顧舒舒 范鋒（江蘇省無(wú)錫市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心 214000）

近年無(wú)錫市奶牛結(jié)核病的流行病學(xué)調(diào)查

顧舒舒 范鋒（江蘇省無(wú)錫市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心 214000）

結(jié)核病是由結(jié)核分支桿菌引起的一種人畜共患慢性傳染病。牛結(jié)核病主要是由牛分枝桿菌所引起，主要特征為在多種組織器官形成干酪樣壞死、肉芽腫（結(jié)核結(jié)節(jié)）和鈣化結(jié)節(jié)病變。該病危害嚴(yán)重，被國(guó)際獸醫(yī)局（OIE）列為B類動(dòng)物疫病[1]，我國(guó)列為二類傳染病。本病可經(jīng)呼吸道、消化道、交配等方式感染。在家畜中，牛最易感染結(jié)核病，尤以奶牛多見(jiàn)，其次是水牛和黃牛[2]。近年來(lái)，隨著人們生活水平的提高，對(duì)奶制品特別是牛奶需求量的增加，帶動(dòng)了奶牛業(yè)的迅猛發(fā)展，牛結(jié)核病也日益受到了密切關(guān)注。目前江蘇省奶牛結(jié)核病按照現(xiàn)階段國(guó)家動(dòng)物疫病監(jiān)測(cè)計(jì)劃分類標(biāo)準(zhǔn)屬二類地區(qū)，奶牛結(jié)核病不治療，而采取嚴(yán)格的隔離、撲殺患病牛的政策。

牛結(jié)核病的檢測(cè)方法大體可分為三類：第一類是病原學(xué)檢查法，如涂片染色鏡檢、細(xì)菌培養(yǎng)等，該法是最確實(shí)的方法之一，但由于染色法檢出的細(xì)菌只能說(shuō)明有抗酸桿菌，不能準(zhǔn)確鑒定出結(jié)核分枝桿菌和非典型分支桿菌，因而缺乏特異性[3]；而細(xì)菌培養(yǎng)檢出率低，結(jié)核菌生長(zhǎng)緩慢，一般需10～30d才能看到菌落[4]，且有10～20%的病例結(jié)核菌培養(yǎng)失敗[5,6]，因此，該法在牛結(jié)核菌的臨床診斷中不易推廣。第二類是免疫學(xué)方法，如皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)、膠體金和ELISA等方法，PPD皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)是目前最常用的奶牛結(jié)核病檢測(cè)方法，我國(guó)普遍采用單純頸部皮試變態(tài)反應(yīng)（SCT）進(jìn)行檢測(cè)，歐盟（EU）國(guó)家廣泛使用比較皮試變態(tài)反應(yīng)（CCT）進(jìn)行檢測(cè)[7]，而膠體金和ELISA檢測(cè)雖然簡(jiǎn)單易行，但目前實(shí)際價(jià)格昂貴，大規(guī)模實(shí)施的成本過(guò)高。第三類是分子生物學(xué)方法，如核酸探針、PCR和DNA圖譜等方法，該法需特殊的儀器設(shè)備，對(duì)實(shí)驗(yàn)室條件以及操作人員的技術(shù)要求較高，只適用于實(shí)驗(yàn)室研究，不適用于基層的推廣應(yīng)用。有報(bào)道稱，新型的γ-干擾素（IFN-γ）體外釋放試驗(yàn)相比SCT和CCT而言，能保持較高的靈敏度和較好的特異性[8]。

于2011～2013年間，對(duì)無(wú)錫市所有存欄的奶牛進(jìn)行了奶牛結(jié)核病的流行病學(xué)調(diào)查，本文旨在為無(wú)錫市奶牛結(jié)核病的診斷和防治提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器

精密電子天平、高速低溫離心機(jī)、恒溫培養(yǎng)箱、超凈工作臺(tái)、顯微鏡、微量可調(diào)移液器、超純化水機(jī)、電動(dòng)推毛剪、微量金屬注射器、注射獸用16#針頭、游標(biāo)卡尺、酶標(biāo)儀等。

1.2 試劑與耗材

牛型PPD、禽型PPD購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)監(jiān)察所。BOVIGAMTM試劑盒購(gòu)自瑞士Prionics公司。

