劉淑華，施必富，葛賞書，楊保軍*，劉澤文

(1. 中國水稻研究所水稻生物學國家重點實驗室, 杭州 310006；2. 南京市六合區(qū)冶山鎮(zhèn)農(nóng)業(yè)服務中心,南京 211524； 3. 南京農(nóng)業(yè)大學植物保護學院，農(nóng)業(yè)部華東作物有害生物綜合治理重點實驗室, 南京 210095)

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不同地區(qū)灰飛虱對吡蟲啉的抗性

劉淑華1，施必富2，葛賞書3，楊保軍1*，劉澤文3

(1. 中國水稻研究所水稻生物學國家重點實驗室, 杭州 310006；2. 南京市六合區(qū)冶山鎮(zhèn)農(nóng)業(yè)服務中心,南京 211524； 3. 南京農(nóng)業(yè)大學植物保護學院，農(nóng)業(yè)部華東作物有害生物綜合治理重點實驗室, 南京 210095)

為了明確全國不同稻區(qū)灰飛虱對吡蟲啉的抗藥性水平及其抗性機制，2012年采用點滴法測定了16個灰飛虱田間種群對吡蟲啉的抗性倍數(shù)和3種增效劑在10個抗性種群中對吡蟲啉的增效作用。結果表明，安徽安慶、合肥、江蘇南京、鹽城和無錫5個地區(qū)種群達到高抗水平(抗性倍數(shù)為74.1～91.2)；浙江杭州、臺州、湖州3個種群達到中等水平抗性(抗性倍數(shù)為35.8～47.7)，福建福州和廣東廣州達到低水平抗性(抗性倍數(shù)為18.4～21.3)，其他地區(qū)種群處于敏感性下降階段。增效劑增效結果表明，氧化胡椒基丁醚(PBO)和磷酸三苯酯(TPP)在5個高抗種群和2個低抗種群中對吡蟲啉均具有增效作用，表明P450單加氧酶和羧酸酯酶是抗性產(chǎn)生的主要代謝機制，而3個中抗種群中，僅PBO對吡蟲啉表現(xiàn)出顯著的增效作用，說明這3個種群僅有P450單加氧酶是其抗性上升的主要代謝機制。順丁烯二酸二乙酯(DEM)在測定的10個種群中對吡蟲啉均沒有增效作用，說明谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶沒有參與其抗性上升。建議在中等水平至高水平抗性地區(qū)暫停使用吡蟲啉防治灰飛虱。

