李帥 郜勇 王琨 劉偉 宋雨 楊述華 楊操

微小 RNA-383 對骨肉瘤細胞生物學特性的影響

李帥 郜勇 王琨 劉偉 宋雨 楊述華 楊操

金資助項目：國家自然科學基金 ( 81072187 )

目的 觀察微小 RNA ( miR ) -383 對骨肉瘤細胞生物學特性的影響。方法 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染骨肉瘤細胞 ( U-2OS )，檢測對細胞凋亡、增殖的影響，并檢測細胞遷移侵襲能力、克隆形成能力的改變。結(jié)果細胞凋亡情況：空白對照組、無義序列組和實驗組細胞的凋亡率分別為 ( 8.56±1.45 ) %、( 12.6l±1.37 ) %、( 33.20±2.59 ) %，差異有統(tǒng)計學意義 ( P＜0.05 )；細胞遷移實驗：空白對照組、無義序列組和實驗組分別為( 82±5 ) 個、( 68±3 ) 個和 ( 45±7 ) 個，差異有統(tǒng)計學意義 ( P＜0.05 )；細胞遷移與侵襲實驗：空白對照組、無義序列組和實驗組細胞穿膜數(shù)分別為 ( 82±5 ) 個、( 68±3 ) 個和 ( 45±7 ) 個，以及 ( 35±9 ) 個、( 32±4 ) 個和 ( 13±5 ) 個，差異有統(tǒng)計學意義 ( P＜0.05 )；克隆形成實驗：空白對照組、無義序列組和實驗組克隆數(shù)分別為 ( 12.7±4.1 ) 個、( 12.3±3.6 ) 個和 ( 6.4±2.7 ) 個。結(jié)論 抑制 miR-383 使骨肉瘤細胞凋亡增加，使細胞增殖、侵襲與遷移及克隆形成受到抑制。

骨肉瘤；細胞凋亡；基因表達調(diào)控；RNA，腫瘤；微小 RNA-383

骨肉瘤是青少年最常見的惡性腫瘤，其標準治療是外科手術(shù)結(jié)合新輔助化療，但仍有 30% 患者出現(xiàn)腫瘤復發(fā)、惡化，其治療一直是骨科界亟待解決的難題之一[1]。隨著分子靶向治療的出現(xiàn)和發(fā)展，人們開始尋找針對骨肉瘤的分子靶點[2]。

越來越多研究結(jié)果提示，表觀遺傳的改變在骨肉瘤的發(fā)病過程中起重要作用，特別是在間充質(zhì)干細胞向成骨細胞分化過程中起重要作用[3]。miRNAs對細胞、組織的正常增殖、分化調(diào)控有重要作用[4]。研究發(fā)現(xiàn) miRNAs 的異常表達與多種腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，如乳腺癌、淋巴癌、 直腸癌、肺癌、骨肉瘤等[5]。miRNA 作為癌基因或者抑癌基因發(fā)揮作用，主要由其調(diào)控編碼的靶基因決定，但其在骨肉瘤發(fā)生發(fā)展中的作用機制尚不清楚[6]。

前期通過收集四種人骨肉瘤細胞系 ( MG63、U2OS、MNNG / HOS 和 Saos-2 ) 和人成骨細胞系( hFOB )，應(yīng)用 miRNA 表達譜芯片進行掃描篩查，建立了骨肉瘤細胞系的 miRNA 表達譜。本研究選取在骨肉瘤細胞系中呈差異性表達的微小 RNA ( miR ) -383 作為研究對象，對骨肉瘤細胞轉(zhuǎn)染 miR-383，觀察骨肉瘤細胞凋亡、增殖、遷移以及侵襲等生物學行為受到的影響，探討 miR-383 在骨肉瘤中的調(diào)控作用及其相應(yīng)機制。

材料與方法

一、材料

骨肉瘤細胞株 MG63、U2OS、MNNG / HOS 和Saos-2 及成骨細胞 hFOB 1.19 購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心，胎牛血清、RPMI 1640 培養(yǎng)基、DMEM / F12、胰蛋白酶購自美國 Gibco 公司。TaqMan MicroRNA 檢測試劑盒購自美國 Ambion 公司；Lipofectamine 2000、RNA 提取試劑 Trizol 購自美國Invitrogen 公司；miR-383 及無義序列寡核苷酸由廣州市銳博生物科技有限公司合成；Transwell 細胞培養(yǎng)小室購自美國 Corning 公司；細胞凋亡試劑盒購自南京凱基生物。

