孫宗紅 , 劉志剛 , 歐燕燕 , 朱曉聞 劉 超 , 劉錦上

(1. 廣東海洋大學(xué) 水產(chǎn)學(xué)院, 廣東 湛江 524025; 2. 廣東高校熱帶海產(chǎn)無(wú)脊椎動(dòng)物養(yǎng)殖工程研究中心, 廣東 湛江 524025; 3. 湛江銀浪海洋生物技術(shù)有限公司, 廣東 湛江 524025)

擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性(Amplified Fragment Length Polymorhism, AFLP)是1993年由荷蘭Keygene公司科學(xué)家發(fā)明的一種 DNA分子標(biāo)記技術(shù)[1], 該技術(shù)既繼承了RFLP的穩(wěn)定性, 又具有PCR反應(yīng)快速、靈敏的特點(diǎn), 同時(shí)克服了RFLP和RAPD的缺點(diǎn), 且擴(kuò)增的帶紋多(50～100條)。AFLP的擴(kuò)增片段與基因組的單一位置相對(duì)應(yīng), 且該標(biāo)記為孟德?tīng)柺竭z傳, 可以作為聯(lián)系遺傳圖譜和物理圖譜的一個(gè)橋梁。

貝類殼色作為一個(gè)可遺傳的質(zhì)量性狀, 已經(jīng)被相關(guān)學(xué)者[2]成功應(yīng)用到實(shí)際工作中。華貴櫛孔扇貝是我國(guó)南方海域重要經(jīng)濟(jì)貝類, 近年來(lái), 一些學(xué)者[3-7]對(duì)其生理和育種進(jìn)行了大量研究。但相對(duì)于其他經(jīng)濟(jì)貝類如馬氏珠母貝來(lái)講, 采用分子標(biāo)記來(lái)對(duì)華貴櫛孔扇貝輔助育種的研究則非常少[8-9], 而對(duì)其不同殼色選育系 AFLP分析的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。本文應(yīng)用 AFLP標(biāo)記技術(shù)對(duì)華貴櫛孔扇貝四種殼色家系進(jìn)行了遺傳多樣性分析, 旨在為該貝殼色的定向選育提供遺傳理論基礎(chǔ), 加快從家系到殼色品系的建立, 并期望以此為基礎(chǔ), 篩選出與華貴櫛孔扇貝顏色性狀連鎖的基因, 為華貴櫛孔扇貝遺傳圖譜的構(gòu)建提供參考。

1 材料方法

1.1 材料

1.1.1 樣品采集

實(shí)驗(yàn)材料為本實(shí)驗(yàn)室選育的紫頂棗褐殼色(PBB)、棗褐殼色(BB)、紫白殼色(PW)和橘黃殼色(O)4種殼色選育系F1代(見(jiàn)圖1)。隨機(jī)挑選以上4種殼色華貴櫛孔扇貝選育系F1代個(gè)體各30只, 清洗干凈, 取少量閉殼肌(約 50 mg)用于基因組 DNA的提取, 剩余部分閉殼肌分裝浸泡于無(wú)水乙醇中, –80℃保存。

1.1.2 引物及主要藥品

本試驗(yàn)所用引物(表1)均由上海生工生物工程有限公司合成; Taq 酶、T4 DNA連接酶、EcoRⅠ內(nèi)切酶、MseⅠ內(nèi)切酶、DNA Maker DL2000、100 bp等均購(gòu)自Takara公司; DNA提取試劑盒購(gòu)自北京艾德萊生物科技有限公司。

1.2 AFLP實(shí)驗(yàn)步驟

1.2.1 基因組DNA的提取、酶切及連接反應(yīng)

本實(shí)驗(yàn)使用DNA提取試劑盒提取基因組DNA,1%的瓊脂糖凝膠檢測(cè), 用 Eppendorf核酸蛋白測(cè)定儀測(cè)定其純度, 將DNA提取物稀釋至300 ng/μL左右, 4℃保存。采用EcoRⅠ和MseⅠ雙酶切方法酶切基因組 DNA, 37℃條件下EcoR I酶切 3 h, 65℃30 min終止反應(yīng), 將酶切產(chǎn)物65℃MseⅠ酶切3 h, 80℃30 min終止反應(yīng)后馬上進(jìn)行連接反應(yīng), 16℃過(guò)夜, 65℃處理10 min終止反應(yīng)。

