侯巨梅, 王玉瑩, 左豫虎, 趙豐舟, 王星茗, 劉 銅

(黑龍江八一農(nóng)墾大學農(nóng)學院植物病理與應用微生物研究所, 大慶 163319)

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玉米彎孢葉斑病菌Clg2基因克隆、序列特征和不同發(fā)育階段表達分析

侯巨梅, 王玉瑩, 左豫虎, 趙豐舟, 王星茗, 劉 銅*

(黑龍江八一農(nóng)墾大學農(nóng)學院植物病理與應用微生物研究所, 大慶 163319)

異源三聚體G信號通路在調(diào)控植物病原真菌的形態(tài)、侵染結構形成和致病力等方面具有重要作用。本研究根據(jù)玉米彎孢葉斑病菌新月彎孢全長cDNA文庫中的EST序列,克隆獲得一個含1 074 bp開放讀碼框(ORF)Gα基因。該基因包含5個外顯子和4個內(nèi)含子, 編碼357個氨基酸,被命名為Clg2。通過序列比對和進化樹分析,證明Clg2蛋白具有Gα蛋白結構特征和保守序列區(qū),與小麥黃斑葉枯病菌(Pyrenophoratritici-repentisPt-1C-BFP)和大斑剛毛座腔菌(Setosphaeriaturcica)中的Gα蛋白相似性高達96%和97%,處于同一分支。采用實時熒光定量PCR技術分析了Clg2基因在病菌不同發(fā)育階段的表達水平,顯示在菌絲中表達水平最低,在分生孢子中表達量最高,暗示Clg2基因在病菌分生孢子形成期起重要作用。上述結果將為開展Clg2蛋白功能研究奠定基礎。

G蛋白; 玉米彎孢葉斑病菌; Gα; 熒光定量PCR

由新月彎孢[Curvularialunata(Wakker) Boedijn]引起的玉米彎孢葉斑病是我國玉米上普遍發(fā)生的一種重要葉部病害,給玉米生產(chǎn)帶來嚴重影響,有時甚至超過玉米大斑病和瘤黑粉病引起的損失[1-3]。近年來隨著針對該病原菌的具有熱帶和亞熱帶血緣的抗性品種的選育和推廣應用,該病害的危害程度明顯降低,然而人們研究發(fā)現(xiàn)該病原菌致病性變異和生理分化現(xiàn)象非常明顯[4-5],表明該病害有潛在大發(fā)生的風險,因此深入研究該菌的致病機理具有重要意義。但目前對該病菌的致病機理研究僅局限于致病因子鑒定和調(diào)控機理研究[6-7],由G蛋白介導的信號通路對該病菌的致病調(diào)控作用尚未見報道。

異源三聚體G蛋白是一類在真核生物中高度保守的蛋白,由α、β和γ3個亞基構成,各亞基由獨立的基因編碼[8-9]。α亞基分子種類最為多樣,分子量在39～46 kD之間,具有一個GDP結合位點。β亞基分子量為36 kD左右,各種G蛋白的β亞基氨基酸序列很相似。γ亞基分子量在7～8 kD之間,各種G蛋白的γ亞基也比較相似但個別的也有差別[10]。當處于靜息狀態(tài)時,Gα上結合著GDP,并與α、β和γ構成穩(wěn)定的三聚體形式。當與G蛋白偶聯(lián)的胞膜表面受體結合配體后,活化的受體催化Gα與GDP發(fā)生解離,并于同一位置結合GTP,引起Gα構象發(fā)生變化,并從三聚體中分離出來,而Gβγ二聚體則可以分別對其相應的下游胞內(nèi)效應器進行調(diào)節(jié)。由于Gα亞基上有GDP/GTP結合位點、受體結合位點、GTPase活性位點等功能位點,通常被認為是G蛋白的功能亞基[11]。研究發(fā)現(xiàn)Gα亞基在植物病原真菌中發(fā)揮重要的生物學功能[12]。然而迄今為止, 在玉米彎孢葉斑病菌還未見Gα蛋白報道,因此本研究擬分離與克隆該基因,對其氨基酸序列和不同發(fā)育時期的表達特征進行分析。研究結果將有助于Gα蛋白的功能解析,為開展由G蛋白介導的信號通路對致病調(diào)控機理研究奠定基礎,也可為防治該病害開發(fā)新型藥劑提供有效的靶位點,有望獲得一種特異、高效的玉米彎孢葉斑病防治的新途徑。

