李 玲，馬建波

基于嵌合抗原受體的腫瘤免疫治療的研究進展

李 玲，馬建波

近來關(guān)于嵌合抗原受體(chimeric antigen receptor，CAR)修飾T細胞在治療包括淋巴瘤、白血病、腦膠質(zhì)瘤、黑色素瘤、肺癌、前列腺癌、胰腺癌及卵巢癌等腫瘤所取得成績令人振奮。CAR是利用基因工程將能夠與腫瘤抗原結(jié)合的受體與跨細胞膜的部分和細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導的部分結(jié)合起來形成的一種新型受體，它可脫離主要組織相容性復合體的限制單獨執(zhí)行殺傷細胞的功能。CAR修飾T細胞因其獨特的設(shè)計和強效的抗腫瘤作用受到人們的追捧。作者就CAR修飾T細胞在臨床治療中的應用、遇到的問題和對應策略作一綜述。

嵌合抗原受體；T細胞；腫瘤；免疫治療

最近幾十年來傳統(tǒng)的腫瘤治療方法(外科手術(shù)、化學治療、放射治療等)取得很大的進步，但是在生存率、復發(fā)和轉(zhuǎn)移等方面仍存在巨大的挑戰(zhàn)。隨著腫瘤生物學和免疫學研究的進步和深入，近年來，免疫治療逐步成為腫瘤治療的新星。其中，基于嵌合抗原受體(chimeric antigen receptor，CAR)腫瘤免疫治療技術(shù)開始嶄露頭角。CAR修飾的T細胞(chimeric antigen receptor-T cell，CAR-T)治療這一概念最早是由Gross等[1]于1989年提出，CAR-T因不受主要組織相容性復合物(main histocompatibility complex，MHC)的限制而得到青睞。將近25年的時間里CAR-T在動物實驗和臨床試驗中表現(xiàn)出良好的靶向性、殺傷性和體內(nèi)持久性，在治療淋巴瘤[2]、B細胞白血病[3-4]、腦膠質(zhì)瘤[5]、成神經(jīng)細胞瘤[6]、卵巢癌[7]等惡性腫瘤方面取得了很好的成效。

1 CAR-T

T細胞是人體內(nèi)發(fā)揮特異性抗腫瘤作用的效應細胞，但其作用的發(fā)揮具有MHC限制。而人體內(nèi)另一種特異性淋巴細胞B細胞的抗原受體及其分泌的抗體可以直接與相應的抗原結(jié)合。CAR-T是利用基因工程的方法將非MHC限制性方式識別目標抗原的單鏈抗體與間隔區(qū)、跨膜基序和T細胞的活化基序等結(jié)合為一體，并借助病毒等載體轉(zhuǎn)染T細胞，以賦予T細胞更加強大的特異性殺傷腫瘤的能力[8]。多數(shù)CAR包括細胞外抗原結(jié)合區(qū)、細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導區(qū)和中間的跨膜區(qū)域。細胞外抗原結(jié)合區(qū)是由鉸鏈區(qū)連接來源于單克隆抗體輕鏈和重鏈的一段單鏈抗體(single chain fragment variable，scFv)，其作用是特異性識別靶細胞表面的特異性抗原，選擇合適的細胞外區(qū)片段是CAR的研究重點。細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導區(qū)是介導T細胞內(nèi)信號傳遞直至T細胞活化增殖從而最終完成殺傷腫瘤的過程，同樣也是研究的重要內(nèi)容，已經(jīng)有很多研究聚焦于CAR產(chǎn)生的信號是如何激活T細胞的[9-10]。

CAR的發(fā)展可因其刺激信號分子組合方式的不同分為3代。第1代CAR僅含有一個信號單元，大多來自于CD3ζ或者FcRg亞單位[11]。這種方式修飾的T細胞只能產(chǎn)生短暫的分裂，最高的擴增倍數(shù)是3.75倍[12]；在一些臨床應用上T細胞的存活時間不超過63 d，而且在腫瘤位置處沒有檢測到有T細胞的存在[13-15]；分泌的細胞因子較少不足以促使T細胞對抗強大的腫瘤細胞以致T細胞凋亡[16]。因此，第1代CAR在臨床上治療淋巴瘤、成神經(jīng)細胞瘤、卵巢癌和腎癌等受到了一定的限制[12，17-19]。