圖1 四種不同殼色華貴櫛孔扇貝Fig. 1 Four kinds of Chlamys nobilis with different shell colors

表1 實(shí)驗(yàn)所使用的引物Tab. 1 All the primers used in the experiment

1.2.2 預(yù)擴(kuò)增及選擇性擴(kuò)增反應(yīng)

將連接產(chǎn)物進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增反應(yīng), 94℃預(yù)變性2 min;94℃ 30 s, 56℃ 30 s, 72℃ 2 min, 共 23 個(gè)循環(huán); 60℃延伸30 min, 產(chǎn)物4℃保存, 將產(chǎn)物稀釋20倍進(jìn)行選擇性擴(kuò)增反應(yīng), 選擇擴(kuò)增反應(yīng)體系: 1.5μL10×PCR Buffer(含 Mg2+), 1.2 μL dNTPs(2.5 mmol/L), 1.0 μLEcoRⅠ引物 E (5 μmol/L), 1.0 μL MseⅠ引物 M(5 μmol/L), 0.1 μL Taq 酶(5 U/μL), 1.0 μL 預(yù)擴(kuò)增稀釋產(chǎn)物, 9.2 μL dd H2O。94℃預(yù)變性 2 min; 94℃ 20 s,66℃ 30 s, 72℃ 2 min, 然后每個(gè)循環(huán)降低1℃, 經(jīng)10個(gè)循環(huán)后退火溫度降低到 56℃, 再進(jìn)行 20個(gè)循環(huán), 條件為94℃ 20 s, 56℃ 30 s, 72℃ 2 min; 60℃延伸30 min。

1.2.3 變性聚丙烯酰胺凝膠電泳

選擇性擴(kuò)增產(chǎn)物用 5%的聚丙稀烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳分離、銀染, 然后統(tǒng)計(jì)擴(kuò)增位點(diǎn)數(shù)。

1.3 數(shù)據(jù)分析處理

將圖譜條帶按有記為“1”, 無(wú)記為“0”, 轉(zhuǎn)換成 0, 1矩陣, 本實(shí)驗(yàn)按照顯隱性將擴(kuò)增位點(diǎn)上有帶的視為顯性基因型, 無(wú)帶的視為隱性純合基因型。利用Popgene1.31軟件[10]計(jì)算多態(tài)位點(diǎn)比例、Shannon多樣性指數(shù)、群體間遺傳分化系數(shù)和遺傳距離, 用MEGA4.1作圖, UPGMA法進(jìn)行聚類分析, 用SPSS17.0軟件, ANOVA法進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果

2.1 AFLP擴(kuò)增結(jié)果

本實(shí)驗(yàn)擴(kuò)增片段主要集中在150～1 000 bp之間。根據(jù)引物的篩選條件在64個(gè)引物組合中選出擴(kuò)增條帶數(shù)較多且清晰的10對(duì)AFLP引物組合, 在100～1 100 bp范圍共擴(kuò)增出414個(gè)位點(diǎn), 四種殼色的華貴櫛孔扇貝均在62個(gè)位點(diǎn)上出現(xiàn)擴(kuò)增帶, 多態(tài)位點(diǎn)數(shù)為 352個(gè), 引物的多態(tài)性比例分布為79.31%～89.47%,平均為 85.02%, 多態(tài)信息含量較高。平均每個(gè)引物組合得到41個(gè)擴(kuò)增位點(diǎn), 但不同引物組合得到的擴(kuò)增位點(diǎn)總數(shù)也存在很大差異, 比如 E3M5組合只得到 27個(gè)擴(kuò)增位點(diǎn)(圖 2、表 2), 而 E1M8得到 62個(gè)擴(kuò)增位點(diǎn)(表2)。

表2 實(shí)驗(yàn)選用的10對(duì)AFLP引物及擴(kuò)增結(jié)果Tab. 2 The amplification results of selected ten pairs AFLP primers