灰飛虱； 吡蟲啉抗性； 增效作用； 生化機制

灰飛虱[Laodelphaxstriatellus(Fallén)]屬半翅目、飛虱科，主要分布于從菲律賓至西伯利亞一帶的亞洲和歐洲溫帶地區(qū)[1]，我國各水稻種植區(qū)均有發(fā)生。該蟲除以成、若蟲直接刺吸為害水稻、小麥等作物外，還傳播水稻條紋葉枯病、水稻黑條矮縮病、小麥叢矮病和玉米粗縮病等病毒病，從而造成水稻、小麥和玉米產(chǎn)量損失，發(fā)生嚴重時導致顆粒無收[2-5]。在我國20世紀90年代之前灰飛虱尚屬于次要害蟲，一般不需要專門防治。然而自2000年以后，由于沒有理想的抗病品種和防治病毒病的特效藥劑，灰飛虱傳毒引起的病毒病給我國長江中下游稻區(qū)水稻產(chǎn)量帶來了嚴重損失。為了控制病毒病的傳播，生產(chǎn)上通常采用“治蟲防病”的策略來挽回產(chǎn)量損失，主要使用化學殺蟲劑防治該蟲。由于技術指導不到位，化學農(nóng)藥濫用，使灰飛虱對多種殺蟲劑產(chǎn)生了抗性，有報道表明其對有機氯、有機磷及氨基甲酸酯類殺蟲劑產(chǎn)生了不同程度的抗性[6-8]。Sone等[9]曾報道對殘殺威高抗的室內(nèi)灰飛虱品系對吡蟲啉具有中等水平抗性。吡蟲啉(imidacloprid)是一種氯化煙堿類殺蟲劑，對飛虱、粉虱、蚜蟲等害蟲具有優(yōu)異的防治效果，其不僅具有觸殺活性，還有極好的內(nèi)吸活性，20世紀90年代初期被引入我國，因具有高殺蟲活性、持效期長及卓越的內(nèi)吸活性等優(yōu)點而迅速成為防治褐飛虱等刺吸式口器害蟲的當家品種[10-11]。我國長江流域稻區(qū)水稻種植結構復雜多樣，實行稻、麥輪作制度面積廣，使得稻田褐飛虱、白背飛虱和灰飛虱3種稻飛虱經(jīng)常混合發(fā)生。吡蟲啉在各地很長時間被作為田間防治飛虱類害蟲的首選或必選藥劑，使田間稻飛虱長期處于高水平的吡蟲啉選擇壓力之下，導致了2005-2006年田間褐飛虱對吡蟲啉抗性水平劇增，發(fā)生數(shù)量急劇增加從而引起水稻大面積減產(chǎn)[12]。之后由于連續(xù)數(shù)年監(jiān)測表明我國田間褐飛虱對吡蟲啉的抗性達高水平以上，農(nóng)業(yè)部發(fā)布通知要求暫停使用吡蟲啉來防治褐飛虱[13]。盡管如此，由于吡蟲啉對白背飛虱具有的良好效果使其仍被廣泛使用。在防治白背飛虱的同時，田間混合發(fā)生的灰飛虱也處于吡蟲啉的選擇壓力下。國外Endo等[14]較早報道了灰飛虱對吡蟲啉的抗性監(jiān)測結果，發(fā)現(xiàn)于1992-1994年采自日本的2個種群、越南的1個種群和中國的2個種群(浙江富陽和云南景洪)對吡蟲啉尚敏感。我國科研人員于2006-2008年對江蘇建湖、武進、無錫和浙江湖州的灰飛虱的抗性監(jiān)測表明，其對吡蟲啉已有高水平抗性[15-18]，而其他地區(qū)灰飛虱對吡蟲啉的抗性現(xiàn)狀目前還不清楚。關于其抗性機制報道也較少，僅有報道與P450單加氧酶和酯酶活性以及乙酰膽堿酯酶靶標不敏感性有關[18-19]。因此，開展不同地區(qū)灰飛虱對吡蟲啉的抗藥性監(jiān)測及其機制探索十分必要，為制定灰飛虱區(qū)域治理策略提供理論依據(jù)，并可以據(jù)此建立多點多樣治理的全國性布局。本文采用點滴法，測定了國內(nèi)11個省(直轄市)16個地區(qū)的水稻田灰飛虱種群對吡蟲啉的抗藥性水平，明確灰飛虱田間種群對吡蟲啉的抗性現(xiàn)狀。利用3種增效劑氧化胡椒基丁醚(PBO)、磷酸三苯酯(TPP)和順丁烯二酸二乙酯(DEM)在吡蟲啉對10個田間種群毒力測定中的增效作用，初步研究了不同地區(qū)灰飛虱種群的抗性生化機制的異同，為灰飛虱的綜合治理提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試蟲源及飼養(yǎng)

敏感種群(Sus)來自江蘇省農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所，于2001年采集于江蘇省農(nóng)科院水稻試驗田，不接觸任何殺蟲劑室內(nèi)連續(xù)飼養(yǎng)130余代。田間種群于2012年5-6月采自國內(nèi)11個省(直轄市)16個地區(qū)水稻田，每種群初始試蟲為800～1 200頭高齡若蟲或成蟲，各種群采集信息見表1。飼養(yǎng)方法參照王利華等[17]，分別在‘武育粳3號’3～5葉秧齡稻苗上分批產(chǎn)卵2 d，然后在(25±1)℃、相對濕度70 %±10 %、光周期L∥D=14 h∥10 h的人工氣候箱中飼養(yǎng)，用F1代羽化后2～3 d未交配的長翅雌成蟲作為生物測定試蟲。

表1 灰飛虱的采集信息

續(xù)表1 Table 1(Continued)

種群Populations采集點Location經(jīng)緯度Longitudeandlatitude采集時間/年?月?日CollectiontimeAQ安徽安慶AnqingCity，Anhui30．31°N，117．02°E2012?06?16HF安徽合肥HefeiCity，Anhui31．52°N，117．17°E2012?06?16NJ江蘇南京NanjingCity，Jiangsu32．03°N，118．46°E2012?06?16YC江蘇鹽城YanchengCity，Jiangsu33．38°N，120．13°E2012?06?16WX江蘇無錫WuxiCity，Jiangsu31．34°N，120．18°E2012?06?16HuZ浙江湖州HuzhouCity，Zhejiang30．52°N，120．06°E2012?06?24HaZ浙江杭州HangzhouCity，Zhejiang30．16°N，120．10°E2012?06?24TZ浙江臺州TaizhouCity，Zhejiang28．41°N，121．27°E2012?06?24FZ福建福州FuzhouCity，F(xiàn)ujian26．05°N，119．18°E2012?05?06GZ廣東廣州GuangzhouCity，Guangdong23．16°N，113．23°E2012?05?04CQ重慶ChongqingCity29．35°N，106．33°E2012?05?11GY貴州貴陽GuiyangCity，Guizhou26．35°N，106．42°E2012?05?12KM云南昆明KunmingCity，Yunnan25．04°N，102．42°E2012?05?14

