李 莉，田士林

(黃淮學(xué)院生物工程系，河南 駐馬店643000)

辣椒不僅是一種重要的蔬菜作物，還是天然食品色素的主要來源。成熟的辣椒果實常見的有紅、黃、橙等顏色，其中紅色辣椒果實是食品色素的主要來源。辣椒紅素(3，3′-dihydroxy-β，k-Caroten-6′-one)是辣椒果實紅色的主要成分，是一種兼具安全、營養(yǎng)和保健作用的天然食用色素，分子式為C40H56O3［1］。它主要存在于辣椒(Capsicum annuum L.)果皮色素母細胞中的類囊體膜上，占總類胡蘿卜素含量的60%以上［2］。Lcyb是調(diào)控β-胡蘿卜素合成的關(guān)鍵酶基因，其表達強弱直接會影響 β-胡蘿卜素的合成［3，4］，但Lcyb缺失或突變能否影響果實中辣椒紅素含量的變化未見相關(guān)報道。為此，本文通過Lcyb沉默，探討Lcyb對辣椒果實中辣椒紅素含量的影響，旨在為辣椒紅素合成調(diào)控機理的解析提供新信息。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

辣椒R15(Capsicum annuum cv.R15)由西北農(nóng)林科技大學(xué)辣椒課題組惠贈。

1.2 載體構(gòu)建

煙草脆裂病毒(TRV)被作為基因沉默載體，根據(jù)TRV結(jié)構(gòu)，設(shè)計含有上游BamHI酶切位點(F:5’-CGCGGATCCCATTGCCCTTTAATCATTTATT-3’)和下游含有Kpn I位點(R:5’-CGGGGTACCTTCACAGAGCTAAAGGCACTAAC-3’)的引物，隨后被轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化到TRV載體中。在本次實驗中，cv.R15材料綠熟期的果實被用來作為病毒誘導(dǎo)基因沉默(VIGS)實驗材料。以下是煙草脆裂病毒的結(jié)構(gòu)示意圖以及載體構(gòu)建示意圖(圖1)。

圖1 載體構(gòu)建結(jié)構(gòu)示意圖Fig.1 Construction of TRV expression vector

LB:T-DNA左邊界;RB:T-DNA右邊界;2×35S:35S啟動子;CP:外殼蛋白;RdRp:RNA依賴性RNA聚合酶;MP:移動蛋白;16K:16 KDa蛋白;R:核酶;N:NOS終止子;MCS:多克隆位點;pTRV2/Lcyb為Lcyb基因和TRV2連接形成的重組載體。

采用Trizol方法提取果實總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，cDNA被作為模板為PCR擴增。PCR擴增產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳分離，DNA凝膠試劑盒回收目的片段，之后回收產(chǎn)物用T4 DNA連接酶16℃過夜連接到克隆載體pMD19-T上，然后轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5a中。經(jīng)測序檢驗證明無移碼突變或堿基缺失，然后把目標(biāo)片段從PMD19-T載體上用酶BamHI和KpnI切下來，同時將質(zhì)粒pTRV2用同樣的內(nèi)切酶切下來。然后將目的片段和pTRV2連接起來，沉默載體構(gòu)建成功。最后把pTRV1和pTRV2載體通過凍融法轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101［5］，液氮保存以備后續(xù)使用。

1.3 病毒注射

將含有pTRV1、pTRV2及pTRV2/Lcyb菌液分別搖至OD600=1.0。將農(nóng)桿菌(GV3101)菌液pTRV1分別與農(nóng)桿菌(GV3101)菌液pTRV2及農(nóng)桿菌(GV3101)菌液pTRV2/Lcyb的按照1∶1(V/V)混合。在注射前，首先選擇果齡、大小、健康狀況一致的辣椒綠熟期(花后25 d)果實作為處理和對照材料。然后用注射器針頭在辣椒果柄基部扎一個孔，孔的深度為果柄直徑的1/2，然后將含有pTRV1、pTRV2(空載體，用TRV/00表示)的菌液及含有pTRV1、pTRV2/Lcyb(攜帶目的基因的載體，用TRV/Lcyb表示)的菌液用去掉針頭的注射器分別注射到綠熟期辣椒果實的果柄中。然后將辣椒連盆放入人工氣候室中(溫度18℃，相對濕度35%)暗培養(yǎng)兩天，然后將人工氣候箱調(diào)為(23℃，16 h光照)/(20℃，8 h黑暗)的光周期，相對濕度為35%的環(huán)境條件下進行培養(yǎng)，15天后，對照組(TRV/00)和沉默組果實(TRV/Lcyb)分別采摘用于后續(xù)基因表達和辣椒紅素含量的分析。

