王霆 楊興海 韓帥 魏海峰 吳志鵬 錢明 肖建如

山楂酸對(duì)人肺癌細(xì)胞增殖與遷移及其誘導(dǎo)破骨細(xì)胞分化的調(diào)控作用機(jī)制研究

王霆 楊興海 韓帥 魏海峰 吳志鵬 錢明 肖建如

目的 研究山楂酸 ( maslinic acid，MA ) 對(duì)人肺癌細(xì)胞增殖、遷移和其誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞分化的調(diào)控作用和可能的作用機(jī)制。方法 應(yīng)用山楂酸處理肺癌細(xì)胞株，MTS 法檢測(cè)細(xì)胞活性的抑制率；通過(guò) Transwell 觀察肺癌細(xì)胞的遷移；收集山楂酸刺激肺癌細(xì)胞后的培養(yǎng)基并觀察其對(duì)破骨細(xì)胞分化的誘導(dǎo)作用；并通過(guò) PCR 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)可能靶基因 mRNA 的水平改變。結(jié)果 山楂酸對(duì)正常肺上皮細(xì)胞 HBE 無(wú)明顯抑制作用，但可顯著抑制肺腺癌細(xì)胞 A549、PC9 和 H1299 的增殖和遷移，且抑制作用和藥物濃度呈正相關(guān)；20 μmol / L 的山楂酸對(duì) A549、PC9 和 H1299 細(xì)胞增殖的抑制率分別為 29%、58% 和 22%，而 40 μmol / L 的抑制率為 68%、82% 和 66%。同時(shí)山楂酸可顯著抑制由 A549 細(xì)胞誘導(dǎo)的 BMM 細(xì)胞向破骨細(xì)胞的分化 ( P＜0.001 )；通過(guò) PCR 實(shí)驗(yàn)，本研究結(jié)果顯示山楂酸可抑制 NF-κb 通路下游 BCL2、MMP2 和 MMP9 的 mRNA 水平，并促進(jìn) BAX、CASP3 和 CASP8 等凋亡相關(guān) mRNA 水平。結(jié)論 山楂酸可顯著抑制肺癌細(xì)胞的增殖及遷移，并抑制由肺癌細(xì)胞誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞分化，這種抑制作用可能是通過(guò)抑制 NF-κb 通路和激活線粒體凋亡通路實(shí)現(xiàn)的。

山楂酸；細(xì)胞運(yùn)動(dòng)；破骨細(xì)胞；細(xì)胞分化；肺腫瘤

肺癌是目前發(fā)病率最高的惡性腫瘤之一，并已成為男性致死人數(shù)最多及女性致死人數(shù)第二多的腫瘤[1]。肺癌的轉(zhuǎn)移是造成治療失敗和患者死亡的首要原因，而骨是肺癌最常見(jiàn)的轉(zhuǎn)移部位之一，約30%～40% 的進(jìn)展期肺癌出現(xiàn)骨轉(zhuǎn)移[2]。肺癌骨轉(zhuǎn)移常導(dǎo)致骨痛、高鈣血癥、病理性骨折、脊髓壓迫甚至癱瘓等并發(fā)癥，加速患者的死亡進(jìn)程[2-3]。然而由于缺乏典型臨床癥狀，多數(shù)患者在確診時(shí)已是中晚期，難以手術(shù)切除。雖然目前肺癌的化療方案有多種，但其 5 年生存率僅有 30%～40%[4]，因此，對(duì)肺癌化療藥物的進(jìn)一步研究，特別是針對(duì)肺癌骨破壞相關(guān)藥物的進(jìn)一步研究，可以為肺癌的臨床治療提供新的思路。

