臧正蓉 , 解修俊 趙佩佩 , 郇 麗 , 黃愛優(yōu) 張寶玉 潘光華 王廣策

(1. 中國科學院海洋研究所, 山東 青島 266071; 2. 中國科學院大學, 北京 100049; 3. 天津科技大學, 天津300457)

巖藻黃素(fucoxanthin)是一種類胡蘿卜素, 在自然界中含量豐富, 尤其是在海洋環(huán)境中廣泛存在[1]。在細胞中, 巖藻黃素與葉綠素a和葉綠素c組成捕光復合物, 作為捕光復合體[2]。有些藻類如甲藻和硅藻[3-4],由于其巖藻黃素的存在而呈特征性棕黃色。因此, 巖藻黃素有重要的研究意義。

研究發(fā)現(xiàn), 巖藻黃素有許多顯著的功效, 如抗氧化作用[5-6]、抗腫瘤作用[7-9]、抗癌作用[10-11]、皮膚保護作用[12]、抗血管生成作用[13]、腦血管保護作用[14]和預防骨質(zhì)疏松作用[15]等。因此, 巖藻黃素應用廣泛。尤其是近年來, 研究發(fā)現(xiàn), 巖藻黃素有減肥作用[16-17]、降糖作用[17-18]和降脂作用[19-20]。進一步表明, 巖藻黃素有很高的應用價值。

目前, 可用于提取巖藻黃素的原料有很多, 如褐藻、硅藻等藻類。最早的原料主要是大型海藻, 包括海帶(Laminaria japonica)、羊棲菜(Sargassum fusiforme)和裙帶菜(Undaria pinnatifida)等[21]。然而,采用大型海藻提取巖藻黃素, 存在許多問題。一方面,大型海藻養(yǎng)殖成本高且有季節(jié)性生長的特點。另一方面, 大型海藻的巖藻黃素僅存在于表面的皮層細胞, 因而含量低, 并且大型海藻在新鮮和干燥條件下巖藻黃素含量不同。這些問題限制了巖藻黃素的開發(fā)利用。除大型海藻外, 海洋微藻中的巖藻黃素含量也很多。單細胞微藻具有生長速度快、易于培養(yǎng)和在生物反應器中可人工調(diào)控的優(yōu)點, 從而解決了工業(yè)化生產(chǎn)的原料問題。

在培養(yǎng)單細胞微藻中, 為了解決生物量和巖藻黃素含量的問題, 作者以三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)為研究對象進行研究。三角褐指藻是一種海洋硅藻, 由Allen等于1910年分離得到[22], 其具有易于培養(yǎng)、可常年生長、生長速度快和易于調(diào)控的特點, 以三角褐指藻為研究對象具有很多優(yōu)勢。作者研究了溫度和光照對三角褐指藻的生長及巖藻黃素含量的影響, 包括不同的溫度條件、不同的光照強度和光質(zhì)條件, 為三角褐指藻用于巖藻黃素的提取提供有價值的參考。

1 材料與方法

1.1 藻種與培養(yǎng)

三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)由本實驗室提供。三角褐指藻采用f/2培養(yǎng)基[23], 在三角瓶中培養(yǎng)。溫度條件為(20±2)℃, 光照強度為 4000 lx,光周期為12L∶12D。

1.2 實驗方法

分別進行溫度、光照強度和光質(zhì)的影響實驗, 每種條件做3個平行。以正常培養(yǎng)三角褐指藻作對照,分別設置不同的溫度條件(20、25、30℃)、不同的光照強度(12800 lx、7200 lx、4000lx)和光質(zhì)條件[紅光(647～700 nm)、藍光(470～475 nm)、綠光(491～574 nm)],進行實驗。每天搖藻并更換三角瓶位置, 避免光照不均。

