徐鵬超，李戰(zhàn)彪，秦碧霞，謝慧婷，崔麗賢，蔡健和*

(1. 廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院，南寧 530004；2. 廣西作物病蟲(chóng)害生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，南寧 530007)

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番茄抗黃化曲葉病毒病品種在廣西南寧的自然抗病性表現(xiàn)

徐鵬超1,2#，李戰(zhàn)彪2#，秦碧霞2，謝慧婷2，崔麗賢2，蔡健和2*

(1. 廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院，南寧 530004；2. 廣西作物病蟲(chóng)害生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，南寧 530007)

近年來(lái)，廣西番茄黃化曲葉病毒病(TYLCD)發(fā)生較為嚴(yán)重，病原也比較復(fù)雜(發(fā)現(xiàn)4 種病毒且存在復(fù)合侵染現(xiàn)象)，對(duì)廣西的番茄生產(chǎn)造成了很大威脅，種植抗病品種是防治該病的關(guān)鍵措施。本研究對(duì)中國(guó)農(nóng)科院蔬菜花卉所、上海市農(nóng)科院園藝所、浙江省農(nóng)科院蔬菜所、江蘇省農(nóng)科院蔬菜所、北京市農(nóng)林科學(xué)院蔬菜研究中心和廣西大學(xué)提供的43 份抗TYLCD番茄品種在廣西南寧的自然抗病性進(jìn)行了評(píng)價(jià)。采用自然誘發(fā)的方法，病圃的番茄混合感染中國(guó)番茄曲葉病毒與中國(guó)番木瓜曲葉病毒。試驗(yàn)結(jié)果表明，表現(xiàn)高抗的品種有‘浙紅3號(hào)’、‘浙紅4號(hào)’、‘K22’、‘K64’等8個(gè)番茄品種，表現(xiàn)抗病和中抗的品種有‘紅貝貝’、‘春展56’等25 個(gè)品種，表現(xiàn)感病的品種有‘櫻紅1號(hào)’、‘K6’等5 個(gè)品種，表現(xiàn)高感的品種有‘金陵佳玉’、‘蘇粉11號(hào)’等5 個(gè)品種。本試驗(yàn)結(jié)果為抗病番茄品種在廣西乃至全國(guó)的推廣和布局提供參考。

番茄黃化曲葉病毒??； 抗病品種； 自然抗病性

番茄黃化曲葉病(Tomato yellow leaf curl disease，TYLCD)是一類嚴(yán)重危害番茄生產(chǎn)的病害, 引起該病的病原在分類上都屬于雙生病毒科(Geminiviridae)菜豆金色花葉病毒屬(Begomovirus)。在自然條件下，該屬病毒主要通過(guò)煙粉虱(Bemisiatabaci)以持久方式傳播蔓延，因此也稱為粉虱傳雙生病毒(whitefly-transmitted geminivirus，WTGs)[1]。目前，這類病毒已在亞洲、非洲、地中海地區(qū)、中北美洲及加勒比海等地的眾多國(guó)家和地區(qū)造成嚴(yán)重危害，我國(guó)的廣西、廣東、云南、浙江、江蘇、山東、上海、北京等10 多個(gè)省份均有發(fā)生，對(duì)生產(chǎn)已造成嚴(yán)重危害[2-9]。

WTGs侵染番茄后，癥狀主要表現(xiàn)為植株生長(zhǎng)緩慢或停滯，嚴(yán)重矮縮，頂部葉片黃化變小，葉片邊緣向上卷曲，無(wú)法正常開(kāi)花結(jié)果；后期感染，染病植株僅上部葉片和新芽表現(xiàn)癥狀，結(jié)果量減少，果實(shí)變小。該病具有發(fā)病率高、危害大、防治難、傳播效率高等特點(diǎn)。目前，生產(chǎn)上主要的防治措施有：培育無(wú)病壯苗、黃板誘殺煙粉虱、化學(xué)農(nóng)藥防治、換茬輪作，培育抗病品種等，其中培育抗病品種是防治該病的根本。前人已對(duì)番茄品種的抗病性進(jìn)行了較多報(bào)道，田兆豐等[10]綜合分析了20 多個(gè)番茄品種對(duì)番茄黃化曲葉病毒的抗病性，篩選出了3 份抗病品種；矯曉陽(yáng)等[11]利用5種雙生病毒的侵染性克隆對(duì)‘浙雜502’、‘浙粉701’、‘浙粉702’等3個(gè)品種進(jìn)行了抗病性鑒定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這3個(gè)品種對(duì)這5種雙生病毒均具有較好的抗性。孔令娟等[12]對(duì)6 個(gè)抗黃化曲葉病毒病的番茄品種抗性進(jìn)行了評(píng)價(jià)，發(fā)現(xiàn)番茄品種種植地域不同，其抗病性表現(xiàn)會(huì)有所差異。目前，市售的番茄種子有較多的品種均標(biāo)注為抗病品種，然而，由于地域及抗病基因和病毒種類的不同造成番茄品種的抗性表現(xiàn)有較大差異，筆者對(duì)中國(guó)農(nóng)科院蔬菜花卉所等單位提供的抗TYLCD番茄品種在廣西南寧進(jìn)行了煙粉虱自然接種抗病性評(píng)價(jià)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 番茄品種來(lái)源