二、細胞培養(yǎng)

U2OS、MG-63、MNNG / HOS 骨肉瘤細胞用含 10% 胎牛血清、100 U / ml 青霉素、0.1 g / L 鏈霉素的 RPMI 1640 培養(yǎng)基培養(yǎng)，hFOB 1.19 細胞用含10% 胎牛血清、100 U / ml 青霉素、0.1 g / L 鏈霉素的 DMEM / F12 培養(yǎng)基培養(yǎng)，Saos-2 用 1 g / L 鏈霉素的 DMEM 培養(yǎng)。細胞置于 37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中，每 3 天傳代 1 次，用含 0.25% 胰蛋白酶 ( 其內(nèi)含 0.01% EDTA ) 消化，以 1∶3 傳代。

三、反義 miR-383 轉(zhuǎn)染

取處于對數(shù)生長期的 U2OS 骨肉瘤細胞，細胞生長至 70%～80% 融合時，經(jīng)胰酶消化后，用RPMI 1640 培養(yǎng)液重新懸浮后，對細胞進行計數(shù)，按 1×104個 / 孔鋪入 96 孔培養(yǎng)板中。將其分為3 組：( A ) 空白對照組：僅用空白的 Lipofectamine 2000 脂質(zhì)體進行處理；( B ) 無義序列組：加入無義序列和 Lipofectamine 2000 脂質(zhì)體復合物，無義序列為：5'-AGCUCACAGUCACCUCUGAUCU-3'；( C ) 實驗組：加入反義 miR-383 / Lipofectamine 2000 脂質(zhì)體復合物，“反義 miR-383 序列為5'-AGCCACAGUCACCUUCUGAUCU'，進行基因轉(zhuǎn)染。在 37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 12 h 后，用RPMI 1640 培養(yǎng)液代替轉(zhuǎn)染時的培養(yǎng)液。

四、RNA 提取和實時熒光定量 PCR ( qRT-PCR )檢測各組細胞的 miR-383 表達量

按照 RNA 提取試劑盒的操作步驟，提取細胞總 RNA，分析鑒定其濃度和純度后，按照 TaqMan MicroRNA 檢測試劑盒的操作步驟及要求，在羅氏LightCycler?480 實時熒光定量 PCR 系統(tǒng)下進行實時熒光定量 PCR 操作，反應(yīng)條件為：95 ℃ 下 20 s 預變性，95 ℃ 10 s，60 ℃ 20 s，70 ℃ 10 s，40 個循環(huán)，所有反應(yīng)設(shè)立 3 個復孔。

五、流式細胞儀及 Caspase 3 活性檢測骨肉瘤細胞凋亡

常規(guī)消化收集 3 組處于對數(shù)生長期的細胞，用0.25% 的胰酶消化，制備 1 ml 單細胞懸液，調(diào)整待測細胞濃度，濃度為 5×105～1×106個 / ml，離心收集細胞，PBS 洗滌 3 次后，按南京凱基生物有限公司膜聯(lián)蛋白 V- 異硫氰酸熒光素 ( AnneXin V-FITC ) 細胞凋亡試劑盒說明書，將細胞重懸于 500 μl 的結(jié)合緩沖液中，加入 5 μl Annexin V-FITC 和 5 μl 的 PI，輕輕混勻，避光室溫反應(yīng) 15 min，1 h 內(nèi)流式細胞儀檢測細胞凋亡。實驗重復 6 次，以百分數(shù)表示凋亡率。Caspase 3 活性檢測：按 Roche 公司 Caspase 3 Activity Assay 檢測試劑盒進行。

六、 MTT 法檢測細胞增殖

分別收集 A、B、C 組細胞，以每孔 200 μl 細胞懸液接種于 96 孔板 ( 細胞量約為 4000 個 / 孔 )，每組接種 6 孔，置于 37 ℃、5% CO2的條件下培養(yǎng)，分別于 12、24、36、48、72 h 后加入 20 μl的 MTT 溶液 ( 5 g / L )，于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng) 4 h，吸去上清，每孔加二甲基亞砜 ( DMSO ) 150 ml，振蕩10 min 待結(jié)晶溶化后，于酶標儀 ( 490 nm 波長 ) 上讀取處吸光度 ( A ) 值。