1.3 生長曲線的測定

從實驗處理開始, 每日取藻液測定730 nm處的光密度。根據(jù)標準曲線回歸公式y(tǒng)=107x+16315 (R2=0.9995)換算成細胞數(shù), 其中, y為細胞密度(個/mL), x為光密度。

1.4 光系統(tǒng)II活性的測定

使用 IMAGING-PAM 調(diào)制脈沖熒光儀(Heinz Walz GmbH, Effeltrich, Germany), 利用調(diào)制葉綠素熒光技術(shù)(Pulse-Amplitude-Modulation, PAM), 按照林阿鵬等[24]的測定方法進行樣品葉綠素熒光參數(shù)的測量, 從而反映細胞的光合活性。對于不同實驗條件處理的樣品, 每個三角瓶各取藻液 200 μL, 分別加到96孔板的孔內(nèi), 然后使用IMAGING-PAM調(diào)制脈沖熒光儀(Heinz Walz GmbH, Effeltrich, Germany),測量PSII實際光合效率Y(II)。每個樣品在測定之前, 先暗適應 10 min。設定 PAR 為 36 μmol/(m2·s), 開始測定。

Y(II): PSII實際光合效率, 即PSII實際量子產(chǎn)量,由公式 Y(II)= (F′m-F)/F′m計算得到。

所有操作都在黑暗環(huán)境中進行。

1.5 巖藻黃素的提取[25]

采用離心法收集微藻細胞, 培養(yǎng)液在4000 r/min條件下離心5 min, 棄上清, 藻細胞沉淀用新鮮培養(yǎng)液洗滌 2次再離心, 收集的藻細胞用液氮速凍后保存在–80℃冰箱中。

按照5 mL/g的比例向收集的藻細胞中加入預冷(0～10℃)的甲醇與丙酮混合液作為提取液(甲醇∶丙酮=1∶1(V/V)), 充分震蕩, 使藻細胞與提取液充分接觸, 之后放在冰水浴中黑暗浸提5 min。以3000 r/min離心5 min, 收集上清, 分別用0.22 μm孔徑的濾膜過濾, 然后直接進液相色譜系統(tǒng)分析。洗脫條件為:初始流動相為水(15%)∶甲醇(30%)∶乙腈(55%), 進行線性梯度至第15分鐘; 然后轉(zhuǎn)為流動相為水(0%)∶甲醇(15%)∶乙腈(85%)繼續(xù)洗脫至第17分鐘; 線性梯度轉(zhuǎn)為流動相為甲醇(15%)∶乙腈(35%)∶乙酸乙酯(50%)繼續(xù)洗脫至第30分鐘, 再進行線性梯度轉(zhuǎn)為流動相為甲醇(22%)∶乙腈(20%)∶乙酸乙酯(58%)洗脫直到洗脫結(jié)束。設置柱溫為 50°C, 流速為0.75 mL/min。

1.6 數(shù)據(jù)處理

采用單因素方差分析(ANOVA)進行數(shù)據(jù)差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 溫度對三角褐指藻生長及巖藻黃素含量的影響

不同溫度對三角褐指藻生長的影響如圖1所示。由圖1可知, 與正常培養(yǎng)溫度20℃相比, 25℃對三角褐指藻無明顯影響(P>0.05), 而在 30℃條件下三角褐指藻的生長受到明顯抑制(P<0.05)。

不同溫度對三角褐指藻光合活性的影響如圖 2所示。三角褐指藻在 25℃條件下的光合活性稍高于對照, 而 30℃條件下三角褐指藻的光合活性顯著降低(P<0.05)。

不同溫度對三角褐指藻巖藻黃素含量的影響如圖3所示。從圖中可看到在溫度為25℃條件下, 三角褐指藻的巖藻黃素含量明顯高于20℃的對照(P<0.05)。30℃條件下巖藻黃素含量則顯著降低(P<0.05)。

圖1 溫度對三角褐指藻生長的影響Fig.1 Effect of different temperatures on the growth of P.tricornutum