供試的番茄品種共43個(gè)，其中‘K6’、‘K22’、‘K36’、‘K54’、‘K61’、‘K64’、‘K72’ 由上海農(nóng)科院園藝所提供；‘浙紅1號(hào)’、‘浙紅2號(hào)’、‘浙紅3號(hào)’、‘浙紅4號(hào)’、‘浙櫻粉1號(hào)’、‘浙櫻粉2號(hào)’等由浙江農(nóng)科院蔬菜所提供；‘13H-Z2’、‘13H-Z4’、‘13H-Z5’、‘13H-Z11’、‘13H-Z12’、‘3156’、‘1361’、‘1362’、‘1363’、‘1364’ 由中國(guó)農(nóng)科院蔬菜花卉所提供；‘金陵甜玉’、‘金陵秀玉’、‘金陵寶玉’、‘金陵佳玉’、‘金陵黛玉’、‘蘇粉11號(hào)’、‘蘇粉12號(hào)’、‘蘇粉13號(hào)’、‘JSTY13S41’、‘JSTY13S42’由江蘇農(nóng)科院蔬菜所提供；‘紅貝貝’、‘佳紅8號(hào)’、‘春展56’、‘秋光140’、‘秋光277’由北京市農(nóng)林科學(xué)院蔬菜研究中心提供；‘西大1號(hào)’、‘西大2號(hào)’、‘櫻黃1號(hào)’、‘櫻黃2號(hào)’、‘櫻紅1號(hào)’由廣西大學(xué)提供。感病對(duì)照為‘超級(jí)大明星’(市售)，抗病對(duì)照為‘T11-7’，由南寧市立新公司提供。

1.1.2 試劑及PCR引物

2×TaqMaster Mix 購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司，SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司，PGEM-T Easy Vector 試劑盒購(gòu)自Promega，NaOH為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

PCR引物參考AV494/CoPR[13-14]委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 番茄培育及病毒接種

試驗(yàn)地點(diǎn)為廣西農(nóng)科院植保所網(wǎng)室內(nèi)，網(wǎng)室常年種植有番茄黃化曲葉病毒病病株，且煙粉虱蟲(chóng)量較大。所有的番茄試驗(yàn)材料于2013年9月4日采用穴盤法進(jìn)行育苗，待幼苗長(zhǎng)至5～6 葉期于10月1日移栽至盆中，每個(gè)品種移栽20 株，移栽后，將盆栽苗放置于網(wǎng)室內(nèi)進(jìn)行自然接種，定期調(diào)查植株發(fā)病情況，10月19日進(jìn)行第1 次調(diào)查，10月29日進(jìn)行第2 次調(diào)查。

1.2.2 PCR檢測(cè)及序列分析

采集網(wǎng)室內(nèi)發(fā)病的‘超級(jí)大明星’番茄樣品8份，用NaOH 粗提法進(jìn)行DNA的提取[15]，將提取液用0.1 mol/L Tris-HCl稀釋50 倍進(jìn)行PCR擴(kuò)增。所得PCR產(chǎn)物克隆至PGEM-T Easy Vector，進(jìn)行序列測(cè)定，測(cè)序工作由北京諾賽基因組研究中心有限公司完成。

病情調(diào)查完成后，采集各品種未表現(xiàn)癥狀的番茄葉片各1份(如果一個(gè)品種中有多株未發(fā)病植株則作為混合樣采集)，用NaOH粗提法提取各樣品的總DNA，將提取液用0.1 mol/L Tris-HCl稀釋50 倍進(jìn)行PCR檢測(cè)。

1.2.3 病情調(diào)查與分析

每個(gè)番茄品種調(diào)查20 株，采用Lapidot 和Friedmann[16]的病情分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)記錄病情和計(jì)算病情指數(shù)；按發(fā)病的嚴(yán)重程度劃分為0、1、3、5、7、9共6個(gè)等級(jí)，病情分級(jí)如下：