第2代CAR的研究更多關(guān)注的是如何在第1代CAR的基礎(chǔ)上引入1個共刺激分子，也就是T細胞受體與配體相結(jié)合的共刺激路徑。研究表明，細胞內(nèi)含有CD28分子與CD3ζ的CAR不僅增加T細胞的擴增倍數(shù)而且增強了T細胞的抗腫瘤特性[20-23]?，F(xiàn)在已經(jīng)有大量的研究證明除了CD28分子外，腫瘤壞死因子家族成員CD27、4-1BB(CD137)、OX40 (CD134)等均可以為CAR-T提供協(xié)同刺激信號[24-26]。Savoldo等[15]在治療B細胞淋巴瘤時分別用CD19 CAR-T和CD19-28 CAR-T來比較第1代和第2代CAR的抗腫瘤效果，結(jié)果顯示在T細胞的擴增和體內(nèi)持久性方面第2代CAR都優(yōu)于第1代CAR，目前用于臨床試驗的主要是第2代CAR。

第3代CAR是在第2代的基礎(chǔ)上又增加了1個共刺激分子。有研究表明，2個CD28及4-1BB、CD3ζ偶聯(lián)形成的第3代CAR可增強T細胞的殺瘤能力，并延長了T細胞在體內(nèi)的存活時間，盡管一些臨床前實驗證明第3代CAR在T細胞的擴增倍數(shù)、體內(nèi)存活時間以及分泌細胞因子的能力都較第2代有優(yōu)勢[27-29]。但是美國Morgan等[30]報道的1例結(jié)腸癌合并肝和肺轉(zhuǎn)移患者，在應用第3代人類表皮生長因子受體2-CAR-T治療后第5天死亡的結(jié)果表明，第3代CAR技術(shù)用于臨床仍然存在一定的風險。因此，第3代CAR用于臨床還有較長的路要走。CAR結(jié)構(gòu)見圖1。

圖1 嵌合抗原受體結(jié)構(gòu)

2 CAR-T在臨床應用中遇到的問題

目前，CAR-T在淋巴瘤、白血病治療的臨床應用已獲得了可喜的成績，在卵巢癌、乳腺癌、肺癌等研究中也取得了一定的突破(表1)。但是現(xiàn)在CART治療領(lǐng)域也面臨著不少需要解決的問題，如輸注細胞數(shù)量、T細胞增殖能力、支持性細胞因子、輸注細胞時機等在內(nèi)的臨床方案的優(yōu)化，已經(jīng)取得成功的CAR-T治療是否可以進入腫瘤疾病的標準治療程序。CD19 CAR-T在血液腫瘤治療中的成功是否可以成功延展到實體惡性腫瘤。此外，CAR-T的研究以及臨床應用中還暴露出了一些諸如脫靶效應、“細胞因子風暴”的不良反應，這些都值得關(guān)注和需要進一步研究。

2.1 脫靶效應 目前，越來越多的臨床試驗暴露出CAR-T的安全問題。首先就是脫靶效應，其主要特征是導致針對正常組織的殺傷作用。用于腫瘤治療的多數(shù)靶抗原在人體正常組織中也會有微量的表達，所以對靶抗原親和力強、殺傷能力強的CAR-T與這類抗原作用勢必造成組織損傷，即為“脫靶效應”。腫瘤抗原分為腫瘤特異性抗原(tumor specific antigen，TSA)和腫瘤相關(guān)抗原(tumor associated antigen，TAA)。TSA只表達于腫瘤細胞而不表達于正常細胞的抗原。TAA是指一類既表達于腫瘤細胞，也表達于正常細胞的抗原。目前發(fā)現(xiàn)和應用的腫瘤抗原中TSA相對較少，大多是TAA，其中研究最多的是以CD19、CD20為靶抗原的CAR-T治療B細胞惡性腫瘤[31-34]。這類以 CD19、CD20為靶抗原的CAR-T治療在高效殺傷惡性B細胞的同時也殺傷機體內(nèi)其他B細胞，導致患者長期處于免疫功能低下狀態(tài)，需采用特定的維持療法。