1.3 被檢動(dòng)物

2011～2013年間，無(wú)錫市所有存欄的奶牛，除初生犢牛、懷孕后期母牛及隔離病牛外，其余均為調(diào)查對(duì)象。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 單純頸部皮試變態(tài)反應(yīng)（SCT）

參照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《動(dòng)物結(jié)核病診斷技術(shù)（GB/T18645-2002）》，對(duì)無(wú)錫市所有存欄奶牛采用SCT進(jìn)行檢測(cè)，使用國(guó)產(chǎn)牛型PPD，劑量為2000U（IU）/頭，分別于注射前和注射后72h測(cè)量皮膚厚度，并計(jì)算出皮厚差，依據(jù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)判斷結(jié)果，對(duì)粗篩和二次復(fù)核均為可疑的判定為陽(yáng)性。

1.4.2 γ-干擾素（IFN-γ）體外釋放試驗(yàn)

對(duì)所有規(guī)模奶牛場(chǎng)（存欄100頭以上）隨機(jī)挑選部分奶牛，同時(shí)采用IFN-γ釋放試驗(yàn)進(jìn)行檢測(cè)。奶牛尾靜脈無(wú)菌采血5ml/頭，將采集的血液置于肝素鈉抗凝管中，輕輕顛倒混勻，使肝素鈉溶解。室溫下將血樣運(yùn)送到實(shí)驗(yàn)室，在采血后8h內(nèi)進(jìn)行刺激培養(yǎng)。將全血樣品無(wú)菌分裝至24孔板中，每份血樣分裝3孔，1.5ml/孔。向各孔中分別無(wú)菌加入100μl PBS、禽型PPD、牛型PPD，震蕩混勻1min。將含有血液與抗原的24孔板置于37℃濕溫培養(yǎng)箱中孵育24h。次日從各培養(yǎng)孔吸取500μl血漿上清轉(zhuǎn)入1.5ml離心管中，即為刺激產(chǎn)生的γ-干擾素上清。以Prionics公司購(gòu)得的試劑盒檢測(cè)牛全血上清液中的γ-干擾素，具體操作參照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：牛型PPD刺激上清的OD值-PBS刺激上清的OD值≥0.1，且牛型PPD刺激上清的0D值-禽型PPD刺激上清的0D值≥0.1判為陽(yáng)性；牛型PPD刺激上清的OD值-PBS刺激上清的OD值＜0.1或牛型PPD刺激上清的0D值-禽型PPD刺激上清的0D值＜0.1，則判為陰性。

2 結(jié)果

2.1 SCT檢測(cè)結(jié)果

2011～2013年間，對(duì)全市7個(gè)區(qū)、2個(gè)縣的奶牛用SCT檢測(cè)奶牛結(jié)核病發(fā)病情況，共檢測(cè)奶牛25613頭次，其中結(jié)核陽(yáng)性奶牛292頭，結(jié)核陰性奶牛25321頭次，陽(yáng)性率為1.14%；2011年共檢測(cè)奶牛9020頭，其中結(jié)核陽(yáng)性奶牛147頭，結(jié)核陰性奶牛8873頭，陽(yáng)性率為1.63%；2012年共檢測(cè)奶牛8796頭，其中結(jié)核陽(yáng)性奶牛89頭，結(jié)核陰性奶牛8707頭，陽(yáng)性率為1.01%；2013年共檢測(cè)奶牛7797頭，其中結(jié)核陽(yáng)性奶牛56頭，結(jié)核陰性奶牛7741頭，陽(yáng)性率為0.72%。檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表1。

2.2 兩種方法檢測(cè)結(jié)果

對(duì)其中13個(gè)規(guī)模奶牛場(chǎng)，分別采用SCT和IFN-γ體外釋放試驗(yàn)同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)，共計(jì)檢測(cè)奶牛14000頭次。