0級(jí):無(wú)癥狀；

1級(jí):頂端葉片的葉緣輕微發(fā)黃；

3級(jí):羽狀復(fù)葉的小葉末端黃化和輕微卷曲；

5級(jí):多數(shù)葉片黃化，卷曲，邊緣上翹；

7級(jí):葉片顯著黃化，上翹，卷曲，植株矮化；

9級(jí):葉片極度黃化，卷曲，植株嚴(yán)重矮化，甚至停止生長(zhǎng)。

發(fā)病率(%)=(發(fā)病株數(shù)/調(diào)查總株數(shù))×100；

病情指數(shù)(DI)=∑(級(jí)別代表值×本級(jí)病株數(shù))/ (調(diào)查總株數(shù)×最高級(jí)代表值)×100；

抗病評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)(參考葉青靜等[17])：

高抗(HR)：075。

2 結(jié)果與分析

2.1 病情調(diào)查及抗病性評(píng)價(jià)

番茄植株接種后，每周觀察番茄植株的發(fā)病情況，到第3周進(jìn)行第1次調(diào)查，第5周進(jìn)行第2次調(diào)查，計(jì)算各品種的病情指數(shù)并進(jìn)行分析，參考抗病性評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行抗病性鑒定(結(jié)果見(jiàn)表1)。

接種3 周后，除抗病對(duì)照未表現(xiàn)癥狀外，其余各番茄品種均表現(xiàn)出番茄黃化曲葉病毒病的典型癥狀；接種5 周后(表1)，各番茄品種均有發(fā)病，發(fā)病最為嚴(yán)重的為‘金陵佳玉’與‘蘇粉11號(hào)’，病情指數(shù)分別達(dá)到100與81.94；其余各供試品種病情指數(shù)在3.47～79.17。其中感病對(duì)照‘超級(jí)大明星’發(fā)病率達(dá)100 %，病情指數(shù)達(dá)到73.61，抗病對(duì)照‘T11-7’發(fā)病率為5 %，病情指數(shù)為0.69。

從表1可以看出，攜帶Ty-3a基因的番茄品種抗性最好，大部分表現(xiàn)高抗，但也有例外，‘浙紅1號(hào)’等4個(gè)品種表現(xiàn)抗病和中抗，‘K6’和‘蘇粉11號(hào)’表現(xiàn)感病和高感；攜帶Ty-1/Ty-3 和Ty-3基因的番茄品種抗性表現(xiàn)中等；而攜帶Ty-2 基因的番茄品種抗性表現(xiàn)較差，表現(xiàn)抗、中抗、感病甚至高感。

表1 番茄品種對(duì)番茄黃化曲葉病抗性評(píng)價(jià)結(jié)果

2.2 病毒種類分子鑒定

在自然接種區(qū)共采集8份感病的‘超級(jí)大明星’番茄植株葉片樣品，提取總DNA后，用AV494/CoPR引物進(jìn)行擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后連接至載體進(jìn)行序列測(cè)定，測(cè)序結(jié)果經(jīng)GenBank，BLASTN分析表明，感病植株均為中國(guó)番茄曲葉病毒(TomatoleafcurlChinavirus，ToLCCNV)與中國(guó)番木瓜曲葉病毒(PapayaleafcurlChinavirus, PaLCuCNV)復(fù)合侵染。

2.3 未表現(xiàn)癥狀番茄植株的PCR檢測(cè)

各番茄品種中部分未表現(xiàn)癥狀的16 份番茄樣品PCR檢測(cè)結(jié)果表明，‘浙紅1號(hào)’、‘櫻粉1號(hào)’等未顯癥的番茄品種也攜帶病毒，僅有‘金陵甜玉’等幾個(gè)品種未檢測(cè)出病毒(圖1)。

圖1 部分未顯癥番茄植株病毒檢測(cè)結(jié)果Fig.1 Electrophoretic analysis of PCR products from partial tomato plants

3 結(jié)論與討論

煙粉虱傳雙生病毒(WTGs)在自然界由于基因重組突變?nèi)菀讓?dǎo)致病毒變異，從而引起品種抗性喪失，導(dǎo)致病害暴發(fā)流行[18]。據(jù)報(bào)道，世界上引起番茄黃化曲葉病毒病的病原超過(guò)57種，侵染我國(guó)番茄的雙生病毒至少有10種[19]。江蘇、北京等地的番茄黃化曲葉病毒病主要病原為番茄黃化曲葉病毒(Tomatoyellowleafcurlvirus，TYLCV)[6，9]，浙江省主要病原為TYLCV和臺(tái)灣番茄曲葉病毒(TomatoleafcurlTaiwanvirus，ToLCTwV)[7]，廣西番茄雙生病毒發(fā)生頻率最高的是PaLCuCNV和ToLCCNV兩種。試驗(yàn)結(jié)果表明，各番茄品種在廣西南寧的抗性表現(xiàn)與其在品種提供單位所在地的表現(xiàn)差異較大，上海農(nóng)科院與浙江農(nóng)科院提供的‘K22’、‘浙紅3號(hào)’等8個(gè)番茄品種表現(xiàn)為高抗，‘紅貝貝’、‘春展56’等25 個(gè)番茄品種僅表現(xiàn)抗病和中抗， ‘櫻紅1號(hào)’、‘K6’ ‘金陵佳玉’、‘蘇粉11號(hào)’等表現(xiàn)感病甚至高感。

