熊軍波 楊青川 蔡化 田宏 張鶴山 劉洋

摘要：6 d齡紫花苜蓿（Medicago sativa L.）幼苗在0、200 mmol/L NaCl處理9 d后，采用雙向電泳分別分離了其根部蛋白組。最終每塊膠中有超過900個蛋白質點被分離，采用MALDI-TOF-TOF/MS質譜技術結合MASCOT軟件在線檢索，成功鑒定21個表達量發(fā)生1.5倍以上變化的蛋白質點，為19種不同的蛋白質。生物信息學分析表明，這些差異表達蛋白質主要參與脅迫防御、碳水化合物和能量代謝、次生代謝、轉錄和翻譯調控、信號傳導和離子轉運等調控途徑。

關鍵詞：紫花苜蓿（Medicago sativa L.）；鹽脅迫；根；蛋白質組

中圖分類號：S551+.7 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）21-5422-07

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.21.057

Comparative Proteomic Analysis of Salt-stress Response of Alfalfa Proteins in Root

XIONG Jun-bo1，YANG Qing-chuan2，CAI Hua1，TIAN Hong1，ZHANG He-shan1，LIU Yang1

（1.Institute of Animal Science， Hubei Academy of Agricultural Science， Wuhan 431700， China；2.Institute of Animal Science of Beijing， Chinese Academy of Agricultural Science， Beijing 100194， China）

Abstract： 6 day old alfalfa （Medicago sativa L.） seedlings were exposed to 0（control），and 200 mmol/L NaCl for 9 days. Proteins extracted from the root of alfalfa seedlings were separated by two-dimensional gel electrophoresis（2-DE）. More than 900 protein spots were detected on each gel，and 21 spots at least one point five-fold differences in abundance were identified by matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight/time-of-flight mass spectrometry （MALDI-TOF-TOF/MS） and MASCOT online. Bioinformatics analysis induced that these proteins were associated with a variety of functions，including stress defense，carbohydrate and energy metabolism，secondary metabolism，transcription and translation related，signaling and ion transport.

Key words：alfalfa（Medicago sativa L.）； salt-stress；root； proteomic

根據聯(lián)合國糧食與農業(yè)組織（Food and Agriculture Organization）的估算，全世界約有3 400萬hm2（灌溉面積的11%）受到不同程度的鹽漬化影響[1]。據農業(yè)部組織的第二次全國土壤普查資料統(tǒng)計，我國現(xiàn)有鹽漬土的面積為0.35億hm2（不包括濱海灘涂），其中已開墾種植的為576.84萬hm2。鹽漬化土壤中高濃度的鹽離子會對植物的正常生理代謝產生影響，如水分缺失、離子毒害、營養(yǎng)失衡、氧化脅迫等，從而導致植物生長減緩，甚至死亡[2]。土壤鹽漬化大大限制了作物生產，威脅到糧食安全，研究作物抗鹽機制，提高作物抗鹽能力，是全球農業(yè)發(fā)展的重要方向。

紫花苜蓿（Medicago sativa L.）為豆科苜蓿屬多年生草本植物，是世界上栽培種植利用最為廣泛的人工牧草，素有“牧草之王”和“飼料皇后”的美稱。紫花苜蓿屬于中等耐鹽堿植物，在電導率范圍為2.0 dS/m和滲透壓在1.5 bars內的土壤中能正常生長，超過此范圍，電導率每上升一個單位，產量下降7%[3]。生理生化研究表明，紫花苜蓿可以通過改變外在形態(tài)、加強活性氧脅迫保護、合成滲透物、離子選擇吸收、隔離和外排、改變細胞壁和細胞膜結構等措施以適應鹽脅迫[4]。這些適應性調節(jié)機制與鹽脅迫下紫花苜?；蚓W絡的特異性表達密切相關，采用各種高通量技術，已鑒定出大量鹽脅迫響應基因[5，6]。然而，這些研究都是基于轉錄水平的差異表達來尋找脅迫應答基因，mRNA只是基因行使功能的中間載體，而蛋白質才是執(zhí)行各種生命活動的主體，且研究表明，蛋白質的表達水平和mRNA水平間相關性不強，因此有必要從蛋白質水平對紫花苜蓿響應鹽脅迫的調節(jié)機制進行研究。近年來，國內外研究者采用蛋白質組學的方法對超過34種植物的抗鹽脅迫蛋白質組學進行了研究，并成功鑒定出大量鹽脅迫響應蛋白質[7]。根系是植物感受多種脅迫傷害的最初位點，對根系響應鹽脅迫的研究有助于更深入地了解鹽脅迫的調節(jié)機制。本研究以紫花苜蓿根系為研究對象，對根響應鹽脅迫的比較蛋白質組學進行分析，以期更深入地揭示紫花苜蓿響應鹽脅迫的調節(jié)機制。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