七、骨肉瘤細胞遷移實驗與侵襲實驗

按 Coring 公司的產(chǎn)品說明書，將無 Matrigel 包被的 Transwell 小室于 24 孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)。將 3 組細胞用 10 g / L 的牛血清白蛋白 ( BSA ) 進行重懸后，于 Transwell 小室上室每孔加 600 μl 細胞懸液，下室加 600 μl 含 10% FBS 的培養(yǎng)基，每組設(shè)置 3 個復孔，于 37 ℃，5% CO2培養(yǎng) 12 h。每孔隨機選取5 個視野計算細胞數(shù)，實驗重復 3 次。

Matrigel 用 RPMI 1640 培養(yǎng)基以 1∶4 稀釋，每室加 50 μl，覆蓋膜上所有微孔。用含 1.5% 胎牛血清的 RPMI 1640 培養(yǎng)基液調(diào)整細胞濃度為 5×108/ L，加 200 μl 于侵襲小室。置于 24 孔板，下室內(nèi)加含10% 胎牛血清的 RPMI 1640 培養(yǎng)基，培養(yǎng) 24 h。用棉簽擦盡上室基底膠及殘余細胞，甲醇固定、結(jié)晶紫染色計數(shù)，每孔隨機選取 5 個高倍鏡視野 ( ×400 )計數(shù)，實驗至少重復 3 次。

八、克隆形成實驗

實驗分為 3 組，每組接種細胞數(shù) 1×103個于4 g / L 的瓊脂糖凝膠培養(yǎng)基中培養(yǎng)，每 5 天換液1 次，接種后 3 周在顯微鏡下計數(shù)細胞數(shù)＞50 個的克隆數(shù)，實驗重復 3 次。

九、Western blot 實驗

用裂解液裂解細胞后，提取細胞總蛋白，按照western-blot 標準流程操作，簡單總結(jié)為：按濕法將電泳產(chǎn)物轉(zhuǎn) PVDF 膜，5% 脫脂奶粉 4 度 2 h，一抗 4 度孵育過夜，TTBS 洗膜 10 min×3 次，TBS 洗膜 10 min，二抗常溫孵育 2 h，TTBS 洗膜 10 min× 4 次，TBS 洗膜 10 min，ECL 發(fā)光液發(fā)光、壓片、顯影、定影。

十、統(tǒng)計學方法

應(yīng)用 SPSS 14.5 統(tǒng)計軟件分析，采用兩獨立樣本非參數(shù)檢驗。數(shù)據(jù)均以±s 表示。

結(jié) 果

一、骨肉瘤 miR-383 表達情況與轉(zhuǎn)染后骨肉瘤細胞 miR-383 表達量

應(yīng)用 qRT-PCR 檢測 miR-383 表達情況，與成骨細胞 hFOB 1.19 相比，骨肉瘤細胞 MG-63、 Saos-2、U2OS 和 HOS 的 miR-383 表達顯著增加，相對表達量分別為 1.004±0.075、1.479±0.087、1.366±0.112、1.716±0.092、1.683±0.124 ( 圖 1a )。miR-383 在 3 組 U2OS 細胞的相對表達量為：空白對照組為 1.727±0.039，無義序列組為 1.655±0.051，實驗組為 0.973±0.046 ( 圖 1b )。

圖 1 miR-383 表達情況 a：骨肉瘤細胞系 miR-383 的相對表達情況，其中在 U2OS 骨肉瘤細胞中表達水平最高；b：miR-383 轉(zhuǎn)染 U2OS 后，實驗組miR-383 表達水平明顯減少 (aP ＜ 0.05，bP ＜ 0.01 )Fig.1 miR-383 expression a: miR-383 was increased in four OS cell lines compared with that in human osteoblast cell line, with highest expression in U2OS; b: miR-383 expression was decreased after transfecting with anti-miR-383 (aP＜0.05,bP＜0.01 )

二、骨肉瘤細胞凋亡與增殖檢測

收集 3 組細胞按凋亡試劑盒說明書操作檢測，空白對照組、無義序列組和反義 miR-383 組細胞的凋亡率分別為 ( 8.56±1.45 ) %、( 12.6l±1.37 ) %、( 33.20±2.59 ) %，轉(zhuǎn)染 miR-383 反義寡核苷酸鏈組較空白對照組、無義序列組細胞凋亡率明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義 ( P＜0.01 )。應(yīng)用 MTT 法檢測細胞：反義 miR-383 轉(zhuǎn)染的骨肉瘤細胞組生長速度較空白對照組、無義序列組明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義 ( P＜0.05 )，細胞生長曲線見圖 2。