1.4 基因表達的檢測

采用Trizol法分別從對照和沉默組提取辣椒果實的總RNA［6］。用實時定量反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKa-Ra，寶生生物公司，中國)合成第一鏈cDNA，具體步驟參考試劑盒說明書?；虮磉_水平的高低采用實時定量PCR技術(shù)，用SYBR作為熒光染料，染料購自TaKaRa中國大連寶生生物公司。實時定量PCR采用20μl反應(yīng)體系，包括10.0μl SYBR Premix Ex Taq II，2.0μl cDNA模板，上下游引物各:6.4μl ddH2O 0.8μl。PCR擴增循環(huán)體系為95℃，1 min;95℃，10 s;48℃，30 s;72℃，20 s;總共45循環(huán)。Ubi3(AY486137.1)被作為內(nèi)參基因［7］，正向引物序列F:5’-CATTGCCCTTTAATCATTTATT-3’，反向引物序列R:5’-TTCACAGAGCTAAAGGCACTAAC-3’?；蛳鄬Ρ磉_水平的計算參考Livak等的方法［8］。所有樣品一式三份，每個處理三次生物學(xué)重復(fù)。

1.5 辣椒紅素含量的測定

辣椒紅素含量的測定采用Tian等(2014)的方法［5］。辣椒紅素的抽提具體如下:取5.0 g辣椒果皮組織，加入5 ml丙酮(0.1%BHT)于研缽中，將研缽置于冰上在暗中研磨成糊漿，將研磨后的辣椒組織倒入50 ml的具塞離心管中在3 500 rpm離心10分鐘，然后將抽提物轉(zhuǎn)入一個干凈的離心管中，樣品再用5.0 ml丙酮重復(fù)抽提2次，直至殘渣為白色為止。合并抽提液于一個新的離心管中，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)干燥器中常溫暗光離心蒸干，然后密封管口，用錫箔紙裹包嚴(yán)實后存放于20℃冰箱中以備HPLC檢測用。HPLC分析方法參照Tian等(2014)的方法［5］。液相色譜上樣體積為20μL，采用C-18柱(5μm，150 mm×4.6 mm)進行色素分離分析。流動相A(乙腈∶2-丙醇∶水/39∶53∶8)，流動相B(乙腈∶2-丙醇/60∶40);梯度洗脫:B相0-30 min從0 to 100%;流速設(shè)定為0.3 mL/min，柱溫為40℃。辣椒紅素標(biāo)準(zhǔn)品(0.001-0.1 mg/mL)在454 nm作校準(zhǔn)樣。根據(jù)標(biāo)樣的出峰時間確定樣品中的辣椒紅素成分及含量。辣椒紅素標(biāo)樣購自Extrasynthèse公司(Genay，法國)。所有的樣品均在暗光下冰上操作。標(biāo)樣和樣品用甲醇∶乙腈(1∶1，V/V)稀釋［3］。每組樣品測定三個重復(fù)。取三次測定的平均值作為該時刻該處理的辣椒紅素含量。采用SAS(SAS Institute，version 8.2)分析軟件對數(shù)據(jù)進行處理分析，采用SigmaPlot10.0軟件對辣椒紅素含量變化和基因表達情況進行作圖分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 VIGS沉默對Lcyb表達的影響

由以上分析得知，沉默Lcyb基因后，辣椒果色的形成受到了影響，導(dǎo)致無論從表型上還是從儀器分析上均說明果實顏色的形成受到了抑制。為了進一步證明VIGS沉默效果，我們對沉默后果實中Lcyb基因的表達情況進行了分析(圖2)，從圖2可以明顯地看出，經(jīng)過沉默的辣椒果實Lcyb基因表達量明顯低于對照。這說明采用TRV病毒的確能夠起到沉默Lcyb基因的效果，沉默效率約為80%。

