 從而增加卵巢癌細(xì)胞系PI3K 活性，促發(fā)卵巢癌細(xì)胞凋亡過(guò)程。英國(guó)學(xué)者對(duì)I型PI3K抑制劑PI103進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)它能有效抑制PI3K的某些亞型，從而有效抑制卵巢癌細(xì)胞的侵襲能力[12]。日本學(xué)者也發(fā)現(xiàn)PI3K抑制劑LY29400能促進(jìn)紫杉醇對(duì)卵巢癌細(xì)胞的凋亡作用[13]。

Akt通過(guò)磷酸化抑制caspase-9的活性抑制凋亡。Akt 抑制劑已經(jīng)成為實(shí)驗(yàn)研究的熱點(diǎn)，它能拮抗Akt的抗凋亡作用，使癌細(xì)胞耐藥性被破壞，從而誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡[14]。Yang等[15]的實(shí)驗(yàn)證實(shí)：化療藥物順鉑能誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞凋亡，而Akt 激活可抑制該藥物作用，抑制Akt 活性則該作用恢復(fù)，提示Akt可能與卵巢癌順鉑耐藥有密切關(guān)系。

PI3K/Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是PTEN的主要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，PTEN是Akt通路的抑制因子，目前已經(jīng)明確，PTEN 基因的缺失及Akt的磷酸化是血液系統(tǒng)惡性腫瘤發(fā)生的重要機(jī)制之一[16]。PPARγ是核受體轉(zhuǎn)錄因子，作為過(guò)氧化物酶體增殖體激活受體，能夠使PTEN蛋白的表達(dá)上調(diào)；而GW9662能夠抑制這種作用。

本實(shí)驗(yàn)用DNA凝膠電泳觀察發(fā)現(xiàn)UA能夠誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞凋亡。Westernblot分析發(fā)現(xiàn)，熊果酸使HL-60細(xì)胞PTEN蛋白在各個(gè)時(shí)間段表達(dá)值不同，時(shí)間依賴性呈現(xiàn)逐漸上調(diào)趨勢(shì)，P-Akt蛋白在各個(gè)時(shí)間段表達(dá)值也不同，時(shí)間依賴性呈現(xiàn)逐漸下調(diào)趨勢(shì)。熊果酸的上調(diào)PTEN蛋白作用可被GW9662（10μM）預(yù)孵育拮抗，且以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。實(shí)驗(yàn)表明：熊果酸可通過(guò)作用HL-60細(xì)胞的PTEN-Akt途徑，誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞凋亡和抑制增殖。

綜上所述，熊果酸誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞凋亡和抑制增殖作用明顯。它可能通過(guò)作用于HL-60細(xì)胞PPARγ、上調(diào)PTEN、抑制Akt磷酸化，抑制HL-60細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)凋亡。

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（收稿日期：2015-04-28）