表1 CAR-T治療腫瘤的臨床試驗

Lamers等[19]研究表明，用特異性識別碳酸酐酶-ⅨCAR修飾T細胞在治療轉(zhuǎn)移性腎細胞癌時因為正常肝臟細胞會有少量碳酸酐酶-Ⅸ的表達，對肝細胞造成了一定的毒性，說明CAR-T的脫靶問題在臨床治療中需要持續(xù)的關(guān)注。研發(fā)與靶抗原具有特定親和力的CAR-T可能不失為一種有效的解決辦法；另外，發(fā)現(xiàn)和使用腫瘤特異性抗原作為CAR-T治療的靶點雖然比較困難，但也是最為有效的解決方法。

2.2 細胞因子風暴 第2、3代CAR中引入了1個或多個共刺激分子，細胞活化、增殖、殺傷能力大幅增強，致使細胞治療過程中多種細胞因子，如白介素(interleukin，IL)-1、IL-6、IL-12、γ-干擾素等大量釋放到機體循環(huán)系統(tǒng)中，引起惡心、頭痛、心動過速、低血壓、皮疹、呼吸急促等臨床癥狀，嚴重者可導致多器官功能衰竭或者急性呼吸窘迫綜合征，這就是所謂的“細胞因子風暴”?！凹毎蜃语L暴”常發(fā)生于細胞治療后6～20 d，與患者原有的疾病、基因多態(tài)性和CAR的結(jié)構(gòu)因素關(guān)系密切。Brentjens等[35]報道的1例慢性淋巴細胞白血病患者死亡的詳情，該患者在輸入第2代CAR修飾的自體T細胞2 d便出現(xiàn)發(fā)熱、低血壓、呼吸困難和腎衰竭，并于治療后4 d死亡，“細胞因子風暴”可能是其致死的主要原因之一。

除了以上提到的細胞毒性，CAR-T引起的過敏反應也是值得關(guān)注的。Maus等[36]報道了4例鼠源抗體修飾的CAR-T在第3次輸入患者體內(nèi)后，4例均在數(shù)分鐘內(nèi)產(chǎn)生過敏反應，接著心臟驟停。可能是因為鼠源性的序列誘導患者體內(nèi)產(chǎn)生免疫蛋白E抗體，從而導致患者死亡。這項研究說明鼠源抗體也是CAR-T用于臨床治療腫瘤的一個隱患。

3 CAR-T應用的新策略

3.1 效應細胞的選擇 目前用于CAR技術(shù)的主要效應細胞有T細胞、自然殺傷(natural killer cell，NK)細胞、腫瘤浸潤淋巴細胞等，其中大多數(shù)是T細胞[37]。研究顯示，表達CAR的不同T細胞亞群的臨床抗腫瘤效果是有差異的，所以對最有效的T細胞亞群進行精確檢測和分離可謂是重中之重；已證實CD8＋是主要的效應細胞，CD4＋可輔助細胞免疫進行應答，如果將兩者共同培養(yǎng)可促進細胞毒效應T細胞的大量制備；初始T細胞和中樞記憶T細胞的侵入能力均優(yōu)于已經(jīng)分化了的T細胞[38-40]。Gattinoni等[41]于2011年發(fā)現(xiàn)干細胞樣記憶T細胞有著兼具初始T細胞和記憶T細胞兩者的優(yōu)勢，在臨床模型中表現(xiàn)出較好的效果。另外，CAR-T的殺瘤能力和亞型與體外培養(yǎng)所加的細胞因子相關(guān)。Xu等[42]研究了CAR-T在體內(nèi)的持久性及殺瘤能力與體外培養(yǎng)所加的細胞因子之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)體外培養(yǎng)時加入IL-7和IL-15可提高CAR-T的殺傷腫瘤能力。Gargett和Brown[43]的研究也發(fā)現(xiàn)了同樣的結(jié)果，而且建議將IL-7、IL-15用于臨床治療時細胞的體外培養(yǎng)。