1 材料與方法

1.1 供試菌株和試劑

供試菌株玉米彎孢葉斑病菌(C.lunata)從典型的玉米彎孢葉斑病病株上分離獲得,保存于黑龍江八一農(nóng)墾大學植物病理與應用微生物研究所。大腸桿菌DH5α由本實驗室保存。HiFi 聚合酶、T4 連接酶均購自北京經(jīng)科宏達公司。質(zhì)粒小量制備試劑盒、回收試劑盒、引物合成和序列測序都是由上海捷瑞生物工程技術有限公司提供。Trizol和反轉錄酶購自Introgen公司。

1.2 基因組DNA和RNA提取

將供試菌株置于馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)3 d后,用蒸餾水沖洗,吸水紙吸干收集菌絲, 置于-80 ℃冷凍過夜,通過冷凍干燥除去水分獲得干燥菌絲,用液氮研磨后采用CTAB法提取DNA、Trizol法提取RNA。

1.3 第一鏈cDNA合成和引物設計

以總RNA為模板,利用Oligo(dT)18引物逆轉錄合成第一鏈cDNA。根據(jù)從全長cDNA文庫中獲得的一條EST序列擴增Clg2基因的引物,將該序列提交NCBI采用BLASTX分析設計1對特異引物CNB1: ATGTGCTTTGGACGGAAACCCTCCA;CNB2: TCATAGTATCAAAGCGTTGAGGTTT用于克隆基因的讀碼框。

1.4 基因克隆

分別以第一鏈cDNA 和基因組為模板,CNB1/ CNB2 為引物對,用HiFi 聚合酶進行PCR 擴增。反應條件為:94 ℃預變性5 min;94 ℃ 30 s,55 ℃ 30 s,72 ℃ 2 min,35 個循環(huán);72 ℃延伸5 min。PCR 產(chǎn)物用1.0%(W/V)的瓊脂糖凝膠電泳檢測,分別回收目的片段并連接到pMD19-T 載體上,轉化E.coliDH5α 感受態(tài)細胞,隨機篩選白色菌落,利用M13引物對陽性克隆測序。

1.5 序列分析和系統(tǒng)進化樹構建

利用Pfam27.0 (http:∥pfam.xfam.org/search) 和NCBI CDD (http:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/structure/cdd/wrpsb.cgi)在線軟件對Clg2蛋白的功能結構域進行預測。采用Clustal W2 程序(http:∥www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/)對Clg2氨基酸序列和其他Gα蛋白序列進行比對,并輸出到 GENEDOC軟件, 分析其保守結構域。利用 ProtScale Tool 程序(http:∥cn.expasy.org/tools/protscale.html)采用 Kyte 和Doolittle 的方法[13]對編碼氨基酸序列進行了疏水性/親水性分析,利用 http:∥npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html 網(wǎng)站中Combet 等[14]的方法進行Clg2全序列的二級結構預測。應用http:∥web.expasy.org/compute_pi/ 進行分子量和等電點等預測。使用MEGA5 (http:∥megasoftware.net)軟件的鄰近比較法構建Clg2系統(tǒng)發(fā)育進化樹。

1.6 熒光定量PCR

分別收集在PDA平板培養(yǎng)基上生長7 d的分生孢子、在鋪有玻璃紙的PDA平板上萌發(fā)3、6 h和9 h分生孢子和在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)3 d的菌絲。采用Trizol方法提取5個時期材料的總RNA,反轉錄成cDNA。根據(jù)Clg2 cDNA序列采用Primer 5.0軟件設計引物Clg2ds 5′-GTTGTGCTATTCCTCGTCG-3′和Clg2da 5′-TGGTGTCTGTGGCATTTGT-3′進行擴增,以GAPDH為內(nèi)參基因。PCR反應體系為:10×buffer 2.5 μL,MgCl22.5 μL,2 mmol/L dNTPs 2.5 μL,Taq酶 0.4 μL,50×SYBR Green 0.3 μL,模板cDNA 1 μL,引物各1 μL,用ddH2O補至25 μL。反應程序為:95 ℃ 1 min;95 ℃ 20 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 40 s,40個循環(huán);72 ℃ 10 min。程序結束后導出生成的循環(huán)數(shù)值。試驗重復3次,以分生孢子時期表達量為參照,相對表達量通過2-ΔΔCt的方法進行計算。