山楂酸 ( maslinic acid，MA ) 是一種五環(huán)三萜酸，存在于如山楂、芥末、橄欖、石榴、紅棗等多種天然植物中[5]。山楂酸具有抗炎[6]、抗氧化[7]、抗HIV[8]等諸多藥理學(xué)作用，近期研究也表明在前列腺癌、結(jié)腸癌和膀胱癌等腫瘤中[9-11]，山楂酸可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡并抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲，并且，山楂酸還可抑制由 RANKL 誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞分化并進(jìn)一步抑制骨質(zhì)疏松[12]，而其對(duì)于人體較高的安全性[13]，使其成為一種可能的新的腫瘤化療輔助藥物。然而，目前山楂酸在肺癌中的研究仍十分有限，關(guān)于山楂酸對(duì)腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞分化的研究也尚未有報(bào)道。本研究旨在探究山楂酸對(duì)肺腺癌細(xì)胞增殖、凋亡和遷移的調(diào)控作用，并探索其中可能的信號(hào)通路，為山楂酸在肺癌中的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

材料與方法

一、試劑和材料

DMEM 培養(yǎng)基、RPMI 1640 培養(yǎng)基和胎牛血清購(gòu)自美國(guó) GIBCO 公司；山楂酸購(gòu)自大連美侖生物技術(shù)有限公司；TRAP 染色和 TRAP 活性試劑盒購(gòu)自美國(guó) Genmed 公司；MTS 試劑購(gòu)自美國(guó) Promega 公司；Transwell 小室購(gòu)自美國(guó) Corning 公司；C57BL / 6 小鼠購(gòu)自第二軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心；M-CSF 因子購(gòu)自美國(guó) Peprotech 公司；qPCR mix 購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

二、細(xì)胞培養(yǎng)

人肺腺癌細(xì)胞株 A549、PC9、H1299 和人肺上皮細(xì)胞株 HBE 均由上海長(zhǎng)征醫(yī)院轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)中心提供。HBE、A549 和 H1299 細(xì)胞用含 10% 胎牛血清( FBS ) 的 DMEM 培養(yǎng)基，PC9 細(xì)胞用含 10% FBS 的RPMI 1640 培養(yǎng)基，均在 37 ℃，5% CO2條件下培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

三、山楂酸對(duì)肺腺癌細(xì)胞增殖影響的檢測(cè)

調(diào)整細(xì)胞懸液濃度至 105個(gè) / ml，于 96 孔板每孔加入細(xì)胞懸液 100 μl，培養(yǎng) 24 h 后吸去原培養(yǎng)基，每孔加入不同藥物濃度的培養(yǎng)基 ( 0、5、10、20、30、40 μmol / L )，每個(gè)濃度設(shè) 6 個(gè)復(fù)孔，對(duì)照組加入 0.01% DMSO ( 山楂酸的溶劑 )。培養(yǎng) 48 h，每孔加入 MTS 試劑 20 μl，震蕩混勻，培養(yǎng) 2 h，用酶標(biāo)儀在波長(zhǎng) 490 nm 處測(cè)定吸光度值。

四、山楂酸對(duì) A549 細(xì)胞遷移影響的檢測(cè)

調(diào)整細(xì)胞懸液濃度至 105個(gè) / ml，于 Transwell小室上層加入細(xì)胞懸液 100 μl，下層加入 500 μl 含10% FBS 的培養(yǎng)基，培養(yǎng) 24 h、棄去上、下層培養(yǎng)基，上層加入含 10、20、40 μmol / L 山楂酸或含0.01% DMSO 的無(wú)血清培養(yǎng)基，下層加入相應(yīng)藥物濃度的含 10% FBS 的培養(yǎng)基，每個(gè)濃度設(shè) 3 個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng) 48 h，棄去培養(yǎng)基，擦去上層細(xì)胞，PBS 洗滌2 遍，甲醛固定 30 min，風(fēng)干 15 min，0.1% 結(jié)晶紫染色 20 min，PBS 洗 3 遍，風(fēng)干，鏡下觀察并計(jì)數(shù)。每孔用 500 μl 33% 醋酸洗脫后，將洗脫液用酶標(biāo)儀在波長(zhǎng) 570 nm 處測(cè)定吸光度值。

五、骨髓來(lái)源巨噬細(xì)胞 ( bone marrow-derived macrophages，BMM )