SCT檢測(cè)結(jié)果為：結(jié)核陽(yáng)性奶牛105頭，結(jié)核陰性奶牛13895頭次，其中初篩可疑牛15頭次，陽(yáng)性率0.75%，其中2011年檢測(cè)出結(jié)核陽(yáng)性奶牛56頭，結(jié)核陰性奶牛3944頭，陽(yáng)性率1.40%；2012年檢測(cè)出結(jié)核陽(yáng)性奶牛34頭，結(jié)核陰性奶牛4966頭，陽(yáng)性率0.68%；2013年檢測(cè)出結(jié)核陽(yáng)性奶牛15頭，結(jié)核陰性奶牛4985頭，陽(yáng)性率0.30%。具體結(jié)果見(jiàn)表2。

IFN-γ體外釋放試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果顯示：ELISA判定陽(yáng)性奶牛72頭，ELISA判定陰性奶牛13928頭次，陽(yáng)性率0.51%，其中2011年檢測(cè)出結(jié)核陽(yáng)性奶牛45頭，結(jié)核陰性奶牛3955頭，陽(yáng)性率1.13%；2012年檢測(cè)出結(jié)核陽(yáng)性奶牛21頭，結(jié)核陰性奶牛4979頭，陽(yáng)性率0.42%；2013年檢測(cè)出結(jié)核陽(yáng)性奶牛6頭，結(jié)核陰性奶牛4994頭，陽(yáng)性率0.12%。具體結(jié)果見(jiàn)表3。

3 分析與討論

3.1 奶牛結(jié)核病的發(fā)病情況

2011～2013年間，無(wú)錫市奶牛結(jié)核病的陽(yáng)性率呈現(xiàn)逐年降低的趨勢(shì)（見(jiàn)圖1）。結(jié)核病陽(yáng)性率從2011年的1.63%降到2012年的1.01%，同比降低了38.04%，2013年的陽(yáng)性率從2012年的1.01%降至0.72%，同比降低了28.71%，下降幅度逐漸縮小。

圖1 2011～2013年間無(wú)錫市奶牛結(jié)核病發(fā)病情況

表1 2011～2013年間無(wú)錫市奶牛結(jié)核病SCT監(jiān)測(cè)結(jié)果

表2 2011～2013年間無(wú)錫市規(guī)模奶牛場(chǎng)部分奶牛結(jié)核病SCT檢測(cè)結(jié)果

表3 2011～2013年間規(guī)模奶牛場(chǎng)部分奶牛結(jié)核病IFN-γ體外釋放試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果

通過(guò)對(duì)奶牛結(jié)核病進(jìn)行定期監(jiān)測(cè)和篩查，對(duì)入境奶牛進(jìn)行嚴(yán)格檢疫，及時(shí)淘汰病牛，隔離可疑牛，堅(jiān)持檢疫與淘汰相結(jié)合的原則，三年來(lái)，無(wú)錫市奶牛結(jié)核病的發(fā)病率在一定程度上得到了控制。結(jié)核病陽(yáng)性率下降幅度逐漸縮小，可能是由于全市奶牛的飼養(yǎng)量逐年減少，同時(shí)陽(yáng)性牛在每年的篩查中被淘汰，結(jié)核病傳染的風(fēng)險(xiǎn)降低，因此陽(yáng)性率在降低的同時(shí)，下降幅度也逐漸縮小。

3.2 兩種檢測(cè)方法的對(duì)比

2011～2013年間，采用SCT和IFN-γ體外釋放試驗(yàn)兩種方法，對(duì)13個(gè)規(guī)模奶牛場(chǎng)的檢測(cè)結(jié)果顯示，SCT的陽(yáng)性檢出率明顯高于IFN-γ試驗(yàn)，而其陽(yáng)性、陰性符合數(shù)卻低于IFN-γ試驗(yàn)，因此IFN-γ試驗(yàn)具有更強(qiáng)的特異性。

IFN-γ體外釋放試驗(yàn)的陽(yáng)性數(shù)與SCT檢測(cè)陽(yáng)性數(shù)的比值呈現(xiàn)逐年減小的趨勢(shì)（見(jiàn)圖2），一方面說(shuō)明SCT檢測(cè)法存在較多的假陽(yáng)性，而IFN-γ體外釋放試驗(yàn)很大程度上排除了這些假陽(yáng)性，提高了檢測(cè)的準(zhǔn)確率；另一方面，由于陽(yáng)性檢出準(zhǔn)確率的提高，陽(yáng)性奶牛被及時(shí)淘汰、撲殺，因此陽(yáng)性奶牛數(shù)逐年減少，陽(yáng)性率呈現(xiàn)逐年下降的趨勢(shì)（見(jiàn)圖3）。