紫花苜?！爸熊僖惶枴狈N子由中國農業(yè)科學院畜牧研究所牧草研究室提供。挑選籽粒飽滿、無病蟲害種子，用1%次氯酸鈉溶液消毒5 min，然后用蒸餾水沖洗3次。清洗的種子用蒸餾水浸種12 h后，放置于濕潤的濾紙中培養(yǎng)3 d。之后將幼苗移入1/2 Hoagland營養(yǎng)液進行水培，6 d后開始脅迫。將培養(yǎng)的幼苗分為兩組：一組在1/2 Hoagland營養(yǎng)液中培養(yǎng)；另一組在1/2 Hoagland營養(yǎng)液中添加50 mmol/L NaCl適應生長24 h，其后放入終濃度為200 mmol/L NaCl的1/2 Hoagland營養(yǎng)液培養(yǎng)。每兩天更換一次培養(yǎng)液，期間不定時攪拌，培養(yǎng)9 d后同時收割兩組苜蓿根部，液氮保存。

1.2 藥品與試劑

固相pH 梯度干膠條（pH 4-7）、IPG buffer、2D clean-up試劑盒、2D-Quant試劑盒、尿素（Urea）、甘氨酸、CHAPS、丙烯酰胺（Acrylamide）、甲叉雙丙烯酰胺（Bis-Acrylamide）、過硫酸銨（AP）、甘油（glycerol），干膠條覆蓋液，均購至Amersham Biosciences公司；碘乙酰胺、二硫蘇糖醇（DTT）、四甲基乙二胺（TEMED）購自Sigma公司；溴酚藍、蛋白Marker、碳酸鈉、乙酸鈉、硫代硫酸鈉、EDTA二鈉鹽、十二烷基磺酸鈉（SDS）、低熔點瓊脂糖購自BBI（Bio Basic Inc，加拿大）；其他試劑為國產分析純。所有溶液均用Milli-Q制備的純水配制。

1.3 總蛋白質的提取和定量

蛋白質提取方法參照文獻[8]，部分進行調整。稱取0.5 g樣品液氮研磨后，轉入離心管加入3 mL TRIzol （2% DTT）， 振蕩混勻，添加0.6 mL氯仿，振蕩混勻，放置5 min；4 ℃，15 000 r/min離心10 min，去上清，添加0.9 mL無水乙醇，振蕩混勻，放置5 min；4 ℃，15 000 r/min，離心5 min，取上清，加入4.5 mL異丙醇，振蕩混勻，4 ℃放置5 min；此后4 ℃，15 000 r/min離心10 min，去溶液，用6 mL含300 mmol/L鹽酸胍的95%乙醇洗滌沉淀3次；4 ℃，15 000 r/min離心10 min，留沉淀，用6 mL無水乙醇洗滌一次，冷凍干燥。其后加入裂解液[8Murea， 2% CHAPS（W/V），1%DTT（W/V），0.5% IPG buffer（V/V）（pH 4～7） 和 0.002% Bromophenol blue（W/V）]，超聲20 min促溶，4 ℃靜置4 h以上，離心沉淀（4 ℃，40 000 r/min，1 h），吸取上清備用。使用Amersham公司2D-Quant試劑盒對蛋白質進行定量分析，步驟按試劑盒說明進行。

1.4 等電聚焦電泳和SDS-PAGE電泳

使用水化液[8Murea，2% CHAPS（W/V），1%DTT（W/V），0.5%IPG buffe（V/V）（pH 4～7）和0.002% Bromophenol blue（W/V）]稀釋蛋白質溶液，最終將120 mg/450 mL蛋白質溶液上樣到24 cm pH 4～7 IPG膠條上。等電聚焦在Ettan IPGphor II （GE Healthcare）儀器上進行，溫度設置為20 ℃，程序為：30 V，12 h；150 V，1 h；500 V，1 h；1 000 V，1 h；8 000 V，2 h；8 000 Vh 到 40 000 Vh。等電聚焦后膠條立即平衡，首先在含有平衡液[6 mol/L urea， 30% glycerol（W/V），2%SDS（W/V），50 mmol/L Tris-HCl，pH 8.8，1% DTT（W/V）]的平衡液管中水平放置15 min，其后換入含有平衡液的管中水平放置15 min。平衡后的膠條轉移到12%的SDS-PAGE凝膠中進行二向分離，首先在電泳液[250 mmol/L Tris-base，1.92 mol/L glycine和1% SDS（W/V）]中0.2 W/strip運行1 h，其后相同環(huán)境中使用15 W/strip運行到結束。每組試驗設置4次組內重復。