1.2 供試藥劑

95%吡蟲啉原藥，江蘇克勝集團生產(chǎn)；氧化胡椒基丁醚(PBO)，分析純，Sigma公司產(chǎn)品；磷酸三苯酯(TPP)，分析純，北京生化制劑廠產(chǎn)品；順丁烯二酸二乙酯(DEM)，分析純，上海生化制劑廠產(chǎn)品。

1.3 毒力及增效作用測定

生測方法采用Nagata[20]的微量點滴法并加以改進。將吡蟲啉用丙酮稀釋成5～6個系列濃度，試蟲用CO2麻醉25～30 s，然后用自動微量點滴儀(Burkard Manufacturing Co. Ltd, Richmansworth，UK)將藥液點滴在前胸背板上，點滴量為0.04 μL/頭。每處理試蟲數(shù)為15頭，重復4次，用丙酮點滴作對照。處理后的試蟲移入有‘武育粳3號’12～15 d秧齡稻苗4～5株并用人工基質(zhì)固定的飼養(yǎng)杯中，然后置于飼養(yǎng)條件為溫度(27±1)℃、光周期 L∥D=16 h∥8 h的人工氣候箱飼養(yǎng)，24 h檢查結果。以輕觸蟲體無明顯反應者為死亡。3種增效劑PBO、TPP和DEM活體增效作用測定時，先按2 μL/頭的劑量點滴1種增效劑，1 h后再點滴吡蟲啉及溶劑丙酮，其他處理方法均與前述相同。

1.4 統(tǒng)計分析方法

采用DPS 14.1計算毒力回歸方程、LD50及95%置信區(qū)間，以95%置信區(qū)間不重疊作為判斷不同殺蟲劑間毒力差異顯著的標準?？剐员稊?shù)(resistance ratio, RR)=田間種群的LD50/敏感品系的LD50?？剐运椒旨墭藴蕝⒖忌驎x良等報道[21]定義為：RR<3時為敏感；3≤ RR<5時為敏感性下降；5≤ RR<10時為低水平抗性；10≤ RR<40時為中等水平抗性；40≤ RR<160時為高水平抗性；≥160倍時為極高水平抗性。計算增效比(synergism ratio, SR)來評價活體增效作用，SR=藥劑單用時的LD50/用增效劑預處理后的LD50。

2 結果與分析

2.1 不同地區(qū)灰飛虱種群對吡蟲啉的抗性比較

16個灰飛虱種群對吡蟲啉的抗性監(jiān)測結果表明(圖1)，各地區(qū)種群抗性倍數(shù)(RR)各不相同。其中一些相近地域種群RR呈現(xiàn)出相近趨勢，如安徽和江蘇2省的5個種群RR為74.1～91.2(達到高水平抗性)；浙江杭州、臺州和湖州3個種群RR分別為41.5、47.7和35.8(剛達到高水平抗性或接近高水平抗性)；福建福州、廣東廣州和云南昆明3個種群RR為11.1～21.3(處于中等水平抗性)。其他如天津、山東臨沂、重慶和貴州貴陽4個種群RR為7.1～8.9(低水平抗性)，遼寧盤錦種群為RR為4.4(敏感性下降)。

為了開展不同抗性種群抗性機制的差異研究，將抗性水平達中等和高水平中的10個種群按RR值接近程度，人為進行分組(圖1)。將抗性倍數(shù)為74.1～91.2的安徽安慶、合肥、江蘇南京、鹽城和無錫5個種群歸于高抗種群，抗性倍數(shù)處于35.8～47.7的浙江杭州、臺州和湖州3個種群歸于中抗種群，抗性倍數(shù)為18.4～21.3的福建福州和廣東廣州種群歸于低抗種群，分別進一步進行不同增效劑對吡蟲啉的活體增效試驗。

圖1 16個灰飛虱田間種群對吡蟲啉的抗性水平Fig.1 Resistance level to imidacloprid in sixteen populations of Laodelphax striatellus