4 結(jié)論

2011～2013年間，無(wú)錫市奶牛結(jié)核病的陽(yáng)性率總體呈下降趨勢(shì)，通過(guò)堅(jiān)持檢疫與淘汰相結(jié)合的原則，結(jié)核病陽(yáng)性率的下降幅度也逐漸縮小。調(diào)查發(fā)現(xiàn)，及時(shí)淘汰、撲殺結(jié)核病陽(yáng)性奶牛，對(duì)飼養(yǎng)環(huán)境進(jìn)行嚴(yán)格消毒，降低奶牛群的飼養(yǎng)密度，加強(qiáng)飼養(yǎng)管理，提高奶牛自身免疫力等措施，可以有效降低奶牛結(jié)核病的發(fā)病率。經(jīng)檢測(cè)確診為結(jié)核病陽(yáng)性的奶牛被及時(shí)撲殺，據(jù)統(tǒng)計(jì)，三年來(lái)共撲殺奶牛292頭。此次調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，多數(shù)奶牛結(jié)核病檢測(cè)陽(yáng)性的牛為從外地新購(gòu)入奶牛，在隔離觀察期內(nèi)未出現(xiàn)明顯癥狀，但SCT和IFN-γ體外釋放試驗(yàn)均檢測(cè)為陽(yáng)性，因此，下一步要加強(qiáng)調(diào)入管理，防止疫病傳入，嚴(yán)格執(zhí)行調(diào)入動(dòng)物審批制度，調(diào)入的奶牛經(jīng)調(diào)出地動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督機(jī)構(gòu)檢測(cè)合格的同時(shí)，在調(diào)入本地后要采取嚴(yán)格完善的隔離措施，隔離飼養(yǎng)45d后方可混群飼養(yǎng)。

通過(guò)對(duì)SCT和IFN-γ體外釋放試驗(yàn)兩種方法連續(xù)三年的檢測(cè)結(jié)果對(duì)比，IFN-γ試驗(yàn)顯示出了簡(jiǎn)單、快捷、靈敏度高、特異性強(qiáng)等特點(diǎn)，使實(shí)驗(yàn)結(jié)果更為客觀、可靠，可以有效解決基層動(dòng)物監(jiān)督、疫病防控機(jī)構(gòu)在實(shí)施奶牛結(jié)核病檢疫、隔離、撲殺措施過(guò)程中的一系列問(wèn)題，諸如多次繁瑣的測(cè)量觀察，大量的人力物力參與、主觀判定陽(yáng)性實(shí)施撲殺的困難等，因此非常適宜結(jié)核病檢疫和監(jiān)測(cè)技術(shù)的推廣。但是，IFN-γ試驗(yàn)仍存在成本較高等問(wèn)題，且國(guó)內(nèi)目前尚無(wú)正規(guī)批準(zhǔn)試劑盒，但農(nóng)業(yè)部2013年國(guó)家動(dòng)物疫病監(jiān)測(cè)與流行病學(xué)調(diào)查計(jì)劃“對(duì)監(jiān)測(cè)陽(yáng)性的動(dòng)物，可用外周血IFN-γ體外釋放檢測(cè)法（按試劑盒說(shuō)明書(shū)）進(jìn)行確診”[9]的建議，在本研究的基礎(chǔ)上，將探討采用結(jié)核菌素皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)初篩，初篩陽(yáng)性或疑似的進(jìn)行IFN-γ試驗(yàn)確診的方法。

圖2 IFN-γ體外釋放試驗(yàn)的陽(yáng)性數(shù)與SCT檢測(cè)陽(yáng)性數(shù)的比值

圖3 2011～2013年間無(wú)錫市規(guī)模奶牛場(chǎng)奶牛結(jié)核病的發(fā)病情況

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[9]農(nóng)業(yè)部關(guān)于印發(fā)《2013年國(guó)家動(dòng)物疫病監(jiān)測(cè)與流行病學(xué)調(diào)查計(jì)劃》的通知（農(nóng)醫(yī)發(fā)【2013】9 號(hào)）.