提取 6 周齡 C57BL / 6 小鼠處死，75% 乙醇浸泡 5 min，分離并完整取出雙側(cè)股骨，在 75% 乙醇中浸泡骨頭 5 min，PBS 浸泡 5 min，切斷股骨兩端，用 1 ml 注射器吸取 DMEM 培養(yǎng)基并將骨干中骨髓沖洗出，吹打混勻，并以濾網(wǎng)濾去細(xì)胞團(tuán)，接種于 100 mm 培養(yǎng)皿中，加入 M-CSF 使其濃度為5 nmol / L，培養(yǎng) 12 h 后，取上清離心后將細(xì)胞接種于 24 孔板，加入 M-CSF 使其濃度為 10 nmol / L，培養(yǎng) 48 h 并換液后用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

六、山楂酸對(duì) A549 誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞分化影響的檢測(cè)

將 A549 細(xì)胞接種于 100 mm 培養(yǎng)皿后，培養(yǎng)至約 70% 的密度，換液后加入無(wú)血清培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)組加入山楂酸至 10 μmol / L，對(duì)照組加入 0.01% DMSO，培養(yǎng) 48 h，取上清離心后加入 BMM 細(xì)胞培養(yǎng)基，培養(yǎng) 5 天，參照說(shuō)明書完成細(xì)胞的 TRAP 染色和 TRAP 活性測(cè)試。

七、山楂酸對(duì)相關(guān)信號(hào)通路影響的檢測(cè)

將 A549 細(xì)胞接種于 6 孔板中，培養(yǎng) 24 h 棄去原培養(yǎng)基，加入含 5、10、20 μmol / L 山楂酸或含0.01% DMSO 的培養(yǎng)基，培養(yǎng) 48 h，用 TRIZOL 法提取細(xì)胞 RNA，通過(guò) qRT-PCR 檢測(cè) B 淋巴細(xì)胞瘤-2基因 ( b-cell lymphoma-2，BCL2 )、基質(zhì)金屬蛋白酶 2 ( matrix metalloproteinase 2，MMP2 )、基質(zhì)金屬蛋白酶 9 ( matrix metalloproteinase 9，MMP9 )、Bcl-2相關(guān) X 蛋白 ( Bcl-2 Associated X Protein，BAX )、胱天蛋白酶 3 ( caspase 3，CASP3 )、胱天蛋白酶 8 ( caspase 8，CASP8 ) 的 mRNA 水平 ( 引物序列和退火溫度見(jiàn)表 1 )。

表 1 本實(shí)驗(yàn)用的 PCR 引物Tab.1 The primers used in this study

八、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用 SPSS 19.0 軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，各組間比較采用獨(dú)立樣本 t 檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、山楂酸對(duì)肺腺癌細(xì)胞活性的影響

對(duì) A549 細(xì)胞用不同濃度的山楂酸刺激后，鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，山楂酸刺激后的 A549 細(xì)胞密度明顯減少，且可見(jiàn)部分細(xì)胞變圓、變小、漂浮等表現(xiàn)( 圖 1 )。通過(guò) MTS 實(shí)驗(yàn)，本研究發(fā)現(xiàn)山楂酸對(duì)正常肺上皮細(xì)胞 HBE 無(wú)明顯作用 ( 圖 2a )，但對(duì)肺腺癌細(xì)胞 A549、PC9 和 H1299 的增殖有明顯的抑制作用，且這種作用與其劑量呈正相關(guān) ( 圖 2b～d )。相較于空白組，山楂酸濃度達(dá)到 10 μmol / L 時(shí)對(duì) A549 ( P＜0.001 ) 和 PC9 ( P＝0.002 ) 細(xì)胞有明顯抑制作用，達(dá)到 20 μmol / L 時(shí)對(duì) H1299 細(xì)胞有顯著抑制作用 ( P＜0.001 )。20 μmol / L 的山楂酸對(duì) A549、PC9 和 H1299 細(xì)胞增殖的抑制率分別為 29%、58% 和 22%，而 40 μmol / L 的山楂酸對(duì) A549、PC9和 H1299 細(xì)胞增殖的抑制率分別為 68%、82% 和66%。