2 結果

2.1 基因克隆與結構

以第一鏈cDNA為模板,用CNB1/ CNB2 為引物擴增出一條1 074 bp片段(圖1),與預期片段大小一致。經(jīng)過測序和生物信息學分析,這段序列即為Clg2基因的開放讀碼框,基因登錄號為KJ130018。以基因組為模板,采用相同引物進行擴增時獲得一條特異DNA條帶,測序分析為1 353 bp(圖1)。通過ClustalX 1.8 軟件對所獲的DNA和cDNA 序列比較分析發(fā)現(xiàn):該基因含有5個外顯子和4個內(nèi)含子,其內(nèi)含子的大小分別為110、61、56和52 bp,編碼357個氨基酸。

圖1 Clg2 基因PCR擴增檢測結果Fig.1 Electrophoresis of Clg2 gene by PCR amplification

2.2 序列特征分析

利用Pfam 27.0和NCBI CDD在線軟件對Clg2結構域進行分析,發(fā)現(xiàn)該蛋白質(zhì)與其他來源的G蛋白α亞基蛋白具有GTP/GDP 結合活性位點、ADP-核糖基化位點、質(zhì)膜受體識別與結合位點、胞內(nèi)效應器結合位點等相同的位點,表明該蛋白可能屬于G蛋白α亞基蛋白成員。為了進一步明確其氨基酸特征序列,從NCBI 數(shù)據(jù)庫下載了一些植物病原真菌的G蛋白α亞基的氨基酸序列,通過DNAMAN對氨基酸同源性比對發(fā)現(xiàn)Clg2蛋白與小麥黃斑葉枯病菌(Pyrenophoratritici-repentisPt-1C-BFP)、大斑剛毛座腔菌(Setosphaeriaturcica)、菜豆殼球孢菌(MacrophominaphaseolinaMS6)、斐濟假尾孢菌(Pseudocercosporafijiensis)和綠色木霉(Trichodermavirens)有較高的同源性, 分別為96%、97%、76%、72%和57%。它們在保守結構域都具有相同的氨基酸序列,特別GTP/Mg2+結合位點具有GAGESGKS 氨基酸序列,在G-region 結構域有TNATDT特征性保守序列,在C-terminus有LIL特征性序列(圖2)。

進一步通過scanProsite軟件對Clg2蛋白分析,發(fā)現(xiàn)Clg2蛋白第65～328位氨基酸為蛋白激酶區(qū),第71～79和94位氨基酸為ATP結合位點,第188位氨基酸為質(zhì)子接受位點。通過對編碼氨基酸序列進行疏水性/親水性分析,結果表明,Clg2 第226位亮氨酸(Leu)疏水性最強,第30位賴氨酸(Lys)親水性最強,并且Clg2大部分的氨基酸屬于親水性氨基酸(分值為負值),因此Clg2屬于親水性蛋白。通過二級結構的預測結果發(fā)現(xiàn): Clg2 蛋白由52.10%的α-螺旋、10.36%的β-折疊、4.20%的β-轉角、33.33%的隨機卷曲組成。α-螺旋結構是Clg2 蛋白的主要組成部分,而α-螺旋、β-折疊和β-轉角則散布于蛋白序列中。通過對分子量和等電點預測表明,Clg2分子量為40.9 kD,等電點為5.58。

2.3 系統(tǒng)進化樹分析

利用ClustalX 2.0 軟件將Clg2氨基酸序列與從NCBI GenBank 數(shù)據(jù)獲取的其他植物病原真菌P.tritici-repentisPt-1C-BFP、S.turcica、C.apollinis、P.fijiensis、M.phaseolina、T.virens等的Gα氨基酸序列進行比對分析后,利用MEGA5.0 軟件NJ 法構建了系統(tǒng)進化樹。結果如圖3所示, Clg2蛋白與小麥黃斑葉枯病菌(P.tritici-repentisPt-1C-BFP)和大斑剛毛座腔菌(S.turcica)處于同一分支上,表明親緣關系最近,與斐濟假尾孢菌(P.fijiensis)等親緣關系較遠。