番茄品種所攜帶的抗病基因與番茄品種的抗病性密切相關(guān)，含有Ty-1、Ty-2、Ty-3、Ty-4及Ty-5其中1 個(gè)抗性基因的番茄品系，對(duì)番茄黃化曲葉病毒病都有一定抗性，但抗性水平不等[16]。本研究中上海農(nóng)科院與浙江農(nóng)科院的番茄品種普遍攜帶Ty-3a抗性基因，江蘇農(nóng)科院的番茄品種除‘蘇粉11號(hào)’與‘蘇粉13號(hào)’攜帶Ty-3a外，其余品種材料均攜帶Ty-2基因，從試驗(yàn)結(jié)果可以看出，攜帶Ty-3a基因的番茄品種普遍對(duì)PaLCuCNV和ToLCCNV有較好的抗性，攜帶Ty-3 基因和攜帶Ty-1/Ty-3 基因的番茄品種對(duì)PaLCuCNV和ToLCCNV也表現(xiàn)出了較好的抗性，攜帶Ty-3 基因的番茄品種對(duì)PaLCuCNV有較好抗性；另外，攜帶Ty-2基因的番茄品種部分表現(xiàn)高感，部分表現(xiàn)中等及以上抗性，該研究結(jié)果與矯曉陽(yáng)等[11]研究結(jié)果部分吻合，但含有Ty-3a的‘蘇粉11號(hào)’和‘K6’抗性表現(xiàn)較差，原因還有待查明。

本研究對(duì)部分未顯現(xiàn)癥狀的番茄植株進(jìn)行了PCR檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果表明，這些番茄植株雖然未顯現(xiàn)癥狀，但是同樣受到病毒侵染，未發(fā)現(xiàn)免疫的番茄品種。

由于參試番茄株數(shù)偏少，接種壓力偏大，也未進(jìn)行測(cè)產(chǎn)，試驗(yàn)結(jié)果不一定完全反映各品種在田間的自然抗耐病性，僅供有關(guān)育種部門參考。

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Natural resistance of TYLCD-resistant tomato varieties in Nanning,Guangxi

Xu Pengchao1,2, Li Zhanbiao2, Qin Bixia2, Xie Huiting2, Cui Lixian2，Cai Jianhe2

(1. College of Agriculture, Guangxi University, Nanning 530004，China; 2. Key Laboratory of Biology for Crop Diseases and Insect Pests，Institute of Plant Protection, Guangxi Academy of Agricultural Sciences, Nanning 530007, China)

Tomato yellow leaf curl disease (TYLCD) occurred seriously and cause severe economic losses in Guangxi during recent years. Application of resistant variety was the best way to control this disease. In this study, the natural resistances of 43 TYLCD-resistant tomato varieties collected from Chinese Academy of Agricultural Sciences, Shanghai Academy of Agricultural Sciences, Zhejiang Academy of Agricultural Sciences, Beijing Academy of Agricultural Sciences, Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences and Guangxi University were determined by the methods ofBemisiatabaciinoculation naturally in Nanning City, Guangxi Zhuang Autonomous Region. The diseased tomato were mix-infected byTomatoleafcurlChinavirus(ToLCCNV)andPapayaleafcurlChinavirus(PaLCuCNV) in diseased nursery.The result showed that 8 varieties (including ‘Zhehong 3’, ‘Zhehong 4’,‘ K22’, ‘K64’ etc.) were highly resistant to TYLCD ; 25 varieties were resistant and moderately resistant, 5 varieties were susceptible, and 5 varieties were highly susceptible. The results could provide a theoretical reference for the extension of these TYLCD-resistant tomato varieties in Guangxi and other regions of China.

tomato yellow leaf curl disease； TYLCD-resistant tomato varieties； natural resistance

2014-03-21

2014-06-23

公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(xiàng)(201003065)；廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技發(fā)展基金(桂農(nóng)科2013JQ19)；國(guó)家國(guó)際科技合作項(xiàng)目(2012DFA31220);廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院基本科研業(yè)務(wù)專項(xiàng)(桂農(nóng)科2011YZ15);廣西作物病蟲(chóng)害生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室基金(13-051-47-ST-4);廣西特聘專家專項(xiàng)

S 432.21

B

10.3969/j.issn.0529-1542.2015.02.037

* 通信作者 E-mail： caijianhe@gxaas.net

# 對(duì)本文有同等貢獻(xiàn)，并列為第一作者