圖2 溫度對三角褐指藻光合活性的影響Fig.2 Effect of different temperatures on the PSII activity of P. tricornutum

圖3 溫度對三角褐指藻巖藻黃素含量的影響Fig.3 Effect of different temperatures on the fucoxanthin content of P. tricornutum

2.2 光照強度對三角褐指藻生長及巖藻黃素含量的影響

不同光照強度對三角褐指藻生長的影響如圖 4所示。由圖4可知, 與正常培養(yǎng)光照強度為4000 lx相比, 12800 lx和7200 lx的光照強度明顯促進三角褐指藻的生長(P<0.05), 而 7200 lx條件下三角褐指藻的細胞數(shù)高于12800 lx條件下的三角褐指藻。

圖4 光照強度對三角褐指藻生長的影響Fig.4 Effect of different intensities of illumination on the growth of P. tricornutum

不同光照強度對三角褐指藻光合活性的影響如圖5所示。與對照相比, 光照強度為12800 lx和7200 lx條件下, 三角褐指藻的光合活性均降低, 且12800 lx光照強度下光合活性降低更明顯(P<0.05)。

不同光照強度對三角褐指藻巖藻黃素含量的影響如圖6所示。與對照在4000 lx條件下相比, 12800 lx光照強度下, 三角褐指藻的巖藻黃素含量稍微提高,而7200 lx光照強度下巖藻黃素含量明顯提高(P<0.05)。

圖5 不同光照強度對三角褐指藻光合活性的影響Fig.5 Effect of different intensities of illumination on the PSII activity of P. tricornutum

圖6 不同光照強度對三角褐指藻巖藻黃素含量的影響Fig.6 Effect of different intensities of illumination on the fucoxanthin content of P. tricornutum

2.3 光質(zhì)對三角褐指藻生長及巖藻黃素含量的影響

不同光質(zhì)對三角褐指藻生長的影響如圖7所示。由圖7可知, 三種光質(zhì), 紅光條件下三角褐指藻生長良好, 而綠光和藍光條件下則顯著抑制三角褐指藻的生長(P<0.05)。

不同光質(zhì)對三角褐指藻光合活性的影響如圖 8所示。藍光抑制三角褐指藻的光合活性, 處理1 h后,其Y(II)值即降為0。綠光對三角褐指藻的光合活性也有抑制作用, 處理6 h后Y(II)開始顯著降低(P<0.05),到第48 小時降為0。紅光較另外兩種光而言, 并未抑制三角褐指藻的光合活性。

圖7 不同光質(zhì)對三角褐指藻生長的影響Fig.7 Effect of different light qualities on the growth of P.tricornutum

圖8 不同光質(zhì)對三角褐指藻光合活性的影響Fig.8 Effect of different light qualities on the PSII activity of P. tricornutum

不同光質(zhì)對三角褐指藻巖藻黃素含量的影響如圖9所示。與正常光的三角褐指藻相比, 藍光條件下三角褐指藻的巖藻黃素含量顯著降低(P<0.05), 綠光條件下處理1 d的三角褐指藻的巖藻黃素含量升高,而處理2 d和3 d后明顯降低(P<0.05), 紅光條件下處理 3 d后的三角褐指藻的巖藻黃素含量則顯著升高(P<0.05)。

圖9 不同光質(zhì)對三角褐指藻巖藻黃素含量的影響Fig.9 Effect of different light qualities on the fucoxanthin content of P. tricornutum

3 討論

巖藻黃素是一種重要的類胡蘿卜素, 因其具有豐富的生理功能, 近年來受到廣泛關注。Carreto和Catoggio研究發(fā)現(xiàn)[25], 三角褐指藻的巖藻黃素含量隨著三角褐指藻的生長而逐漸降低。此外, Kosakowska等[26]的研究表明, 三角褐指藻在缺鐵條件下巖藻黃素含量降低。