1.5 蛋白染色和圖像分析

凝膠選用銀染，方法參照GE handbook 做適當修改。凝膠首先在含有40%乙醇，10%乙酸的水溶液中固定1 h，其后使用含有30%乙醇，0.2%硫代硫酸鈉（W/V）和6.8%乙酸鈉溶液中敏化30 min。經超純水漂洗3次，每次5 min；后轉入含有2.5 g/L的硝酸銀溶液中銀染20 min，其后使用超純水漂洗2次，每次1 min；轉入顯色液（25 g/L 碳酸鈉，240 ml/L 甲醛）中顯色2次，第1次1 min，第2次4 min。反應完后轉入含有1.46%的EDTA溶液中10 min終止反應，最后使用純水漂洗3次，每次5 min。染色完成的膠用Powerlook 2100XL掃描儀掃描，并使用ImageMasterTM 2D Platinum 6.0軟件分析，包括凝膠圖像的背景消除、點確認、定量和點的匹配等，選取蛋白質差異達1.5倍以上的蛋白質點進行質譜分析。

1.6 蛋白質譜鑒定和分類分析

根據ImageMaste分析軟件結果挖取差異蛋白質點，委托北京華大基因公司進行基質輔助激光解吸/電離飛行時間串聯(lián)質譜（MALDI-TOF-TOF/MS）分析。將所得到的肽片段質量數據運用MASCOT軟件進行在線檢索（http：//www.matrixscience.com），選取NCBI數據庫作為檢索數據庫。鑒定成功的蛋白質點根據aimGo數據庫（http：//www.geneontology.org/）功能注釋進行分類統(tǒng)計。

2 結果與分析

2.1 雙向電泳凝膠圖譜分析和質譜鑒定

分別提取對照組和處理組紫花苜蓿根部蛋白質進行雙向電泳，經銀染后最終電泳圖譜見圖1?；贗mageMaster圖像軟件分析表明，對照組凝膠蛋白質點有（957±35）個，而處理組（200 mmol/L NaCl處理）凝膠上蛋白質有（935±27）個，兩個試驗組內變異系數都在5%以內。軟件匹配和手工匹配相結合，最終處理組和對照組間有725個蛋白質點成功匹配。選取相對豐度（vol%）發(fā)生1.5倍改變的點為差異表達蛋白質點，結合 MALDI-TOF-TOF/MS 分析，Mascot 軟件搜索NCBInr數據庫Green Plants， 最終成功鑒定出21個蛋白質點，為19種不同的蛋白質（表1）。

2.2 差異表達蛋白質的功能分類

基于質譜結果， 將這些蛋白的功能分為以下五大類。

Ⅰ類：脅迫防御類蛋白，共有4個蛋白質點。谷胱甘肽過氧化物酶（Glutathione peroxidase，spot 3）、2個抗壞血酸過氧化物酶（Ascorbate peroxidase，spot 8，18）、病原相關蛋白2（Pathogenesis-related protein 2，spot 12）。

Ⅱ類：碳水化合物和能量代謝，共4個蛋白質點。線粒體蘋果酸脫氫酶（Malate dehydrogenase mitochondrial，spot 6）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenases，spot 14）、線粒體ATP合酶β支鏈2（ATP synthase bate china 2 mitochondrial，spot 1）、核苷二磷酸激酶1（Nucleoside diphosphate kinase 1，spot 21）。

Ⅲ類：次級代謝，共5個蛋白質點。異甘草黃苷2′-甲基轉移酶（Isoliquiritigenin 2′-O-methyltransferase，spot 7）、查爾酮還原酶（Chalcone reductase， spot 13）、3-異丙基蘋果酸脫氫酶（3-Isopropylmalate dehydrogenase，spot 16）、異黃酮還原酶（Isoflavone reductase，spot 11）；乙醇脫氫酶（Alcohol dehydrogenase，spot 17）。

