于延輝魯衍強李 瑛，＊湯 萍宋錦霞馮鐵利楊 琦

1.吉林省延邊婦幼保健院（延吉，133001）；2.上海靶向分子醫(yī)學(xué)研究所；3.吉林省延邊州衛(wèi)生局；4中國疾病預(yù)防控制中心婦幼保健中心

5，10-亞甲基四氫葉酸還原酶（MTHFR）和甲硫氨酸合成酶還原酶（MTRR）是參與體內(nèi)葉酸代謝的關(guān)鍵酶，MTHFR和MTRR具有多種基因多態(tài)性，目前國內(nèi)外研究最多的是 MTHFR C677T、A1298C和MTRR A66G。已有研究表明這些基因多態(tài)性影響著其編碼酶的活性、體內(nèi)葉酸以及同型半胱氨酸水平［1-2］。此外，國內(nèi)外研究結(jié)果顯示，MTHFR的多態(tài)性位點C677T和A1298C以及MTRR的多態(tài)性位點A66G在不同國家、同一國家不同地區(qū)以及不同民族間的分布情況存在差異［3-5］。我國是人口大國，也是出生缺陷高發(fā)國家。出生缺陷的發(fā)生與母體內(nèi)同型半胱氨酸水平的升高密切相關(guān)，是神經(jīng)管畸形［6］、復(fù)發(fā)性流產(chǎn)［7］、妊娠期高血壓［8］等疾病的危險因素，嚴(yán)重影響母嬰健康。漢族人群是我國的主要人群，本研究針對延邊州漢族女性開展分子流行病學(xué)調(diào)查，旨在闡明本地區(qū)漢族人群的遺傳特征，為個體化的孕期保健提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2013年4月～2014年12月到延邊婦幼保健院進行孕前與孕期檢查的漢族女性，排除籍貫非本州者，入組對象共2620例，年齡（28.50±4.25）歲。簽署知情同意書后采集口腔黏膜細胞，利用硅膠吸附方法提取樣本的基因組DNA。

1.2 基因分型

采用熒光定量PCR技術(shù)，檢測MTHFR C677T、A1298C和MTRR A66G的基因多態(tài)性。相關(guān)儀器、試劑均購自美國ABI公司。每個反應(yīng)體系10μl：1μl DNA模板（20ng／μl），5μlTaqman Universal Master Mix，0.5μlTaqman-MGB探針，3.5μl去離子水。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性10min，92℃變性15s，60℃延伸1min，20個循環(huán)；89℃變性15s，60℃延伸90s，30個循環(huán)。反應(yīng)完成后，在ABI7900型熒光定量PCR儀上讀取樣品孔中的終點熒光，利用分析軟件確定各個樣本的基因分型結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS19.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，應(yīng)用HaploView4.2軟件進行單核苷酸多態(tài)性（SNPs）的Hardy-Weinberg平衡、LD水平和單倍型結(jié)構(gòu)分析。計數(shù)資料采用率表示，對基因型及等位基因頻率進行χ2檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Hardy-Weinberg平衡分析

MTHFR C677T、A1298C和 MTRR A66G 基因多態(tài)性，對3個位點進行H-W平衡檢驗，檢驗結(jié)果分別為P＝0.09（C677T）、P＝0.08（A1298C）、P＝0.88（A66G），符合 Hardy-Weinberg遺傳平衡，說明樣本具有本區(qū)域群體代表性。

2.2 MTHFR、MTRR基因型和等位基因頻率在不同地區(qū)漢族女性中的比較

延邊州漢族女性的 MTHFR C677T和A1287C，MTRR A66G位點的基因型和等位基因頻率分布具有地域性特點，詳見表1、表2。

2.3 MTHFR C6.7 T和A12.8 C兩位點連鎖情況及單倍型分析

MTHFR C677T和A1298C兩位點組合情況見表3。單倍型分析表明，4種組合頻率分別為677T-1298A（55.0%）、677C-1298A（30.2%）、677C-1298C（14.7%）、677T-1298C（0.1%），兩位點存在高度連鎖不平衡現(xiàn)象（D’＝0.99）。