另外，具有抗腫瘤能力的NK細胞也被用作CAR的效應細胞，早在10年前，Imai等[44]就發(fā)現(xiàn)可通過反轉(zhuǎn)錄病毒介導CD19 CAR實現(xiàn)NK細胞對ALL的治療，且共刺激分子CD137能增強其功效。

另一種具有抗腫瘤效應的細胞因子誘導的殺傷細胞，因其具有廣譜抗腫瘤作用、不需要接觸抗原即可在培養(yǎng)基中快速擴增的特點[45]，被越來越多的研發(fā)人員尤其是國內(nèi)的研究人員作為CAR的效應細胞。

3.2 人工調(diào)控CAR表達 基因治療的安全性仍然是人們最為關(guān)注的熱點之一，而人工調(diào)控基因表達是解決基因治療安全性問題的策略之一。即在進行細胞治療時可以引入自殺式人工調(diào)控開關(guān)，發(fā)生毒性反應后可通過誘導自殺基因表達來清除基因修飾的T細胞，從而防止嚴重后果的發(fā)生?；瘜W誘導二聚化/半胱天冬酶9、單純皰疹病毒胸苷激酶/丙氧鳥苷已被引入CAR-T治療中[46-47]。CAR-T中引入自殺基因可有效地將細胞毒性減到最小，從而提高治療效果。

3.3 共刺激分子組合的優(yōu)化 第2、3代CAR因加入了2個或者多個共刺激分子使得T細胞的殺瘤能力、細胞因子的釋放和在體內(nèi)的存留時間都大大增加，可見共刺激分子的數(shù)量及組合方式對T細胞的功能有很大的影響。如何才能選擇最優(yōu)的共刺激分子組合并獲得最佳的CAR結(jié)構(gòu)是目前研究的重點。Song等[48]和 Redmond等[49]將 CD28、CD134和CD137分別連接到CD3ζ鏈上，證明增加CD28后增強了T細胞的增殖能力，由此證明了CD28是必要的共刺激分子；后來又分別證明了CD134可增強被CD28修飾的T細胞的活化，CD137有助于延長T細胞的存活時間。可誘導的協(xié)同刺激分子的加入能有效地溶解目標細胞[10，25，50]。另外，CAR-T的殺瘤能力也受跨膜區(qū)序列的影響[51]。最優(yōu)的CAR結(jié)構(gòu)仍然是CAR技術(shù)開發(fā)的要點和熱點。

3.4 轉(zhuǎn)導方法的選擇 目前應用最多的是以病毒作為載體。慢病毒載體是以人類免疫缺陷Ⅰ型病毒為基礎(chǔ)發(fā)展起來的基因治療載體，可有效感染包括干細胞、腫瘤細胞、神經(jīng)元細胞在內(nèi)的多種細胞，對處于細胞周期中的任一時期的細胞都有很強的感染能力。同時，慢病毒可避免反轉(zhuǎn)錄病毒帶來的插入突變，還可以自身失活，這些優(yōu)勢都使得它成為“明星”載體。在CAR-T治療的實驗中，帶有CD3或者CD28的慢病毒取得了良好的感染效果，其效率非常之高[52]。另有研究顯示，細胞因子IL-7能夠增加T細胞的感染率[53]。Lentigen公司的慢病毒包裝系統(tǒng)在CAR-T治療血液系統(tǒng)腫瘤中得到了很好的應用。但是構(gòu)建重組的慢病毒載體的花費較高，這一缺點限制了慢病毒的使用。