圖 1 光鏡下 ( ×40 ) 不同濃度的山楂酸刺激 A549 細(xì)胞后 48 h 的表現(xiàn) a：對(duì)照；b：5 μmol / L 山楂酸；c：10 μmol / L 山楂酸；d：20 μmol / L 山楂酸Fig.1 The light microscopic ( ×40 ) showings of A549 cells after the stimulation of MA a: Control group; b: 5 μmol / L MA; c: 10 μmol / L MA; d: 20 μmol / L MA

二、山楂酸對(duì) A549 細(xì)胞遷移的影響

利用 Transwell 小室，藥物刺激 48 h，通過(guò)結(jié)晶紫染色并測(cè)量了細(xì)胞數(shù)和吸光度。結(jié)果表明，在正常情況下，A549 細(xì)胞可從 Transwell 小室上層遷移至下層，而加入山楂酸后，可顯著抑制 A549 細(xì)胞的遷移，且這種抑制作用與山楂酸的濃度呈正相關(guān)，20 μmol / L 的山楂酸減少了 79.6% 的遷移細(xì)胞數(shù)，而40 μmol / L 的山楂酸減少了約 97.9% 的遷移細(xì)胞數(shù)( 圖 3、圖 4a )，可見(jiàn)相同濃度的山楂酸對(duì)遷移細(xì)胞數(shù)的抑制明顯高于山楂酸對(duì) A549 細(xì)胞增殖的抑制。利用醋酸將結(jié)晶紫洗脫并測(cè)量吸光度后，發(fā)現(xiàn)山楂酸作用后吸光度的改變和細(xì)胞數(shù)的改變呈相同趨勢(shì)( 圖 4b )。

圖 2 山楂酸對(duì) HBE ( a )、A549 ( b )、PC9 ( c ) 和 H1299 ( d ) 細(xì)胞活性的影響?？v坐標(biāo)軸為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的比值 ( 注：aP ＜ 0.05，bP ＜ 0.001 )Fig.2 The effects of MA in cellular activities of HBE ( a ), A549 ( b ), PC9 ( c ) and H1299 ( d ) cells. Data was shown in the formation of the ratio between experimental group and control group (aMeans P＜0.05,bMeans P＜0.001 )

圖 3 光鏡下 A549 細(xì)胞的 Transwell 結(jié)晶紫染色結(jié)果 ( 結(jié)晶紫染色 ×40 ) a：對(duì)照；b：10 μmol / L 山楂酸；c：20 μmol / L 山楂酸；d：40 μmol / L 山楂酸Fig.3 The crystal violet staining of the transwell experiment of A549 cells under light microscopic ( ×40 ) a: Control group; b: 10 μmol / L MA; c: 20 μmol / L MA; d: 40 μmol / L MA

圖 4 山楂酸對(duì) A549 細(xì)胞遷移的影響 a：平均每高倍鏡視野下的細(xì)胞數(shù)；b：醋酸洗脫并測(cè)量吸光度的統(tǒng)計(jì)結(jié)果 ( 注：aP ＜ 0.05，bP ＜0.001 )Fig.4 The effects of MA in A549 cell migration a: The average cell number per high magnification; b: The absorbance detection after acetic acid elution. Data was shown in the formation of the ratio between experimental group and control group (aMeans P＜0.05,bMeans P＜0.001 )