Ⅳ類：轉錄、翻譯和調節(jié)類蛋白，共4個蛋白質點。真核轉錄起始因子5A-2（Eukaryotic translation initiation factor 5A-2，spot 4）、熱激蛋白70 （Heat shock protein 70，spot 5）、RNA結合蛋白（RNA-binding protein，spot 9）、mRNA結合蛋白前體（mRNA binding protein precursor，spot10）。

Ⅴ類：信號傳導和離子轉運相關蛋白，共3個蛋白質點。液泡膜聯(lián)蛋白VCaB42（Vacuole-associated annexin VCaB42，spot 15）、膜聯(lián)蛋白（Annexin，spot 19）、細胞質膜H+-ATP酶（Plasma membrane H+-ATPase，spot 2）。

3 討論

3.1 脅迫防御類蛋白

生物正常的生理代謝過程，如光合成、光呼吸、脂肪酸氧化和衰老等都會產生活性氧（Reactive oxygen species，ROS），但當生物和非生物產生脅迫時，將引發(fā)ROS的迸發(fā)。ROS具有多種功能，一方面，低水平的ROS可作為信號傳導分子，調控植物生長發(fā)育、細胞周期以及細胞程序化死亡、激素合成、生物或非生物的脅迫應答等；另一方面，過量ROS可導致蛋白質、膜脂和其他細胞組分的損傷，對植物的生長產生危害[9]。植物體內有多種ROS清除機制，以維持體內正常的ROS水平。在本研究中，3個過氧化物類酶表達量上調，其中包括2個抗壞血酸過氧化物酶（APX，8、18號）和1個谷胱甘肽過氧化物酶（GPX，3號）。APX和GPX分別以抗壞血酸和谷胱甘肽作為底物，與H2O2的親合力較強，是植物體H2O2重要的清除劑。APX催化H2O2還原反應中產生的單脫氫抗壞血酸，通過谷胱甘肽還原酶途徑被還原為抗壞血酸，而還原型谷胱甘肽作為還原劑參與抗壞血酸的再生，產生的氧化型谷胱甘肽可以通過谷胱甘肽還原酶得到還原，形成抗壞血酸-谷胱甘肽循環(huán)（Ascorbate-glutathione cycle），是植物清除H2O2的最主要途徑。有研究認為，活性氧清除機制是植物抗鹽堿機制的重要組成部分[10]。在本研究中活性氧清除蛋白質在鹽脅迫下表達量均上升，這有利于清除鹽脅迫引起的活性氧迸發(fā)，維持苜蓿細胞內部環(huán)境的穩(wěn)定。

在本研究中還發(fā)現(xiàn)了病原相關蛋白2（Pathogenesis-related protein 2，PR2）在鹽脅迫下表達量上升。病原相關蛋白是一類由真菌、細菌和病毒等病原體入侵誘導產生的抗逆性蛋白質，根據作用和功能的不同將其分為17個家族，本研究中鑒定的差異表達蛋白PR2屬于β-1，3-葡聚糖酶家族，其以探明的功能包括水解真菌性病原菌的細胞壁，參與植物生長發(fā)育的各個階段的調控[11]。在擬南芥（Arabidopsis thaliana）中發(fā)現(xiàn)鹽脅迫下PR5蛋白質表達量下降，而在抗鹽堿能力相對較強的鹽芥（Thellungiella halophila）中，鹽脅迫下PR5蛋白質表達量下降[12]，這表明部分PR蛋白質也參與到鹽脅迫調節(jié)。在此前的研究中還未發(fā)現(xiàn)PR2與鹽脅迫響應相關，其功能還有待深入研究。

3.2 參與碳水化合物和能量代謝的相關蛋白

植物生長發(fā)育過程中需要大量的能量以維持體內正常的生理代謝，這些能量主要通過碳水化合物代謝，如糖酵解（Embden-Meyerhof-Parnas pathway，EMP）和三羧酸循環(huán)（Tricarboxylic acid cycle，TCA）產生。在本研究中，甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase，GAPDH，14號）在鹽脅迫下表達量上升。GAPDH是糖酵解、糖異生和卡爾文循環(huán)過程中的關鍵酶，催化甘油醛-3-磷酸形成1，3-二磷酸甘油酸的可逆反應，是糖酵解（糖異生）中惟一的氧化（還原）反應。此前對水稻的研究表明，抗鹽堿性水稻的材料中GAPDH蛋白表達量顯著高于敏鹽性材料，表明GAPDH的高表達可能與水稻抗鹽堿相關[13]。另有研究表明，非磷酸化GAPDH（NP-GAPDH）可催化糖酵解“旁路”反應，催化依賴于NADP+，將3-磷酸甘油醛氧化為3-磷酸甘油酸，同時伴有NADPH生成的不可逆反應[14]。鹽脅迫下，GAPDH的表達量上升一方面可為機體合成代謝提供還原力NADPH，維持胞質中NADPH的水平，另一方面在磷饑餓或ADP水平低下而無法合成ATP時，可以使碳源順利流經糖酵解途徑，保證逆境條件下碳源流的通暢[15]。本研究中，GAPDH在鹽脅迫下表達量上升可能是苜蓿適應鹽脅迫的調節(jié)機制。