作為基因工具，“睡美人(sleeping beauty，SB)”轉(zhuǎn)座系統(tǒng)是由Ivics等[54]重建鮭魚基因組中的一個失活基因而得到的，它在基因治療和基因標簽方面都發(fā)揮了非常重要的作用。SB轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)也能隨機整合到人類T細胞基因組中[55]。SB轉(zhuǎn)座系統(tǒng)在靶向CD19的CAR-T研究和靶向p53和T細胞識別黑色素瘤抗原-1的CAR-T研究中轉(zhuǎn)染效率可達20%～30%。此外，Piggybac轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)在用于CAR修飾中不僅可以穩(wěn)定長期的表達外源基因，還可裝載長達18 kb的基因片段，能夠代替Cre/loxP成為又一理想的載體[56]。最近，Saito等[57]研究Piggybac轉(zhuǎn)座子介導CD19特異性CAR治療費城染色體陽性急性淋巴細胞白血病的結(jié)果證明，Piggybac轉(zhuǎn)座子可為細胞免疫治療抗藥性費城染色體陽性急性淋巴細胞白血病提供一個高效、廉價和安全的手段。

體外轉(zhuǎn)錄編碼CAR的RNA是轉(zhuǎn)導的另一個選擇。研究表明，RNA的體外轉(zhuǎn)導可在較短的時間內(nèi)刺激更多CAR的表面抗原的表達，而且在治療前期的模型實驗中也證實了mRNA介導的CAR-T能夠積極對抗腫瘤細胞[58-60]。雖然在細胞治療前可直接進行RNA轉(zhuǎn)導，但其存在明顯的缺點:①短期內(nèi)CAR的表達只能刺激少量T細胞的分化進而影響治療效果，能否達到抵抗腫瘤的作用還有待于進一步研究；②用RNA轉(zhuǎn)導這一方式也無法保證CAR-T在體內(nèi)的存留時間和記憶效果。

質(zhì)粒載體在基因治療中占據(jù)著非常重要的地位，與病毒載體相比，質(zhì)粒載體的構(gòu)建花費較少，而且不會整合到宿主的基因組上，安全性有一定的保證。但是，質(zhì)粒載體的構(gòu)建需要花費更多的時間，其抗性基因以及未甲基化的序列會影響基因的表達，而且人類的體液和細胞免疫會對質(zhì)粒載體的抗性基因產(chǎn)生免疫反應[14]。微環(huán)DNA是一種新穎的小環(huán)超螺旋表達框，可通過位點特異性重組得到，它缺乏復制原點、抗性標志基因的細菌序列，增強了臨床上的安全性系數(shù)[61]，在CAR-T治療中有著自己的應用潛力。

此外，電擊穿孔T細胞導入mRNA的轉(zhuǎn)染效率可達90%以上；鋅指蛋白核酸酶通過鋅指蛋白的特異性識別靶細胞使得整合效率在20%以上[62]?；蚪M編輯新技術(shù)CRISPR-Cas是一種快速、高效、可靠的用于定點構(gòu)建基因敲除的新方法，在動物模型中的應用前景非常廣闊，或?qū)⒊蔀榧毎庖咧委熤谢蜣D(zhuǎn)導方法的新選擇。

3.5 構(gòu)建雙靶抗原CAR 細胞治療中靶抗原應具有均一、特異性強且抗原分泌量較少的特點。為了達到以上要求，可以構(gòu)建雙靶抗原CAR來提高腫瘤的靶向性。其策略主要是讓1個T細胞表達2個不同的CAR，即使其中一個CAR的抗原在正常組織中有少量表達，也可通過另一個CAR來提高T細胞的特異性。Duong等[63]在2011年的時候發(fā)表了1種類似的方法，結(jié)果證明表達2個不同CAR的T細胞可有效增強靶細胞的免疫反應。Kloss等[64]構(gòu)建了針對前列腺特異性膜抗原和前列腺干細胞抗原的雙靶抗原受體，研究發(fā)現(xiàn)表達雙抗原受體的T細胞可有效地殺滅腫瘤細胞，而表達單抗原受體的T細胞只能影響腫瘤細胞的生長。Gheybi等[65]也構(gòu)建了針對乳腺癌的雙靶抗原黏蛋白1和HER2。通過構(gòu)建雙靶抗原可有效增加T細胞的特異性靶向抗腫瘤能力。

