黃 滔，董 芬，吳貴輝，陳 艷，顧 偉，張建新

(貴州省中國科學院天然產物化學重點實驗室，貴州 貴陽 550002)

杜仲(Eucommia ulmoides Oilv.)為杜仲科杜仲屬植物，杜仲又名思仲、木棉、絲連皮等［1］。分布于陜西、甘肅、河南、湖北、四川、云南、貴州、湖南及浙江等省區(qū)，現各地廣泛栽種［2］。杜仲是我國特有名貴樹種，可作為藥用、膠用、材用及用作保健飲料、飼料等的原料。杜仲作為藥用始載于《神農本草經》，并列為藥之上品，具有補中益氣、強志、堅筋骨、久服輕身耐勞的功效。杜仲從開始種到剝皮一般需要10年左右，因此僅皮作為藥源顯的資源緊缺。杜仲的化學成分研究表明，杜仲葉的化學成分與杜仲皮基本一致［3，4］，許多專家和學者證明了杜仲的葉與皮有相似的藥理作用［5-7］，以葉代皮的想法得到了進一步證實?，F在杜仲葉已作為一種新藥收入《中國藥典》。本研究在前期對杜仲葉中化學成分分離純化的基礎上［8］，擬采用核磁共振波譜技術建立杜仲1H-NMR(Proton Nuclear Magnetic Resonance)指紋圖譜，將為杜仲葉質量控制提供一種新方法。

1 材料與方法

1.1 儀器

INOVA 400 MHz核磁共振波譜儀(美國Varian公司)，譜儀控制軟件VNMR 6.1C(美國Varian公司)，氘代二甲基亞砜(美國Cambridge Isotope La-boratories公司)，電子分析天平(德國 sartorius公司)，N-1100型旋轉蒸發(fā)儀(上海愛朗儀器有限公司，5 mm核磁管(美國 Wilmad-LabGlass公司)。

1.2 供試樣品溶液的制備

杜仲(Eucommia ulmoides Oliv.)葉由貴陽中醫(yī)學院付志明教授鑒定，采自貴陽市三江農場，對照品為綠原酸、槲皮素、紫云英苷、陸地錦苷、山萘酚(均為前期從杜仲葉中分離中得到)。稱取杜仲葉粉末1.5 g，置50 mL圓底燒瓶中，加入65.0%乙醇溶液25 mL，加熱回流1 h，減壓旋轉蒸干溶劑，稱取10 mg浸膏置于5 mm核磁管中，加入0.6 mL DMSO-d6溶解，取得待測液，上機。

1.3 1H-NMR測定條件

以DMSO-d6為頻率內鎖，測定溫度 T=25℃，操作頻率399.9 MHz，脈沖序列 cpmgt2，譜寬sw=7 959 Hz，回波循環(huán)時間 d2=0.001 s，弛豫時間bt=0.1 s，采集時間at=3.744 s，脈沖延遲時間d1=10 s，采樣參數為nt=128次，脈沖寬度為sw=7 959 Hz，取得1H-NMR FID數據。并利用對照品，采用“標準樣品滴定”和JRES(J-Resolved)二維核磁共振波譜實驗得到的數據，鑒定從黔產杜仲葉總體取物的物質。

1.4 數據處理

將測得的1H-NMR FID數據導入MestReNova軟件，線性加寬因子lb=1 Hz，進行傅立葉轉換，并手動調整相位和基線，對0.5～12 ppm范圍內的譜圖以0.04 ppm為單位進行分段積分，并以總面積進行歸一化處理，然后以ASCII格式輸出數據導入Excel軟件中進行夾角余弦計算［9-10］，得到夾角余弦值。

1.5 重復性實驗

取同一批藥材粉末5份，每份2 g，按上供試樣品溶液的制備進行處理，再按得到5組1H-NMR FID積分數據數據，再運用Excel軟件計算各組夾角余弦值，得到5組之間的相關系數。

2 結果與分析

2.1 脈沖序列的選擇

分別選擇譜儀自帶的s2pul(standard twopulse sequence)和cpmgt2(Carr-Purcell Meiboom-Gill T2 pulse sequence)脈沖序列，采集1HNMR譜，考察脈沖序列對實驗結果的影響，結果如圖1所示。從譜圖中可以看出，采用cpmgt2脈沖序列采集1H-NMR譜(B圖)的實驗條件，可以去除粗提取物中的大分子信號，簡化譜圖，因此選擇cpmgt2序列作為杜仲葉1H-NMR指紋圖譜的脈沖序列。

圖1 提取物1H-NMRFig.1 The1H-NMR spectrum of crude extracts

2.2 杜仲葉的1H-NMR指紋圖譜

本研究采用“標準樣品滴定”和JRES(J-Resolved)二維核磁共振波譜實驗，從黔產杜仲葉總體取物中鑒定了5個化合物(圖2)，分別為綠原酸、槲皮素、紫云英苷、綠原酸甲酯、陸地錦苷及山萘酚。5個特征化合物的特征信號的化學位移及多重態(tài)分別為:綠原酸:δ7.44(d，J=16.0Hz)，7.04(s)，6.99(d，J=8.1Hz)，6.76(d，J=8.0Hz)，6.21(d，J=16.0Hz). 槲皮素:δ7.67(s)，7.54(d，J=9.1Hz)，6.88(d，J=9.4Hz)，6.41(s)，6.18(s).紫云英苷:δ8.04(d，J=7.4Hz，)，6.88(d，J=7.7Hz)，6.43(s)，6.21(s). 綠原酸甲酯 δ7.54(d，J=15.6Hz)，7.16(s)，7.05(d，J=7.2)，6.88(d，J=7.2Hz)，6.25(d，J=15.6Hz). 陸地錦苷 δ8.05(s)，7.97(s)，7.58(d，J=8.5Hz)，6.96(d，J=8.4Hz)，6.51(s)山萘酚 δ8.16(d，J=8.9Hz)，7.02(d，J=8.9Hz)，6.53(d，J=1.7Hz)，6.27(d，J=1.8Hz)。

圖2 杜仲葉總體取物1H-NMR譜Fig.2 The1H-NMR spectrum of crude extracts of Eucommia ulmoides Leaves

2.3 重復性實驗結果

5次重復提取的相關系數值分別為0.993，0.994，0.993，0.996，1，均在 0.99 以上，表明該方法具有較好的重現性。

3 結論

本研究采用1H-NMR分析技術，全面地體現了黔產杜仲葉的化學成分，同時使用了核磁滴定和JRES二維核磁共振波譜技術，對杜仲葉中的特征化合物進行了歸屬。研究結果表明，與傳統(tǒng)的高效液相色譜方法相比，基于核磁共振的分析技術能提供更全面的信息。同時選用cpmgt2脈沖序列測試1H-NMR譜，能很好的過濾掉杜仲膠等大分子信號，簡化譜圖。本方法樣品制備簡單、分析速度快，所建立的1H-NMR指紋圖譜重現性好，這為杜仲葉質量控制提供了一種新方法。

［1］辛曉明，馮 蕾，王 浩，等.杜仲的化學成分及藥理活性研究進展［J］.醫(yī)學綜述，2007，13(19):1 057-1 059.

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［9］王龍星，肖紅斌，梁鑫淼，等.一種評價中藥色譜指紋譜相似性的新方法:向量夾角法［J］.藥學學報，2002，37(9):713-717.

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