本研究考察了溫度條件對三角褐指藻的生長及巖藻黃素含量的影響。結(jié)果表明, 25℃既適于三角褐指藻的生長, 又提高單位細胞內(nèi)巖藻黃素的含量,這一現(xiàn)象表明, 由于三角褐指藻在 25℃時生長速度快, 因而捕獲的光量子多, 又因為巖藻黃素在光系統(tǒng)的捕光復合物中起重要作用[2], 故巖藻黃素含量隨捕獲光量子的增加而增加。

另外, 光照強度(12800、7200和4000 lx)對三角褐指藻生長及巖藻黃素含量的影響實驗結(jié)果表明,光照強度的升高促進了三角褐指藻的生長及巖藻黃素含量的升高, 可能由于光照強度的增大, 使得三角褐指藻可以捕獲更多的光量子, 從而使巖藻黃素含量升高。

三種光質(zhì)(紅光、綠光、藍光)對三角褐指藻的生長及巖藻黃素含量的影響實驗結(jié)果表明, 綠光和藍光處理3 d的三角褐指藻均死亡, 而紅光處理的三角褐指藻生長狀況良好。然而巖藻黃素的最大吸收峰在450 nm附近[27], 接近綠光和藍光波長附近, 而紅光波長為647～700 nm, 結(jié)果并不是三角褐指藻在綠光和藍光下生長良好, 卻是三角褐指藻在綠光和藍光的波長范圍內(nèi)死亡, 在紅光的波長范圍內(nèi)生長良好。這一現(xiàn)象產(chǎn)生的原因尚需進一步研究。

綜上所述, 25℃、7200 lx和紅光的培養(yǎng)條件是三角褐指藻生長和巖藻黃素積累的最適宜條件。

[1] Dembitsky V M, Maoka T. Allenic and cumulenic lipids[J]. Progress in Lipid Research, 2007, 46(6):328-375.

[2] Bertrand M. Carotenoid biosynthesis in diatoms[J].Photosynthesis Research, 2010, 106(1-2): 89-102.

[3] Beppu F, Niwano Y, Tsukui T, et al. Single and repeated oral does toxicity study of fucoxanthin (FX), a marine carotenoid, in mice[J]. Journal of Toxicological Sciences, 2009, 34(5): 501-510.

[4] Nomura T, Kikuchi M, Kubodera A, et al. Protondonative antioxidant activity of fucoxanthin with 1,1-Diphenyl-2-Picrylhydrazyl (DPPH)[J]. IUBMB Life,1997, 42(2): 361-370.

[5] Yan X, Chuda Y, Suzuki M, et al. Fucoxanthin as the major antioxidant in Hijikia fusiformis, a common edible seaweed[J]. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry, 1999, 63(3): 605-607.

[6] Iwasaki S, Widjaja-Adhi M A K, Koide A, et al. In vivo antioxidant activity of fucoxanthin on obese/diabetes KK-A y mice[J]. Food and Nutrition, 2012, 3: 1491-1499.

[7] Zaragozá M, López D, Sáiz M P, et al. Toxicity and antioxidant activity in vitro and in vivo of two Fucus vesiculosus extracts[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2008, 56(17): 7773-7780.

[8] Kim K N, Heo S J, Yoon W J, et al. Fucoxanthin inhibits the inflammatory response by suppressing the activation of NF-κB and MAPKs in lipopolysaccharideinduced RAW 264.7 macrophages[J]. EuropeanJournal of Pharmacology, 2010, 649(1): 369-375.

[9] Khan M N A, Lee M C, Kang J Y, et al. Effects of the brown seaweed Undaria pinnatifida on erythematous inflammation assessed using digital photo analysis[J].Phytotherapy Research, 2008, 22(5): 634-639.

[10] Nishino H, Tsushima M, Matsuno T, et al. Antineoplastic effect of halocynthiaxanthin, a metabolite of fucoxanthin[J]. Anti-Cancer Drugs, 1992, 3(5): 493-498.