三、山楂酸對(duì) A549 誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞分化的抑制作用

通過(guò) 10 μmol / L 的山楂酸刺激 A549 細(xì)胞 48 h，將其培養(yǎng)基用于 BMM 細(xì)胞條件培養(yǎng)，TRAP 染色，鏡下觀察破骨細(xì)胞分化情況。TRAP 染色陽(yáng)性的多核巨細(xì)胞被認(rèn)為是破骨細(xì)胞。結(jié)果發(fā)現(xiàn)正常 A549 細(xì)胞的培養(yǎng)上清可明顯誘導(dǎo) BMM 細(xì)胞向破骨細(xì)胞分化，而 10 μmol / L 的山楂酸顯著抑制了 BMM 細(xì)胞向多核巨細(xì)胞的分化 ( 圖 5 )。隨機(jī)抽取 5 個(gè)高倍鏡視野 ( ×100 ) 并計(jì)數(shù) TRAP 陽(yáng)性的多核巨細(xì)胞數(shù)目，發(fā)現(xiàn) 10 μmol / L 的山楂酸抑制了由 A549 誘導(dǎo)的約72% 的破骨細(xì)胞分化 ( 圖 6a )。通過(guò) TRAP 活性試劑盒檢測(cè)破骨細(xì)胞活性并在 570 nm 處測(cè)吸光度后，結(jié)果表明 10 μmol / L 的山楂酸抑制了由 A549 誘導(dǎo)的約84% 的破骨細(xì)胞活性 ( 圖 6b )。這些結(jié)果說(shuō)明山楂酸可顯著抑制由肺癌細(xì)胞誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞分化。

四、山楂酸對(duì) BCL2、MMP2 和 MMP9 的抑制作用研究

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明山楂酸可顯著抑制 BCL2、MMP2和 MMP9 的 mRNA 水平，且這種抑制作用與山楂酸的濃度呈正相關(guān) ( 圖 7 )。進(jìn)一步通過(guò) qRT-PCR 檢測(cè)，本研究發(fā)現(xiàn) 5 μmol / L 的山楂酸即可顯著抑制BCL2 ( P＝0.001 )、MMP2 ( P＝0.032 ) 和 MMP9 ( P＝0.008 ) 的 mRNA 水平 ( P＜0.05 )，而 20 μmol / L 的山楂酸對(duì) BCL2、MMP2 和 MMP9 mRNA 水平的抑制率高達(dá) 95%、65% 和 78% ( 圖 8a～c )。

圖 5 光鏡下 A549 細(xì)胞對(duì)破骨細(xì)胞分化的誘導(dǎo)作用 ( TRAP 染色×40 ) a：對(duì)照；b：10 μmol / L 山楂酸Fig.5 The light microscopic ( ×40 ) showings of osteoclastogenesis induced by A549 cells a: Control group; b: 10 μmol / L MA

圖 6 山楂酸對(duì) A549 細(xì)胞誘導(dǎo)破骨細(xì)胞分化的抑制作用 a：平均每高倍視野下的破骨細(xì)胞數(shù)量對(duì)比；b：TRAP 活性對(duì)比 ( 注：aP ＜ 0.001 )Fig.6 MA inhibited osteoclatsogenesis induced by A549 cells a: The average osteoclasts number per high magnification; b: The TRAP activity comparison. Data was shown in the formation of the ratio between experimental group and control group (aMeans P＜0.001 )

五、山楂酸對(duì) BAX、CASP3 和 CASP8 的促進(jìn)作用研究

本研究結(jié)果顯示山楂酸可顯著促進(jìn) BAX、CASP3 和 CASP8 的 mRNA 水平，且這種促進(jìn)作用與藥物濃度呈正相關(guān)性 ( 圖 7 )。進(jìn)一步通過(guò) qRT-PCR檢測(cè)，發(fā)現(xiàn) 5 μmol / L 的山楂酸即可顯著促進(jìn) BAX ( P＝0.002 )、CASP3 ( P＝0.046 ) 和 CASP8 ( P＝0.019 )的 mRNA 水平，而 20 μmol / L 的山楂酸對(duì) BAX、CASP3 和 CASP8 mRNA 水平的促進(jìn)率為 262%、49%和 61% ( 圖 8d～f )。

圖 7 山楂酸對(duì)下游靶基因 mRNA 水平調(diào)控的 PCR 結(jié)果Fig.7 The PCR results of the downstream of MA in A549 cells

圖 8 山楂酸對(duì) BCL2 ( a )、MMP2 ( b )、MMP9 ( c )、BAX ( d )、CASP3 ( e ) 和 CASP8 ( f ) 的抑制作用。縱坐標(biāo)軸為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的比值 ( 注：aP ＜ 0.05，bP ＜ 0.001 )Fig.8 The inhibition role of MA in the mRNA level of BCL2 ( a ), MMP2 ( b ), MMP9 ( c ), BAX ( d ), CASP3 ( e ) and CASP8 ( f ). Data was shown in the formation of the ratio between experimental group and control group (aMeans P＜0.05,bMeans P＜0.001 )