圖2 Clg2蛋白特殊保守結構域比對與分析Fig.2 Alignment and analysis of special conserved motifs of Clg2 protein

圖3 玉米彎孢葉斑病菌Clg2蛋白系統(tǒng)進化樹Fig.3 Phylogenetic tree of Clg2 protein sequences from C.lunata and other sources

2.4 病菌不同發(fā)育階段Clg2 基因表達水平

為了研究Clg2 基因在病菌不同發(fā)育時期的表達水平,利用熒光定量PCR技術檢測Clg2基因在分生孢子、不同萌發(fā)時期的分生孢子和菌絲中的表達量。結果顯示,Clg2基因在5個時期均表達,其中在分生孢子中表達水平最高,其次在萌發(fā)3、6和9 h分生孢子中表達逐漸降低,在菌絲中表達最低(圖4)。

3 討論

G蛋白介導的信號傳導途徑是真核生物中一種非常保守的跨膜信號轉導,它可以介導下游的Ca2+信號途徑、cAMP信號途徑和MAPK信號途徑,調(diào)控病菌的生長發(fā)育和致病性[15-16],因此G蛋白在研究真菌的信號轉導中處于重要的地位。

圖4 實時熒光定量PCR分析病菌不同發(fā)育階段下Clg2基因表達情況Fig.4 Expression of Clg2 gene in different development stages of C.lunata by real-time fluorescence-quantitative RT-PCR

G蛋白是由α、β和γ3個亞基構成,其中Gα被認為是G蛋白的功能亞基,在信號傳導中至關重要。研究發(fā)現(xiàn)Gα蛋白在生物進化過程中高度保守,利用分子生物學技術比較容易獲得其核苷酸序列。目前已經(jīng)從灰葡萄孢菌(Botrytiscinerea)[12, 17]、構巢曲霉(Aspergillusnidulans)[18-19]、粗糙鏈孢菌(Neurosporacrassa)[20]、異旋孢腔菌(Cochliobolusheterostrophus)[21]、稻瘟菌(Magnaporthegrisea)[22]、玉蜀黍黑粉菌(Ustilagomaydis)[23]和尖鐮孢(Fusariumoxysporum)[24]等病原菌中分離和克隆出Gα蛋白。

本研究從玉米彎孢葉斑病菌獲得的Clg2蛋白,通過Pfam27.0和NCBI CDD在線分析它含有Gα蛋白的所有結構域和保守結構域的一些特征性的序列,因此認為屬于Gα蛋白。將Clg2蛋白與其他植物病原真菌Gα蛋白進行多序列比對,發(fā)現(xiàn)它與所有Gα蛋白一樣,在GTP/Mg2+結合位點都具GAGESGKS 氨基酸序列,在G-region 結構域具有TNATDT特征性保守序列,在C-terminus有LIL特征性序列,因此從保守結構和保守結構的特征序列上判斷玉米彎孢葉斑病菌的Clg2蛋白應屬于Gα蛋白。但是在對序列多重比對時發(fā)現(xiàn)菜豆殼球孢和斐濟假尾孢菌在TNATDT和LIL特征性序列區(qū)各相差一個核苷酸,這表明Clg2蛋白親緣關系可能與這兩個病原菌會更遠些。隨后在系統(tǒng)進化樹中也發(fā)現(xiàn)玉米彎孢葉斑病菌的Clg2蛋白與菜豆殼球孢和斐濟假尾孢菌不處于同一個分支上,并離斐濟假尾孢菌較遠,該結果與保守基因序列分析結果一致。