圖 2 骨肉瘤細胞凋亡與增殖情況，實驗組細胞凋亡比例較其它兩組明顯增加，細胞增殖明顯受到抑制 (aP ＜ 0.05，bP ＜ 0.01 )Fig.2 Apoptosis and proliferation in osteosarcoma cells, apoptotic rate in anti-miR-383 group was higher than the other two groups and proliferation was suppressed in anti-miR-383 group (aP＜0.05,bP＜0.01 )

三、骨肉瘤細胞遷移與侵襲實驗

3 組細胞均能夠移行進入下室?？瞻讓φ战M、無義序列組和實驗組 miR-383 組細胞分別為 ( 82± 5 ) 個、( 68±3 ) 個和 ( 45±7 ) 個，組間差異有統(tǒng)計學意義 ( P＜0.05 )。骨肉瘤細胞侵襲實驗：3 組細胞均可穿過鋪有 Matrigel 的濾膜，空白對照組、無義序列組和實驗組 miR-383 組細胞穿膜細胞數(shù)分別為( 35±9 ) 個、( 32±4 ) 個和 ( 13±5 ) 個，差異有統(tǒng)計學意義 ( P＜0.05 ) ( 圖 3a、b ) 。

四、miR-383 抑制細胞克隆形成能力

空白對照組、無義序列組和實驗組 miR-383 組細胞均可見細胞克隆球出現(xiàn)，3 組細胞的每高倍視野形成細胞數(shù)＞50 的克隆數(shù)分別為 ( 12.7±4.1 ) 個、( 12.3±3.6 ) 個和 ( 6.4±2.7 )；實驗組 miR-383 組形成克隆球數(shù)量少，體積小，差異有統(tǒng)計學意義 ( P＜0.05 ) ( 圖 3c )。

圖 3 實驗組細胞遷移能力較其它兩組明顯減少，細胞侵襲能力明顯受到抑制，細胞克隆形成明顯減少 (aP ＜ 0.05 )Fig.3 Transfection of anti-miR-383 significantly suppressed U2OS cell migration, invasion and clony formation (aP＜0.05 )

五、miR-383 靶向調(diào)控 perp 及 Caspase 3 活性測定

與空白對照組、無義序列組相比實驗組，Caspase 3 活性顯著增加差異有統(tǒng)計學意義( P＜0.05 )。通過查詢 Target Scan Human 6.2 及 microrna.org，對比后明確 miR-383 靶向調(diào)控 perp。骨肉瘤細胞中miR-383 高水平表達，結(jié)合于 3'-UTR，抑制 perp 表達。反義轉(zhuǎn)染 miR-383 后抑制其表達，上調(diào) perp 表達，骨肉瘤細胞增殖減少、凋亡增加，無義序列組及對照組的 perp 表達水平無明顯改變 ( 圖 4 )，差異有統(tǒng)計學意義 ( P＜0.05 )。

圖 4 骨肉瘤 perp 表達情況及 Caspase 3 活性測定，實驗組細胞 perp 的 mRNA 和蛋白表達較其它兩組明顯增加，實驗組 Caspase 3 活性明顯增加 (aP ＜ 0.05 )Fig.4 Detection of perp and caspase 3 activity, the expressions of perp mRNA and protein were increased in anti-miR-383 group compared with other two groups and Caspase 3 activity was increased significantly (aP＜0.05 )

討 論

miRNAs 是一類內(nèi)源性的調(diào)節(jié)小 RNA，其長度為 22 個核苷酸，由外顯子 miRNA 及內(nèi)含子 miRNA組成，經(jīng) 2 次酶切后產(chǎn)生成熟的 miRNA。miRNA 互補結(jié)合靶 mRNA 的 3' 端非翻譯區(qū) ( UTR ) 部分，對人 30% 的基因有調(diào)控作用，主要是調(diào)控靶 mRNA 轉(zhuǎn)錄后的表達[7]。目前已發(fā)現(xiàn)多種腫瘤的 miRNA 表達異常，如橫紋肌肉瘤中 miR-26a、miR-29、miR-133b、miR-203、miR-214 表達顯著減少，肺癌中的miR-200、miR-21、miR-135b 表達明顯增加等。學者在骨肉瘤細胞中也發(fā)現(xiàn)類似情況，miR-33、miR-140、miR-215、miR-142-3p，miR-223 及 miR-451在骨肉瘤表達顯著增加，而 miR-126，miR-142-5p及 miR-195 表達明顯減少[8]。