圖2 引物E3M5在4種殼色華貴櫛孔扇貝群體中的選擇性擴(kuò)增結(jié)果Fig. 2 The selective amplification results with primer E3M5 in 4 populations of the Chlamys nobilis

2.2 四種殼色華貴櫛孔扇貝群體內(nèi)遺傳多樣性

表3顯示棗褐群體的多態(tài)性最大為86.04%, 橘黃群體的多態(tài)性最小為67.35%; 10對(duì)引物共擴(kuò)增出414個(gè)位點(diǎn), 而每個(gè)群體的總擴(kuò)增條帶數(shù)都小于414,與總條帶數(shù)相比, 橘黃群體相差最多(71個(gè)), 而棗褐群最少(27個(gè))。四個(gè)群體的Nei’s(H)指數(shù)在0.307 1～0.349 4之間, 其中, 棗褐群體的遺傳變異最大, 其次是紫白、橘黃, 最小是紫頂棗褐群體。有效等位基因數(shù)(Ne)在1.519 1～1.616 6。Shannon(I)指數(shù)分布在0.452 5～0.513 9之間。四個(gè)群體的平均等位基因數(shù)和Shannon(I)與多態(tài)位點(diǎn)比例具有相同的變化趨勢(shì), 均為棗褐群體>紫白群體>紫頂棗褐群體>橘黃群體;平均有效等位基因和Nei’s基因多樣性則是棗褐群體>紫白群體>橘黃群體>紫頂棗褐群體。遺傳參數(shù)顯示,Ht為0.395 4;Hs為0.326 6,Gst為 0.173 9,Nm為2.374 4(表 4), 說(shuō)明群體間有一定分化, 不同群體間存在遺傳差異, 各種群間存在一定的基因流動(dòng)。

2.3 四種殼色華貴櫛孔扇貝群體間的遺傳多樣性分析

2.3.1 四個(gè)群體間的遺傳距離

四個(gè)群體間 Nei’s遺傳距離(表 5)。由表可知,華貴櫛孔扇貝四個(gè)群體間之間遺傳距離(D)的變異范圍在0.119 4～0.172 0之間。遺傳距離最遠(yuǎn)的是紫頂棗褐群體和紫白群體, 最近的是棗褐群體和紫白群體。

表3 四種不同殼色華貴櫛孔扇貝群體的遺傳結(jié)構(gòu)Tab. 3 Genetic structures of 4 populations of Chlamys nobilis with different shell colors

表4 四個(gè)群體內(nèi)的基因多樣性和基因流Tab. 4 Gene diversity and gene flow of four populations

利用UPGMA法構(gòu)建4個(gè)群體間的遺傳關(guān)系聚類圖(圖 3)。聚類系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)均分為兩個(gè)大支, 其中紫頂棗褐群體聚為一支, 其他三個(gè)群體聚為一支,以棗褐和紫白群體遺傳關(guān)系最近, 紫頂棗褐群體與其他三個(gè)群體遺傳關(guān)系最遠(yuǎn)。親緣關(guān)系由近及遠(yuǎn)順次為紫白殼色(PW)、棗褐殼色(BB)、橘黃殼色(O)和紫頂棗褐殼色(PBB)。

2.3.2 群體遺傳多樣性來(lái)源的分子方差(AMOVA)分析

應(yīng)用分子方差分析(AMOVA)方法對(duì)4個(gè)群體的遺傳多樣性來(lái)源進(jìn)行分析(表6)。由表可知群體內(nèi)的變異占80.16%, 群體間的變異占19.84%。Nei’s遺傳多樣性分析方法與分子方差分析(AMOVA)得出的結(jié)論一致, 群體內(nèi)遺傳變異大于群體間。

表5 華貴櫛孔扇貝群體間的遺傳距離及兩兩種群的遺傳分化指數(shù)Tab. 5 Nei’s genetic distance and pairwise Fst among the stocks of Chlamys nobilis

圖3 四種不同殼色華貴櫛孔扇貝群體間的聚類關(guān)系Fig. 3 Phylogenesis of four kinds of Chlamys nobilis with different shell colors