討 論

已有的研究表明山楂酸可以通過(guò)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[11,14]、抑制腫瘤細(xì)胞 G1 期向 S 期的轉(zhuǎn)化[15]、抑制腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲[9]等多方面發(fā)揮抑制腫瘤的作用。然而，目前關(guān)于山楂酸對(duì)肺癌的研究仍十分有限，僅有 1 例關(guān)于山楂酸促進(jìn) A549 細(xì)胞凋亡的報(bào)道[16]。本研究發(fā)現(xiàn)山楂酸對(duì)正常肺上皮細(xì)胞 HBE無(wú)明顯抑制作用，但可顯著抑制肺腺癌細(xì)胞 A549、PC9 和 H1299 的增殖和遷移；并且，通過(guò) A549 細(xì)胞與 BMM 細(xì)胞的條件共培養(yǎng)，我們發(fā)現(xiàn)山楂酸可顯著抑制由 A549 細(xì)胞誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞分化。進(jìn)一步通過(guò)qRT-PCR 分析發(fā)現(xiàn)，山楂酸可抑制 BCL2、MMP2 和MMP9 的 mRNA 水平并促進(jìn) BAX、CASP3 和 CASP8的 mRNA 水平。

NF-κb 通路是細(xì)胞增殖和侵襲過(guò)程中的關(guān)鍵通路，在腫瘤的增殖、凋亡、侵襲和骨破壞等多個(gè)方面都發(fā)揮重要作用[12-13]。在胰腺癌、膽囊癌等腫瘤中山楂酸可通過(guò)抑制 NF-κb 通路，降低其下游MMP2、MMP9、BCL2 和細(xì)胞周期蛋白 D1 ( Cyclin D1 ) 等因子的表達(dá)，從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲[12,16]，但山楂酸對(duì)肺癌的作用機(jī)制仍不明確。而 MMP2、MMP9 也已被證實(shí)在肺癌細(xì)胞的遷移和侵襲過(guò)程中發(fā)揮重要作用[17-18]。本研究結(jié)果顯示山楂酸可顯著抑制肺癌細(xì)胞的增殖和遷移，并可抑制MMP2、MMP9 和 BCL2 的 mRNA 水平，這說(shuō)明在肺癌細(xì)胞中山楂酸可能可通過(guò)抑制 NF-κb 通路發(fā)揮作用抑制肺癌細(xì)胞的增殖和遷移。

有學(xué)者認(rèn)為：NF-κb 通路在破骨細(xì)胞的分化中也發(fā)揮重要作用，MMP2 和 MMP9 均可促進(jìn)破骨細(xì)胞的分化[19-20]。已有的研究也表明山楂酸可抑制RANKL 誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞分化和骨質(zhì)疏松[12]。腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞分化和骨破壞是腫瘤骨轉(zhuǎn)移灶發(fā)生的重要環(huán)節(jié)，然而，目前尚未有關(guān)于山楂酸調(diào)控腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞分化的研究報(bào)道。本研究通過(guò) A549 細(xì)胞與 BMM 細(xì)胞的條件共培養(yǎng)，首次發(fā)現(xiàn)山楂酸可顯著抑制由肺癌細(xì)胞引起的破骨細(xì)胞分化，并且，這種抑制作用可能是通過(guò)調(diào)控 NF-κb 通路實(shí)現(xiàn)的。因此，本研究也說(shuō)明山楂酸可能可以用于肺癌骨轉(zhuǎn)移的治療。