目前 miR-383 在骨肉瘤中的作用機制還不清楚，目前 miR-383 的研究主要集中在喉鱗狀細胞癌、髓母細胞瘤、膠質(zhì)瘤、睪丸胚胎癌及糖尿病等，但其在腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移及抗凋亡中的具體作用機制，目前還不明確[9]。有研究表明 miR-383 可能通過作用于 E2F1 對細胞周期產(chǎn)生影響，同時作用于PRDX3、IGF1R 和 FMRP，進而促進腫瘤生長[10-11]。本研究結(jié)果表明，與成骨細胞相比，骨肉瘤細胞的miR-383 表達水平明顯增加。miR-383 的靶基因為perp，perp 屬于 PMP-22 / gas3 家族，是受 p53 / p63調(diào)控的靶基因，進而對細胞凋亡產(chǎn)生影響，其具有抑制腫瘤、促凋亡作用[12]。骨肉瘤中 miR-383 高水平表達，改變 miR-383 的表達可以調(diào)控 perp 的表達，因此提示 miR-383 通過調(diào)控 perp 表達進而對骨肉瘤的增殖與凋亡中發(fā)揮一定的作用。有學者報道，perp 表達受抑是鱗狀細胞癌發(fā)生的重要事件，而且其表達受抑提示復發(fā)幾率增加、高度惡性[13]。而且學者發(fā)現(xiàn)腫瘤組織的 perp 表達水平與患者的預后有明確關(guān)聯(lián)性，可以作用判斷預后的指標[14]。沉默 miR-383 后，perp 表達增加，同時骨肉瘤細胞凋亡明顯增加、增殖明顯受到抑制，同時轉(zhuǎn)染后的骨肉瘤細胞遷移與侵襲的速度明顯減慢，克隆數(shù)明顯減少，骨肉瘤的腫瘤生物學特性受到抑制。

本研究結(jié)果表明 miR-383 的過表達與骨肉瘤細胞的存活、增殖及侵襲與轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，沉默 miR-383，通過調(diào)控 perp 的表達，可促進骨肉瘤細胞的凋亡、減少骨肉瘤細胞的增殖，減少骨肉瘤細胞的克隆形成，同時可減少骨肉瘤細胞的遷移與侵襲，是骨肉瘤未來靶向治療的一個新靶點，為骨肉瘤治療提供新的方法與途徑。

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( 本文編輯：李貴存 )

Effects of microRNA-383 on biological behaviors of osteosarcom

LI Shuai, GAO Yong, WANG Kun, LIU Wei, SONG Yu, YANG Shu-hua, YANG Cao.
Department of Orthopaedics, Xiehe Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan, Hubei, 430022, PRC Corresponding author: YANG Cao, Email: yangcaom@gmail.com

Objective To investigate effects of miRNA-383 on biological behaviors of osteosarcoma. Methods MiR-383 plasmid vectors were constructed and transfected into osteosarcoma cells. Flow cytometer was used to calculate the apoptotic rate. MTT Cell Proliferation Assay measured the cell proliferation rate. An analysis of cell migration and invasion was performed by Transwell Cell Migration / Invasion Matrigel Assay. Analysis of cell clonogenic ability was performed by Colony formation Assay. Results Apoptotic rate of control group, nonsense group and anti-miR-383 group: ( 8.56±1.45 ) %, ( 12.6l±1.37 ) %, ( 33.20±2.59 ) % with statistical significance ( P＜0.05 ). Migration test of control group, non-sense group and anti-miR-383 group: ( 82±5 ), ( 68±3 ) and ( 45±7 ) with statistical significance ( P＜0.05 ). Migration and invasion test of control group, non-sense group and anti-miR-383 group: ( 82±5 ), ( 68±3 ) and ( 45±7 ) compared with ( 35±9 ), ( 32±4 ) and ( 13±5 ) respectively, with statistical significance ( P＜0.05 ). The clonogenic units of 3 groups: ( 12.7±4.1 ), ( 12.3±3.6 ) and ( 6.4±2.7 ). Conclusions MiR-383 can promote osteosarcoma cells' apoptosis, and restrain proliferation, migration and invasion, and the colony formation.

Osteosarcoma; Apoptosis; Gene expression regulation; RNA, neoplasm; MicroRNA-383

10.3969/j.issn.2095-252X.2015.09.011

R738.1

430022 武漢，華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬協(xié)和醫(yī)院骨科

楊操，Email: yangcaom@gmail.com

2014-10-28 )