目前在高等真核生物中發(fā)現(xiàn)至少有21種Gα亞基,在多數(shù)絲狀真菌中也有3個Gα亞基,并且根據(jù)它們保守區(qū)序列可以劃分為5種亞型,各亞型間的Gα亞基在功能方面存在一定的差異。例如在異旋孢腔菌(C.heterostrophus)中一種Gα基因可以調(diào)控病菌有性交配和附著胞的形成[21],magA基因在稻瘟菌(M.grisea)中調(diào)控病菌生長、發(fā)育和致病性[22],在玉米大斑病菌中Stga-1基因(一種Gα亞型)可以調(diào)控玉米大斑病菌的致病性、交配、毒素合成及色素的代謝[25],而Stga-2(另一種Gα亞型)推測可能與大斑病菌的有性交配有關[26]。然而Gα在玉米彎孢葉斑病菌中的功能尚無人研究,本文克隆出Clg2基因,并通過熒光定量PCR技術發(fā)現(xiàn)它在分生孢子形成期表達量最高,暗示它可能與分生孢子形成有關。研究發(fā)現(xiàn),玉米彎孢葉斑病菌在自然界中主要以無性繁殖為主,其無性階段產(chǎn)生的分生孢子通過接觸寄主萌發(fā)侵入寄主,在寄主中擴展、繁殖、產(chǎn)生大量的分生孢子。分生孢子可借助介質(zhì)形成再侵染和循環(huán)。因此分生孢子成為該病害發(fā)生和流行的主要影響因子。通過Clg2蛋白研究將有可能尋找到與病菌無性產(chǎn)孢的調(diào)控通路,這將為防治該病害開發(fā)新型藥劑提供有效的靶位點,通過抑制病菌分生孢子產(chǎn)生和降低致病性,可有效地阻止病害的傳播、發(fā)生與危害,為創(chuàng)建持久、有效防治技術提供理論基礎。

[1] 戴法超, 高衛(wèi)東, 王曉鳴,等. 玉米彎孢菌葉斑病的初步研究簡報[J]. 植物保護, 1996, 22(4): 36-37.

[2] 戴法超, 王曉鳴, 朱振東,等. 玉米彎孢菌葉斑病研究[J]. 植物病理學報, 1998, 28(2): 123-129.

[3] 呂國忠, 劉志恒, 何富剛. 遼寧省暴發(fā)一種新病害-玉米彎孢菌葉斑病[J]. 植物保護, 1997, 23(4): 20-23.

[4] Xu S F, Chen J, Liu L X, et al. Proteomics associated with virulence differentiation ofCurvularialunatain maize in China [J]. Journal Integrative Plant Biology, 2007, 49(4): 487-496.

[5] Gao S G, Liu T, Li Y Y, et al. Understanding resistant germplasm-induced virulence variation through analysis of proteomics and suppression subtractive hybridization in a maize pathogenCurvularialunata[J]. Proteomics, 2012, 12(23/24): 3524-3535.

[6] Gao J X, Liu T, Chen J. Insertional mutagenesis and cloning of the gene required for the biosynthesis of the non-host-specific toxin inCochlioboluslunatusthat causes maize leaf spot [J]. Phytopathology, 2014, 104: 332-339.

[7] Liu T, Xu S F, Liu L X, et al. Functional analysis of multi-copy Brn1 gene from the phytopathogenic fungusCurvularialunata[J].Europe Journal of Plant Pathology,2011,131:211-219.

[8] Neves S R, Ram P T, Iyengar R. G protein pathways [J]. Science, 2002, 296: 1636-1639.

[9] Downes G B, Gautam N. The G protein subunit gene families[J]. Genomies, 1999, 62: 544-552.

[10]Strathmann M, Wilkie T M, Simon M I. Diversity of the G-protein family:sequences from five additionalαsubunits in the mouse [J]. Proceedings of the National Academy of Sciences, 1989, 86: 7407-7409.

[11]Clapham D E, Neer E J. G proteinβγsubunits [J]. Annual Review of Pharmacology and Toxicology,1997,37:167-203.

[12]D?hlemann G, Bemdt P, Hahn M. Different signaling pathways involving a G-αprotein cAMP and a MAP kinase control germination ofBotrytiscinemaconidia [J]. Molecular Microbiology, 2006, 59: 821-835.[13]Kyte J, Doolittle R F. A simple method for displaying the hydropathic character of a protein [J]. Journal of Molecular Biology, 1982, 157: 105-132.

[14]Combet C, Jambon M, Deleage G, et al. Geno3D: automatic comparative molecular modeling of protein [J]. Journal Bioinformatics, 2002, 18: 213-214.

[15]Gummer J P A, Trengove R D, Oliver R P. A comparative analysis of the heterotrimeric G-protein Gα, Gβ and Gγ subunits in the wheat pathogenStagonosporanodorum[J]. BMC microbiology, 2012, 12: 131.