線粒體凋亡通路是最經(jīng)典的細(xì)胞凋亡通路之一，它的失活在腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移中都發(fā)揮重要作用，并且該通路也是許多化療藥物的治療靶點(diǎn)[21]。本研究結(jié)果顯示山楂酸可顯著抑制多種肺癌細(xì)胞的活性，為研究山楂酸是否是通過(guò)誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞凋亡從而抑制其活性，筆者通過(guò) PCR 檢測(cè)了山楂酸刺激 A549 細(xì)胞后細(xì)胞凋亡相關(guān)因子 BAX、CASP3 和CASP8 的 mRNA 水平，而 BAX、CASP3 和 CASP8均是線粒體凋亡通路中的關(guān)鍵蛋白。已有研究證實(shí)在賁門癌、結(jié)腸癌等腫瘤中山楂酸均可通過(guò)激活線粒體凋亡通路來(lái)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡[22-23]。本研究進(jìn)一步證實(shí)了在肺癌細(xì)胞中，山楂酸可通過(guò)提高BAX、CASP3 和 CASP8 的 mRNA水平，這說(shuō)明山楂酸可能通過(guò)激活線粒體凋亡通路并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡從而抑制肺癌細(xì)胞的活性。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示：山楂酸可顯著抑制肺癌細(xì)胞的增殖和遷移，并抑制由肺癌細(xì)胞誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞分化，而山楂酸對(duì) NF-κb 通路的抑制作用和對(duì)線粒體凋亡通路的促進(jìn)作用可能是其在肺癌細(xì)胞中發(fā)揮作用的重要原因。這些研究結(jié)果表明山楂酸可能可以作為肺癌，特別是肺癌骨轉(zhuǎn)移新的治療藥物。

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( 本文編輯：李貴存 )

Maslinic acid regulates lung cancer cell proliferation, migration and induction to osteoclastogenesis: an in vitro study and a mechanism research

WANG Ting, YANG Xing-hai, HAN Shuai, WEI Hai-feng, WU Zhi-peng, QIAN Ming, XIAO Jian-ru.
Department of Bone Tumor Surgery, Changzheng Hospital, Second Military Medical University, Shanghai, 200003, PRC Corresponding author: YANG Xing-hai, Email: cnspineyang@163.com

Objective To investigate the effects of maslinic acid ( MA ) on lung cancer cell proliferation, migration and the induction role to osteoclasstogenesis, and further explore the possible molecular mechanisms of MA in lung cancer cells. Methods Lung cancer cell lines were treated with MA. Then, the cell proliferation rates were detected by MTS assay, while the migration of the tumor cell was examined by transwell assay. The condition medium from A549 cells stimulated by MA was collected, and then was used in BMM culture to observe the osteoclastogenesis. The mRNA levels of the possible targets of MA were detected by PCR assay. Results MA showed no significant inhibition on HBE cells, however, it significantly suppressed the proliferation and migration of A549, PC9 and H1299 cells with a positive correlation of the MA concentration. 20 μmol / L of MA suppressed the proliferation of A549, PC9 and H1299 cell proliferation with ratios of 29%, 58% and 22%, while the inhibition ratios of 40 μmol / L MA were 68%, 82% and 66% respectively. Furthermore, MA obviously inhibited osteoclast differentiation induced by A549 cells ( P＜0.001 ). In addition, It was found that MA decreased the mRNA level of BCL2, MMP2 and MMP9 which were the downstream of NF-κb pathway, while it increased the mRNA level of BAX, CASP3 and CASP8 which were the key components of the mitochondrial apoptotic pathway. Conclusions MA can significantly suppress proliferation and migration of lung cancer cells, as well as the osteoclastogenesis induced by lung cancer cells. Roles of MA in lung cancer cells are possibly achieved through the NF-κb pathway and the mitochondrial apoptotic pathway.

Maslinic acid; Cell Movement; Osteoclasts; Cell differentiation; Lung neoplasms

10.3969/j.issn.2095-252X.2015.09.012

R734.2

上海市自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目 ( STCSM，12ZR1439200 )；上海市優(yōu)秀青年醫(yī)學(xué)人才培養(yǎng)計(jì)劃 ( XYQ2013099 )

200003 上海，第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長(zhǎng)征醫(yī)院骨腫瘤外科

楊興海，Email: cnspineyang@163.com

2015-06-03 )