表6 四個(gè)群體的AMOVA分析Tab. 6 AMOVA analysis of four populations

3 討論

3.1 四種殼色華貴櫛孔扇貝種群內(nèi)遺傳多樣性分析

薛欽昭等[11]的研究表明海洋貝類具有較高的遺傳變異, 多態(tài)位點(diǎn)比例平均為 46%, 脊椎動(dòng)物多態(tài)性平均值為24.7%, 且AFLP分子標(biāo)記很適用于對(duì)親緣關(guān)系及遺傳上區(qū)別不大的種類的檢測(cè)。本實(shí)驗(yàn)就是通過(guò) AFLP檢測(cè)分析出華貴櫛孔扇貝物種水平上的多態(tài)位點(diǎn)比例達(dá)85.02%(表2、表3), 群體內(nèi)總體的遺傳分化Ht為0.3954(表4), 說(shuō)明了群體多態(tài)性較高, 群體間存在一定的遺傳分化。從歐燕燕等[12]的研究可知, 橘黃殼色群體本身較多, 同時(shí)因市場(chǎng)需求及其經(jīng)濟(jì)價(jià)值較高, 人們普遍留選橘黃色個(gè)體做繁殖親本, 這可能是導(dǎo)致其遺傳多樣性低于其他群體的原因。而大量研究[13-15]也證實(shí), 選育群體的遺傳多樣性會(huì)低于自然群體或野生群體。同時(shí)也有研究[15-16]證實(shí), 只要保證親本數(shù)量, 選育群體仍可保持較高的遺傳多樣性。本實(shí)驗(yàn)的樣本是來(lái)自實(shí)驗(yàn)室培育的4種殼色的華貴櫛孔扇貝選育系F1代, 通過(guò)遺傳多樣性分析表明了群體內(nèi)的遺傳多樣性是較為豐富的,均具有較高的遺傳多樣性。

華貴櫛孔扇貝的遺傳多樣性應(yīng)該是怎樣的水平才算合理, 迄今沒(méi)有系統(tǒng)的研究, 也沒(méi)有參考的標(biāo)準(zhǔn), 本研究的數(shù)據(jù)可以作為衡量華貴櫛孔扇貝各群體遺傳變異的一個(gè)相對(duì)指標(biāo)。

3.2 四種殼色華貴櫛孔扇貝種群間遺傳多樣性分析

在分子生物學(xué)研究方面, 張濤[17]用5個(gè)SSR多態(tài)性位點(diǎn)對(duì) 3種殼色華貴櫛孔扇貝分析發(fā)現(xiàn)各殼色間具有較高的遺傳多態(tài)性, 存在一定分化。Yuan等[18]對(duì)華貴櫛孔扇貝的養(yǎng)殖和野生群體的線粒體 16S rRNA和COI基因片段序列進(jìn)行了研究, 表明了野生群體的基因差異水平高于養(yǎng)殖群體; Yuan等[9]用373個(gè)AFLP和9個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記, 通過(guò)擬測(cè)交策略分別構(gòu)建了華貴櫛孔扇貝雌性和雄性的遺傳連鎖圖譜。

劉廣緒[19]對(duì)櫛孔扇貝、華貴櫛孔扇貝及其二者的種間雜交子代、種內(nèi)近交子代進(jìn)行了遺傳關(guān)系的分析, 發(fā)現(xiàn)雜交子代群體具有較高的遺傳多樣性,且兩種雜交子代間也具有巨大的差異。鄧岳文等[20]研究發(fā)現(xiàn)華貴櫛孔扇貝桔黃殼色群體的各經(jīng)濟(jì)性狀均值均顯著大于紫頂棗褐殼色群體。