[16]Studt L, Humpf H U, Tudzynski B, et al. Signaling governed by G proteins and cAMP is crucial for growth secondary metabolism and sexual development inFusariumfujikuroi[J]. PLoS ONE,2013,8(2):e58185.

[17]Gronover S, Kasulkc C, Tudzynski D, et al. The role of G protein alpha subunits in the infection process of the gray mold fungusBotrytiscinema[J]. Molecular Plant-Microbe Interaction, 2001, 14:1293-1302.

[18]Lafon A, Seo J A, Hart K H, et al. The heterotrimeric G-protein GanB(α)-SfaD(β)-GpgA(γ) is a carbon source sensor involved in early cAMP-dependent germination inAspergillusnidulans[J]. Genetics, 2005, 171: 71-80.

[19]Chang M H, Chae K S, Hart D M, et al. The GanB Gα-protein negatively regulates asexual sporulation and plays a positive role in conidial germination inAspergillusnidulans[J]. Genetics, 2004, 167: 1305-1315.

[20]Kays A M, Rowley P S, Baasiri R A, et al. Regulation of conidiation and adenylyl cyclase levels by the Gαprotein GNA-3 inNeurosporacrassa[J]. Molecular and Cellular Biology, 2000, 20: 7693-7705.

[21]Horwitz B A, Sharon A, Lu S W, et al. A G protein alpha subunit fromCochliobolusheterostrophusinvolved in mating and appressorium formation [J].Fungal Genetics and Biology,1999,26:19-32.

[22]Liu S, Dean R A. G proteinαsubunit genes control growth, development and pathogenicity ofMagnaporthegrisea[J]. Molecular Plant-Microbe Interaction, 1997, 10: 1075-1086.

[23]Regenfelder E, Spellig T, Harlmann A, et al. G proteins inUstilagomaydis:transmission of multiple signals [J]. EMBO Journal, 1997, 16: 1934-1942.

[24]Jain S, Akiyama K, Mac K, et al. Targeted disruption of a G proteinαsubunit gene results in reduced pathogenicity inFusariumoxysporum[J]. Current Genetics,2002,41:407-413.

[25]郝志敏. 玉米大斑病菌G蛋白和磷脂酶C基因的克隆與功能分析[D]. 保定: 河北農(nóng)業(yè)大學生命學院, 2008.

[26]郝志敏,申珅,李志勇,等.玉米大斑病菌Stga-2及其啟動子的克隆與基因表達分析[J].中國農(nóng)業(yè)科學,2010,43(18):3705-3712.

(責任編輯：田 喆)

Cloning, sequence characteristics and expression analysis ofClg2 gene in different development stages ofCurvularialunata

Hou Jumei, Wang Yuying, Zuo Yuhu, Zhao Fengzhou, Wang Xingming, Liu Tong

(Institute of Plant Pathology and Applied Microbiology, College of Agronomy,Heilongjiang Bayi Agricultural University, Daqing 163319, China)

G protein signal pathway plays an important role in regulation of morphology, infection structure formation and virulence of the plant pathogen. To study the regulation mechanism of G protein inCurvularialunata, a Gαgene with an ORF of about 1 074 bp was cloned based on an EST from the full-length cDNA library, which was named asClg2. This gene included 5 exons and 4 introns, and encoded 357 amino acids through comparing genomic DNA and cDNA sequences. Sequence alignment and phylogenetic analysis showed that this protein contained the characteristic conserved sequence like that of other Gαproteins, and shared 96% and 97% similarity with Gα protein fromPyrenophoratritici-repentisPt-1C-BFPandSetosphaeriaturcica, respectively. Expression ofClg2 in different development stages ofC.lunatawas analyzed by fluorescence-quantitative RT-PCR. These results showed that the highest expression level was found in conidia, whereas the lowest in hyphae, which suggested thatClg2 might play a vital role in the formation of conidia, which may provide additional information for the study of the function of Clg2.

G protein;Curvularialunata; Gα; fluorescence-quantitative RT-PCR

2014-11-26

2015-02-14

黑龍江八一農(nóng)墾大學博士啟動基金(B2011-03)

S435.131

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2015.04.013

* 通信作者 E-mail:liutongamy@sina.com