表1 本研究與不同地區(qū)漢族女性MTHFR、MTRR基因型頻數(shù)和頻率比較［n（%）］

表2 本研究與不同地區(qū)漢族女性MTHFR、MTRR等位基因頻數(shù)和頻率分布比較［n（%）］

表3 MTHFR C677T和A1298C連鎖型分布［n（%）］

3 討論

MTHFR及MTRR在同型半胱氨酸向蛋氨酸的轉(zhuǎn)化及DNA的合成過程中發(fā)揮重要作用。MTHFR基因定位于1p36.3，迄今為止已發(fā)現(xiàn)近20種SNPs。其中最常見的是MTHFR 677位點C→T的點突變。而MTRR基因定位于5p15.2～15.3，MTRR是蛋氨酸合成酶的輔助因子，催化甲基鈷胺再生［20］，MTRR最常見的SNP為66A→G，其突變結(jié)果是異亮氨酸取代蛋氨酸。

據(jù)報道，在葉酸攝入量無顯著性差異的情況下，攜帶677TT基因型的個體與TC或CC型個體相比，血清葉酸水平低20% 左右［21］。隨著人們生活水平的提高，環(huán)境和營養(yǎng)因素都得到重視，如何從遺傳角度篩查出疾病易感人群，并在生活行為、飲食營養(yǎng)等方面加以強化，從而達到降低出生缺陷及孕產(chǎn)婦疾病的目的就顯得尤為重要。

2007年延邊州出生缺陷監(jiān)測結(jié)果顯示，位居前5位分別是先心病、總唇裂、多指趾、腦積水和小耳［22］。本研究通過與其他地區(qū)大樣本數(shù)據(jù)進行對比分析，發(fā)現(xiàn)延邊州漢族女性MTHFR C677T、A1298C和MTRR A66G位點多態(tài)性與其他地區(qū)漢族女性的頻率存在差異。延邊州漢族女性MTHFR C677T位點的基因型和等位基因頻率與烏魯木齊、廊坊、銀川、濟源、淄博、鎮(zhèn)江、湘潭、德陽、惠州、南寧、瓊海等地差異有統(tǒng)計學(xué)意義。T等位基因頻率呈現(xiàn)北方高南方低的趨勢。延邊州漢族女性MTHFR A1298C位點的基因型和等位基因頻率與濟源、淄博、鎮(zhèn)江、湘潭、德陽、惠州、南寧、瓊海等地差異有統(tǒng)計學(xué)意義。C等位基因頻率呈現(xiàn)北方低南方高的趨勢。延邊州漢族女性MTRR A66G位點的基因型和等位基因頻率與德陽、瓊海等地差異有統(tǒng)計學(xué)意義，與烏魯木齊、廊坊、銀川、濟源、淄博、鎮(zhèn)江、湘潭、惠州、南寧等地差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義。G等位基因頻率在各地區(qū)的分布暫無明顯規(guī)律。而有研究表明，延邊州朝鮮族女性MTHFR 677CC、CT、TT的分布比例分別為31.0%、50.2%、18.8%，其中TT型的比例與當(dāng)?shù)貪h族女性分布差異有統(tǒng)計學(xué)意義［23］。

分析這種差異可能與人群對多種疾病的群體易感性有關(guān)。MTHFR 677T等位基因頻率呈現(xiàn)北方高南方低的趨勢，與我國出生缺陷發(fā)病率北方高南方低的趨勢一致。C677T和A1298C存在協(xié)同作用，雙雜合子個體與僅含C677T突變的個體相比，同型半胱氨酸濃度顯著升高。本文研究顯示雙雜合子占15.4%，與Benrahma等［24］報道的結(jié)果一致。此外，單倍型分析的結(jié)果顯示，延邊州漢族女性MTHFR C677T和A1298C兩位點組合單倍型以677T-1298A居多，張婷等［25］報道的貴州布依族、侗族和苗族的單倍型分析結(jié)果顯示均以677C-1298A類型居多。該差異或可體現(xiàn)不同民族間的遺傳情況存在差異。

分子生物學(xué)與遺傳學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，個體疾病的易感性不僅與環(huán)境因素相關(guān)，更與不同等位基因?qū)е碌谋磉_差異相關(guān)。MTHFR及MTRR的基因多態(tài)性存在地區(qū)和民族的差異［17，19］，因此對孕婦實施個體化補充葉酸顯得尤為重要。而現(xiàn)行的公共衛(wèi)生政策并未實現(xiàn)因地區(qū)而異、因民族而異，本研究給個體化醫(yī)療提供了理論基礎(chǔ)。對本地人群的MTHFR和MTRR相關(guān)位點的多態(tài)性調(diào)查有助于進一步了解當(dāng)?shù)貪h族人群的遺傳特征，為基因多態(tài)性與疾病發(fā)生的相關(guān)性提供理論依據(jù)，同時也為改善公共衛(wèi)生政策提供依據(jù)。

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