本研究在 4種殼色華貴櫛孔扇貝群體中, 用 10對(duì)選擇性擴(kuò)增引物共擴(kuò)增得到 414個(gè)位點(diǎn), 其中多態(tài)性位點(diǎn) 352個(gè), 多態(tài)性比例為 85.02%, 通過(guò)計(jì)算分析, 其群體間遺傳分化系數(shù)(Gst)為 0.173 9, 基因流動(dòng)系數(shù)(Nm)2.374 4親緣關(guān)系依次為紫白殼色>棗褐殼色>橘黃殼色>紫頂棗褐殼色, 具有較高的遺傳多樣性, 表明了 AFLP技術(shù)適合用于華貴櫛孔扇貝種群的遺傳多樣性研究。盧建峰等[21]對(duì)大口黑鱸選育群體遺傳多樣性進(jìn)行了AFLP分析, 92.48%的遺傳變異來(lái)自于群體內(nèi), 表明了大口黑鱸在遺傳上的穩(wěn)定性, 其群體具有一定選育潛力。而本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用分子方差分析方法對(duì) 4個(gè)群體的遺傳多樣性來(lái)源進(jìn)行分析, 結(jié)果顯示群體內(nèi)遺傳變異占 80.16%,說(shuō)明各殼色群體具有一定選育潛力, 可繼續(xù)進(jìn)行人工選育。

3.3 殼色可作為貝類育種標(biāo)記

在海洋貝類殼色的分子研究方面, 陳靜, 朱曉聞, 代悅等[22-24]各自對(duì)馬氏珠母貝 4種殼色的不同選育系進(jìn)行了研究, 為其定向選育奠定了理論基礎(chǔ)。程鵬[25]研究表明了華貴櫛孔扇貝群體內(nèi)遺傳結(jié)構(gòu)的差異, 造成了不同殼色家系在幼蟲階段生長(zhǎng)性狀上的不同。上述研究證實(shí)了在海洋貝類的選育中, 利用殼色作為依據(jù)可行, 且在實(shí)際應(yīng)用中也得到了驗(yàn)證[2]。陳金濤[26]研究表明了華貴櫛孔扇貝不同殼色子代在生長(zhǎng)、存活率、出柱率(AP)及性狀參數(shù)間的相關(guān)性方面存在顯著差異。本實(shí)驗(yàn)也是以華貴櫛孔扇貝的 4種殼色作為育種標(biāo)記, 從分子水平上闡明了這 4種殼色選育系 F1代間存在遺傳差異, 群體內(nèi)的遺傳多樣性較高, 群體間存在一定分化, 可繼續(xù)進(jìn)行選育,為其定向選育提供了理論基礎(chǔ)。

[1] 田舜, 李韜. AFLP技術(shù)操作流程的變革及其衍生技術(shù)[J]. 揚(yáng)州大學(xué)學(xué)報(bào), 2006(4): 62-65.

[2] 張躍環(huán), 閆喜武, 張澎, 等.貝類殼色多態(tài)的研究概況及展望[J]. 水產(chǎn)科學(xué), 2008, 27(12): 680-683.

[3] 栗志民, 劉志剛, 謝麗. 體重和溫度對(duì)華貴櫛孔扇貝(Chlamys nobilis)耗氧率和排氨率的影響[J]. 海洋與湖沼, 2010, 41(1): 99-105.

[4] 鄭懷平, 孫澤偉, 張濤, 等. 華貴櫛孔扇貝 1齡貝數(shù)量性狀的相關(guān)性及通徑分析[J]. 中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào), 2009,25(20): 322-326.

[5] 鄧岳文, 王慶恒, 黃榮蓮, 等. 華貴櫛孔扇貝基礎(chǔ)群體內(nèi)大小分化個(gè)體的淀粉酶和纖維素酶活力比較[J].海洋學(xué)研究, 2008, 26(2): 37-40.

[6] 劉志剛, 朱曉聞, 王輝, 等.華貴櫛孔扇貝殼色遺傳規(guī)律的研究[J].海洋與湖沼, 2012, 43 (1): 62-66.

[7] 劉志剛, 王輝, 呂文剛, 等. 華貴櫛孔扇貝殼色與閉殼肌顏色的遺傳規(guī)律[J].海洋與湖沼, 2012, 43(2):237-243.

[8] 張濤, 鄭懷平, 孫澤偉, 等. 華貴櫛孔扇貝不同殼色后代早期發(fā)育階段性狀比較[J]. 中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào), 2009,25(23): 478-484.

[9] Yuan T, He M, Huang L, et al. Genetic linkage maps of the noble scallop chlamys nobilis reeve based on aflp and microsatellite markers[J]. Journal of Shellfish Research, 2010, 29(1): 55-62.