3.6 構(gòu)建“通用”CAR 為了擴大T細胞在腫瘤治療方面的應用，可以構(gòu)建對多種腫瘤都起作用的“通用CAR(universal CAR，uCAR)”。Tamada等[66]和Urbanska等[67]構(gòu)建的uCAR不僅使目的腫瘤分子溶解產(chǎn)生大量的細胞因子，還可以使T細胞迅速擴增。近來，Kudo等[68]構(gòu)建的uCAR的細胞外信號區(qū)為高親和性的CD16可變區(qū)和CD8a鉸鏈區(qū)，且研究表明這種CAR對多種腫瘤都有很強的親和力，而且T細胞的增殖也非常穩(wěn)定。

另外，還可以構(gòu)建抑制性CAR，用來拮抗痕量的CAR與正常組織的靶抗原作用后效應T細胞的激活。同時，還可以構(gòu)建親和性可調(diào)節(jié)的CAR，使其以不同的親和性識別抗原表達量不同的腫瘤細胞。

4 展望

隨著現(xiàn)代生物科學技術(shù)的快速發(fā)展，CAR-T在腫瘤治療的臨床應用中越來越被人們重視。時至今日，CAR的腫瘤免疫治療已由第1代發(fā)展到第3代，CAR-T的優(yōu)勢和臨床前期實驗結(jié)果顯示CAR-T在治療腫瘤方面更是有著無可取代的應用前景。2014年9月4日美國食品和藥物管理局批準了第1個程序性死亡受體1阻斷藥 Keytruda?(pembrolizumab)，本品被譽為免疫腫瘤之星。在CAR-T治療帶來興奮的同時也應該看到，腫瘤免疫治療仍就處于發(fā)展階段，有關(guān)CAR的大多數(shù)研究和臨床試驗仍以血液腫瘤為主，在實體性腫瘤方面還有很大的發(fā)展空間[69-70]。目前，越來越多的研究人員投入到對CAR腫瘤免疫治療方法的探索和完善中，在現(xiàn)今醫(yī)療水平與日俱爭的時代，有理由相信CAR-T在細胞免疫治療腫瘤的舞臺上將散發(fā)出更加璀璨的光芒。

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Advances in cancer immunotherapy based on chimeric antigen receptor

LI Ling，MA Jianbo
[Zhongzhengdaohe(Beijing)Bio-Technology Co.，Beijing 100176，China]

Recently，application of chimeric antigen receptor(CAR)modified T cells in the treatment of lymphoma，leukemia，brain glioma，melanoma，lung cancer，prostate cancer，pancreatic cancer and ovarian cancer has made very exciting progress.CAR is a kind of genetically engineered receptor，the common form of these molecules consists of extracellular antigen recognition region，spacer，transmembrane domain(TM)and intracellular endodomain，the antigen recognition region generally is single-chain variable fragments(scFv)derived from monoclonal antibodies which can recognize target antigen without MHC restriction，and the intracellular endodomain generally is comprised of CD3 zeta and co-stimulating molecules.This kind of unique design and strong antitumor effect make the CAR-T more and more widely used.In this review，we highlight recent advances of CAR-T in clinical applications，discovered problems and possible solving strategies in cancer therapy.

Chimeric antigen receptor(CAR)；T cell；Tumor；Immunotherapy

R730.51

A

2095-3097(2015)02-0097-08

10.3969/j.issn.2095-3097.2015.02.010

2014-12-02 本文編輯:馮 博)

100176北京，中政道和(北京)生物科技有限公司(李玲，馬建波)

馬建波，E-mail:majianbo＠gmail.com