線粒體是植物生成能量的主要細胞器，在本研究中鑒定出2個線粒體內蛋白質表達量發(fā)生改變。線粒體蘋果酸脫氫酶屬于NAD-依賴性MDH，其為三羧酸循環(huán)循環(huán)中的關鍵酶，催化蘋果酸與草酰乙酸之間的可逆轉換，生產ATP，為機體提供能量[16]。線粒體ATP合成酶參與氧化磷酸化和光合磷酸化，在跨膜質子動力勢的推動下合成ATP，將能量用于合成生物中的能量通貨-ATP的能量轉換。這2個蛋白表達量的下降從一個側面表明了鹽脅迫下，紫花苜蓿能量代謝減緩，這與鹽脅迫下光合作用受阻而導致碳水化學物合成減少相關。此外研究還鑒定出1個核苷二磷酸激酶1（NDPK1）在鹽脅迫下表達量降低。NDPK被稱為ATP的管家酶，維持細胞中CTP、GTP、UTP的水平。在植物中NDPK已被證明參與干旱、寒害、熱和鹽脅迫的抗逆中，在水稻小穗期響應鹽脅迫的蛋白質研究中鑒定出該蛋白表達量下調[17]。

3.3 次生代謝相關蛋白質

植物在多條代謝途徑中都會產生乙醇，但當特定外界脅迫時會導致體內乙醇積累，過量乙醇聚合成高活性的有毒分子，攻擊細胞內親核物質如核酸、蛋白和碳水化合物等，最終危害到植物的正常生長[18]。乙醇脫氫酶（ADH，17號）是植物體內主要短鏈醇代謝的關鍵酶，生理學功能為催化伯醇和醛之間的可逆反應。有研究表明，ADH的表達與干旱、低溫、病原菌入侵等生物逆境的應答相關[19]。在本研究中，ADH在鹽脅迫下表達量下降，這與此前在水稻中的研究觀察到的結果相反[20]，這可能與脅迫濃度和植物自身的抗鹽堿差異性相關。

類黃酮化合物是植物合成的一類重要次生代謝產物，目前已知化學結構的有6 000多種，在植物生長發(fā)育中發(fā)揮著重要作用[21]。近期研究表明，類黃酮化合物還參與植物的脅迫防御中，如植物受微生物侵染時其作為植保素在植物體內積累，或作為植物體內活性氧的脫毒系統(tǒng)[22，23]。在鑒定的差異表達蛋白中有2個蛋白質與類黃酮代謝途徑相關，其中包括查爾酮還原酶（13號）和查爾酮還原酶（11號）。查爾酮還原酶是查爾酮合成類黃酮代謝分支的第一步催化酶。查爾酮還原酶是合成植物抗毒素類異黃酮的重要酶。本研究中，這2個蛋白質表達量都呈現(xiàn)出下降的趨勢，這表明鹽脅迫下，類黃酮合成代謝減緩。

在鑒定的蛋白質中，3-異丙基蘋果酸脫氫酶（16號）表達量下升，該蛋白質為異亮氨酸合成蛋氨酸過程中的催化蛋白酶。已有研究表明，異亮氨酸也是苜蓿抗?jié)B透脅迫的因子[24]。本研究中該蛋白質表達量下調，有利于異亮氨酸的積累，可能是紫花苜蓿滲透調節(jié)機制之一。