[10] 王學(xué)穎, 高遠(yuǎn)鎮(zhèn), 杜曉東, 等.馬氏珠母貝金黃殼色系 F3 和基礎(chǔ)群體遺傳結(jié)構(gòu)比較[J].海洋通報(bào), 2012,31(3): 324-328.

[11] 薛欽昭, Stiles Sheila, 張福, 等. 海灣扇貝不同種群在磷酸葡萄糖變位酶基因位點(diǎn)的遺傳結(jié)構(gòu)與性狀[J].海洋與湖沼, 1993, 30(4): 80-83.

[12] 歐燕燕, 劉志剛, 劉錦上. 流沙灣養(yǎng)殖華貴櫛孔扇貝體色多態(tài)性研究[J].南方水產(chǎn)科學(xué), 2012, 8(5): 15-24.

[13] 張國(guó)范, 張福綏. 貝類遺傳多樣性及其永續(xù)利用(I)[J]. 海洋科學(xué), 1993(5): 17-21.

[14] 郭俊, 鄧岳文, 杜曉東, 等. 馬氏珠母貝黃殼色選育系G_1遺傳結(jié)構(gòu)的ISSR分析[J]. 廣東海洋大學(xué)學(xué)報(bào),2009, 29(1): 87-90.

[15] 趙曉霞, 鄧岳文, 杜曉東, 等. 利用微衛(wèi)星標(biāo)記分析馬氏珠母貝 4個(gè)養(yǎng)殖群體遺傳結(jié)構(gòu)[J]. 基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué), 2010, 29(5): 879-884.

[16] Yu H, Li Q. Genetic variation of wild and hatchery populations of the pacific oysterCrassostrea gigasassessed by microsatellite markers.journal of genetics and genomics, 2007, 34(12): 1114-1122.

[17] 張濤. 華貴櫛孔扇貝養(yǎng)殖群體數(shù)量性狀及殼色遺傳的初步研究[D].汕頭: 汕頭大學(xué), 2010.

[18] Yuan T, He M, Huang L. Intraspecific genetic variation in mitochondrial 16S rRNA and COI genes in domestic and wild populations of Huaguizhikong scallop Chlamys nobilis Reeve[J]. Aquaculture, 2009, 289(1-2): 19-25.

[19] 劉廣緒. 櫛孔扇貝、華貴櫛孔扇貝及其種間雜交子代、種內(nèi)近交子代的ISSR分析[D].青島: 中國(guó)海洋大學(xué), 2004.

[20] 鄧岳文, 張凌飛, 杜曉東, 等. 華貴櫛孔扇貝兩種殼色群體生長(zhǎng)和消化酶活力比較[J]. 廣東海洋大學(xué)學(xué)報(bào), 2008, 28(3): 20-23.

[21] 盧建峰, 白俊杰, 李勝杰, 等. 大口黑鱸選育群體遺傳多樣性的AFLP分析[J]. 淡水漁業(yè), 2010, 40(3): 3-7.

[22] 陳靜, 劉志剛, 孫小真, 等. 馬氏珠母貝 4種殼色選育系 F_3的生長(zhǎng)特性和遺傳多樣性比較[J]. 上海海洋大學(xué)學(xué)報(bào), 2010, 19(5): 588-595.

[23] 朱曉聞, 劉志剛, 王輝, 等. 馬氏珠母貝四種殼色選育系 F5的生長(zhǎng)及遺傳多樣性[J].海洋與湖沼, 2012,43(1): 160-165.

[24] 代悅, 喻子牛, 趙曉霞, 等. 馬氏珠母貝 4個(gè)殼色選育系F_1遺傳結(jié)構(gòu)的AFLP分析[J]. 基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué), 2010, 29(2): 252-258.

[25] 程鵬, 楊愛(ài)國(guó), 周麗青, 等. 不同殼色蝦夷扇貝家系F_1幼蟲生長(zhǎng)及遺傳結(jié)構(gòu)的比較分析[J]. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué), 2010, 17(5): 960-968.

[26] 陳金濤. 華貴櫛孔扇貝不同殼色選育系的建立及其生長(zhǎng)發(fā)育研究[D]. 湛江: 廣東海洋大學(xué), 2011.