[11] Yu R X, Hu X M, Xu S Q, et al. Effects of fucoxanthin on proliferation and apoptosis in human gastric adenocarcinoma MGC-803 cells via JAK/STAT signal pathway[J]. European Journal of Pharmacology,2011, 657(1): 10-19.

[12] Heo S J, Jeon Y J. Protective effect of fucoxanthin isolated from Sargassum siliquastrum on UV-B induced cell damage[J]. Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology, 2009, 95(2): 101-107.

[13] Sugawara T, Matsubara K, Akagi R, et al. Antiangiogenic activity of brown algae fucoxanthin and its deacetylated product, fucoxanthinol[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2006, 54(26): 9805-9810.

[14] Ikeda K, Kitamura A, Machida H, et al. Effect of Undaria pinnatifida (Wakame) on the development of cerebrovascular diseases in stroke-prone spontaneously hypertensive rats[J]. Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology, 2003, 30(1-2): 44-48.

[15] Das S K, Ren R, Hashimoto T, et al. Fucoxanthin induces apoptosis in osteoclast-like cells differentiated from RAW264.7 cells[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2010, 58(10): 6090-6095.

[16] Maeda H, Hosokawa M, Sashima T, et al. Anti-obesity and anti-diabetic effects of fucoxanthin on diet-induced obesity conditions in a murine model[J]. Molecular Medicine Reports, 2009, 2(6): 897-902.

[17] Maeda H, Hosokawa M, Sashima T, et al. Dietary combination of fucoxanthin and fish oil attenuates the weight gain of white adipose tissue and decreases blood glucose in obese/diabetic KK-Aymice[J]. J. of Agricultural and Food Chemistry, 2007, 55(19): 7701-7706.

[18] Hosokawa M, Miyashita T, Nishikawa S, et al.Fucoxanthin regulates adipocytokine mRNA expression in white adipose tissue of diabetic/obese KK-Aymice[J]. Archives of Biochemistry and Biophysics,2010, 504(1): 17-25.

[19] Woo M N, Jeon S M, Kim H J, et al. Fucoxanthin supplementation improves plasma and hepatic lipid metabolism and blood glucose concentration in high-fat fed C57BL/6N mice[J]. Chemico-Biological Interactions,2010, 186(3): 316-322.

[20] Park H, Lee M, Park Y, et al. Beneficial effects of Undaria pinnatifida ethanol extract on diet-inducedinsulin resistance in C57BL/6J mice[J]. Food and Chemical Toxicology, 2011, 49(4): 727-733.

[21] Haugan J A, Aakermann T, Liaaen J S. Isolation of fucoxanthin and peridinin[J]. Methods in Enzymology,1992, 213: 231-245.

[22] Allen E, Nelson E. On the artificial culture of marine plankton organisms[J]. Journal of the Marine Biological Association of the United Kingdom (New Series), 1910, 8(5): 421-474.

[23] Guillard R R. Culture of phytoplankton for feeding marine invertebrates[M] In Culture of Marine Invertebrate Animals, Springer US, 1975: 29-60.

[24] Lin A, Wang C, Qiao H, et al. Study on the photosynthetic performances of Enteromorpha prolifera collected from the surface and bottom of the sea of Qingdao sea area[J]. Chinese Science Bulletin, 2009,54(3): 399-404.

[25] Carreto J I, Catoggio J A. Variations in pigment contents of the diatom Phaeodactylum tricornutum during growth [J]. Marine Biology, 1976, 36(2):105-112.

[26] Kosakowska A, Lewandowska J, Stoń J, et al.Qualitative and quantitative composition of pigments in Phaeodactylum tricornutum (Bacillariophyceae)stressed by iron[J]. BioMetals, 2004, 17(1): 45-52.

[27] 王廣策, 汪文俊, 王發(fā)左, 等. 一種從海藻中分離巖藻黃素的方法: 中國, CN200410020727[P]. 2005-12-14.