3.4 參與轉錄調控，蛋白質合成和代謝類的蛋白質

植物感受到外界環(huán)境刺激，通過特定的受體將這一信號傳遞到細胞核，并誘導相關基因的表達來適應外界環(huán)境，在這過程中，受到復雜的轉錄、翻譯和剪切修飾等調控。在鑒定的差異表達蛋白質中，有3個蛋白質參與到轉錄起始和轉錄調控，其中包括1個真核轉錄起始因子5A-2（eIF-5A-2，4號）和2個RNA結合蛋白質。eIF-5A是普遍存在于真核生物和原始細菌中的轉錄啟始因子。已有研究表明，eIF-5A與細胞中的許多生命活動有關，如細胞增殖、蛋白質翻譯、mRNA降解、細胞周期的轉化及細胞衰老與凋亡等[25]。對擬南芥eIF-5A家族成員的分析表明，不同的家族成員參與的轉錄調控與植物不同的生理防御相關，其中eIF-5A-2參與擬南芥受到病毒感染和傷害后的信號傳導，以及通過細胞分裂素信號通路調控擬南芥根木質部的發(fā)育，在細胞的分裂、生長和死亡中發(fā)揮著重要作用[24]。在本研究中，eIF-5A-2在鹽脅迫下表達量上升，表明其表達與鹽誘導相關。

基因表達的轉錄調控中每一步都需要大量的RNA結合蛋白質和RNA相互作用來起穩(wěn)定、保護、組裝和轉移等作用。近年來的研究表明，一些RNA結合蛋白質參與動植物各種脅迫調控并發(fā)揮著重要生理功能，如富含甘氨酸RNA結合蛋白質調控植物逆境誘導反應，許多逆境因子，包括冷害、致傷、干旱、過敏和水逆境等均能誘導其表達量發(fā)生變化[26]。在本研究中mRNA結合蛋白質（10號）在鹽脅迫下表達量下降，而RNA結合蛋白質（9號）表達量則上升，表明鹽脅迫下紫花苜蓿在轉錄水平存在差異性調節(jié)機制。

鹽脅迫會導致植物體內蛋白質錯誤折疊增加，重新建立正常的蛋白質折疊、構象對維持細胞內穩(wěn)態(tài)尤為重要。熱激蛋白70（Hsp70）是重要的分子伴侶，在維持蛋白質構象、阻止蛋白質聚合、重折疊變性蛋白質以及協(xié)助錯誤折疊蛋白質的降解等方面發(fā)揮著重要作用[27，28]。在本研究中，Hsp70（5號）在鹽脅迫下表達量上升，這對維持體內蛋白質正常的生理功能有重要意義。

3.5 信號傳導和離子轉運相關蛋白

Ca2+是植物體內重要的信號分子，在受到多種脅迫時都會誘導細胞基質中Δ[Ca2+]cyt，特定的膜聯(lián)蛋白質（Annexins）通過結合Δ[Ca2+]cyt而進行信息傳遞[29]。Annexins是一個多基因蛋白質，屬于Ca2+依賴性的磷脂結合蛋白質家族成員，通過與磷脂的結合以及與鈣離子的相互作用參與到各種膜有關的過程，其中包括信號傳導、自由基清除、DNA復制和細胞凋亡等過程。目前，最少有3條線支持這一結論的證據：各種生物脅迫都會誘導Annexins表達量發(fā)生改變；改變某些Annexins的表達量將改變植物對非生物脅迫的耐受性；Annexins可能直接參與調節(jié)脅迫激活信號通路[30]。在本研究中，鑒定出2個膜聯(lián)蛋白質表達量上升，分別為膜聯(lián)蛋白質和液泡膜聯(lián)蛋白VCaB42，這表明鹽脅迫下紫花苜蓿信號傳導發(fā)生改變。

將Na+轉運到液泡，減少細胞質中Na+離子濃度是植物抗鹽脅迫的重要機制之一。在本研究中細胞質膜H+-ATP酶（15號）表達量上升。質膜H+-ATPase主要作用是形成跨膜的質子梯度，驅動Na+/H+逆向轉運蛋白質主動運輸，進而將Na+區(qū)隔在液泡中，減少對細胞器的毒害[31]。鹽脅迫下，該蛋白質表達量上升有助于降低細胞基質中鹽離子的濃度，從而減小鹽離子對植物的危害。

4 結論

根是植物感受多種脅迫傷害的最初位點，根對脅迫的敏感程度直接關系到植物的生長，對根系響應鹽脅迫的研究有助于更深入了解鹽脅迫的調節(jié)機制。在本研究中，鑒定出19個不同的蛋白質表達量發(fā)生改變，其中包括14個表達上調蛋白質，5個表達下降蛋白質。這些蛋白質中大部分蛋白質都是功能已知的蛋白質，此前在其他物種抗鹽堿脅迫中也鑒定出，部分蛋白質在此前研究中未見報道，其具體功能還有待進一步驗證。本研究為深入揭示紫花苜蓿響應鹽脅迫的調節(jié)機制奠定了基礎，也為挖掘紫花苜蓿潛在抗鹽堿基因提供了數據。

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