圖2 沉默后基因表達量變化比較Fig.2 The change of Lcyb gene expression level by VIGS

(A)為實時定量PCR測定的基因表達量，TRV/00為空載體，TRV/Lcyb為沉默載體;(B)為半定量PCR分析。

2.2 Lcyb沉默后果實表型變化

沉默結(jié)果(圖3)表明，在辣椒果實綠熟期(花后25天)，果實顏色為綠色。此時我們對果實進行處理，其中TRV/00為只注射TRV病毒載體的對照果實，TRV/Lcyb為攜帶有Lcyb基因的重組TRV病毒載體。15天后，果色發(fā)生了明顯的變化，只注射空載體的果實顏色正常轉(zhuǎn)紅，這說明注射煙草脆裂病毒TRV不影響辣椒果實的正常轉(zhuǎn)紅。而注射攜帶有目的基因(TRV/Lcyb)的果實顏色出現(xiàn)了不均勻的橙紅色，果實顏色不能正常轉(zhuǎn)紅，通過比較發(fā)現(xiàn)，當(dāng)沉默Lcyb基因時首先影響的是果實顏色的變化。

圖3 基因沉默前后辣椒果色變化情況比較Fig.3 Phenotype changes in pepper fruits with Lcyb gene silencing via VIGS

2.3 VIGS沉默對辣椒果實顏色的影響

為了進一步驗證沉默后果實顏色的變化，我們對果實的顏色差異進行了檢測，檢測結(jié)果見表1。從表1中我們可以看出，以TRV/00為對照，比較沉默組(TRV/Lcyb)果實顏色差異發(fā)現(xiàn)，無論△L、△a、△b和△E，相對于對照組顏色均有很大的差異。這進一步說明沉默Lcyb基因的確造成了辣椒果實顏色的變化。

表1 Lcyb基因沉默后果實色差比較Tab.1 The color variation in TRV/00 and TRV/Lcyb fruits between the phenotypes

TRV/00:注射空載體的辣椒果實，作為對照;TRV/Lcyb:注射攜帶Lcyb基因的煙草脆裂病毒載體(TRV);在計算△L，△a和 △b時，TRV/00的色度作為對照;每個實驗材料進行三次生物學(xué)重復(fù)。

2.4 VIGS 沉默對辣椒紅素含量的影響

2.4.1 HPLC測定辣椒紅素出峰時間圖 通過高效液相色譜技術(shù)，我們對辣椒果實中辣椒紅素含量進行了測定［4，5］，辣椒紅素標(biāo)準(zhǔn)品購自法國Extrasynthèse公司，從圖4A中可以看出，辣椒紅素標(biāo)樣純度較高，出峰時間集中在7.36 min，峰圖犀利，可以作為測定辣椒紅素含量的標(biāo)準(zhǔn)樣品。B圖為樣品，從圖4B中可以看出，在7.36 min有一個較大的峰，通過與標(biāo)準(zhǔn)樣品峰圖比較，這個峰應(yīng)該是辣椒紅素成分峰。因此HPLC在454nm可以測定辣椒紅素含量的變化。

圖4 HPLC檢測辣椒果皮中辣椒紅素含量Fig.4 Resolution of Capsicum pericarp capsanthin by HPLC

圖5 沉默后辣椒紅素含量變化Fig.5 Capsanthin content in pepper fruits with Lcyb gene silencing via VIGSpsanthin by HPLC

2.4.2 辣椒紅素含量比較 通過分析可以看出(圖5)，通過病毒誘導(dǎo)基因沉默，沉默組辣椒紅素含量明顯低于對照，這說明，通過沉默Lcyb基因?qū)е吕苯芳t素含量發(fā)生了變化，直接導(dǎo)致辣椒紅素含量的降低。

3 結(jié)論與討論

通過沉默Lcyb基因，辣椒果實顏色明顯變淺(表1)，與正常果實相比，辣椒紅素含量下降比較明顯。說明辣椒紅素的合成不但與Ccs基因有關(guān)，而且也與調(diào)控β-胡蘿卜素合成的Lcyb基因有關(guān)。沉默Lcyb基因間接地影響了辣椒紅素的正常合成。Ccs基因的缺失或突變能夠影響辣椒紅素含量的變化［9］，而Lcyb基因的非正常表達也同樣能夠?qū)е吕苯芳t素含量的降低，影響成熟期辣椒果實顏色的形成。

辣椒果實紅色的形成是一個復(fù)雜的過程，它涉及到很多基因的參與［5］。本實驗通過病毒誘導(dǎo)基因?qū)苯饭麑嵵姓{(diào)控β-胡蘿卜素合成的基因進行沉默，研究該基因沉默后對辣椒紅素合成的影響。研究發(fā)現(xiàn)通過沉默Lcyb基因，辣椒紅素含量發(fā)生了大幅度的降低。這說明，Lcyb基因?qū)苯芳t素合成有一定的調(diào)控關(guān)系，結(jié)果的獲得豐富了辣椒紅素調(diào)控的分子機理。

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