2.2 3種增效劑在10個灰飛虱田間種群中對吡蟲啉的增效作用

3種增效劑在灰飛虱敏感品系(Sus)中的增效作用均不明顯(圖2)，SR為0.88～1.03(數(shù)據(jù)未在圖中顯示)。當用PBO預處理后，測定的3個種群組的灰飛虱(共10個種群)對吡蟲啉均有增效作用，抗性倍數(shù)顯著減小，SR為2.17～4.64，表明所測的10個種群抗性水平上升均與P450單加氧酶活性升高有關。用TPP預處理后，測定的3個種群組的灰飛虱只有高抗組和低抗組的灰飛虱(7個種群)對吡蟲啉有明顯的增效作用，抗性倍數(shù)顯著減小，SR為1.48～2.03，表明這7個灰飛虱種群抗性上升與酯酶活性增強有關，而TPP在中抗組的3個種群(浙江湖州、杭州和臺州)中對吡蟲啉沒有顯示出增效作用，SR僅為0.99～1.05，表明這3個種群的羧酸酯酶沒有促進其產(chǎn)生抗性。此外，DEM在所測定的10個種群中對吡蟲啉均沒有顯示出增效作用，SR為0.95～1.05，說明在這10個灰飛虱種群中谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶與其對吡蟲啉的抗性產(chǎn)生無關。

圖2 PBO、TPP和DEM在10個抗性灰飛虱田間種群中對吡蟲啉的增效作用Fig.2 Synergism of PBO, TPP, and DEM on imidacloprid in 10 resistant field populations of L.striatellus

3 討論

害蟲對殺蟲劑的抗性現(xiàn)狀調(diào)查是害蟲綜合防治中殺蟲劑選用的重要依據(jù)。在我國盡管由于褐飛虱對吡蟲啉產(chǎn)生嚴重抗性問題被暫停用于防治該蟲，但其對白背飛虱具有良好防治效果，生產(chǎn)上仍然被作為備選藥劑之一來防治白背飛虱，使得田間灰飛虱仍可能處于吡蟲啉的選擇壓力下，存在抗性上升風險。最早對灰飛虱抗性監(jiān)測報道是利用點滴法證實其對馬拉硫磷產(chǎn)生了抗性[22]。國外20世紀90年代在吡蟲啉獲得應用之后不久Sone等[9]和Endo等[14]監(jiān)測到日本、越南以及我國云南、浙江的5個灰飛虱種群對吡蟲啉均尚處于敏感狀態(tài)。我國早期對此方面報道較少，Gao等[18]采用點滴法檢測到2006年江蘇3個灰飛虱種群對吡蟲啉的抗性倍數(shù)達68.1～108，福建福州和廣東廣州種群對吡蟲啉抗性倍數(shù)達26.6～28.6，馬崇勇等[15]采用點滴法也檢測到2006年江蘇無錫種群對吡蟲啉抗性水平達79.6，浙江湖州種群對吡蟲啉抗性倍數(shù)達44.6。本研究結果顯示出2012年安徽、江蘇5個灰飛虱種群對吡蟲啉抗性水平均達高水平抗性，浙江3個灰飛虱種群對吡蟲啉抗性水平已經(jīng)接近或達到高水平抗性，而福建福州和廣東廣州抗性水平均達到中等水平，這些結果與Gao等[18]和馬崇勇等[15]報道結果接近，顯示出這些地區(qū)灰飛虱一直處于吡蟲啉選擇作用之下。Gao等報道2006年云南昆明灰飛虱對吡蟲啉尚很敏感[18]，本研究結果顯示2012年云南昆明灰飛虱種群對吡蟲啉抗性已達到低水平抗性，表明云南地區(qū)灰飛虱對吡蟲啉抗性發(fā)展處于上升趨勢，這與該地區(qū)吡蟲啉的使用量或使用次數(shù)增加有關，也可能是由于其他農(nóng)藥與吡蟲啉存在交互抗性，導致該地區(qū)灰飛虱對吡蟲啉低水平抗性形成。王利華等[17]利用浸苗法檢測到2007年江蘇6個灰飛虱種群和安徽廬江灰飛虱種群對吡蟲啉均處于敏感狀態(tài)，這與本研究結果不同，可能與所采用生測方法、敏感品系、采集地域以及采集田塊用藥背景等因素不同有關。

闡明害蟲抗性機制是生產(chǎn)上選擇適合殺蟲劑以及害蟲抗性治理的基礎，害蟲抗藥性的形成機制主要涉及代謝抗性增強和靶標敏感性下降兩方面，其中代謝抗性主要是由于各種解毒酶活性增高所致。如羧酸酯酶活力的上升可促進灰飛虱對馬拉硫磷[23]、毒死蜱[24]的抗性，P450單加氧酶的過量表達引起灰飛虱對噻嗪酮的抗性[25]，多功能氧化酶和羧酸酯酶活力上升共同促進了田間灰飛虱對多種殺蟲劑的抗性[18]。增效劑PBO、TPP和DEM可分別抑制昆蟲體內(nèi)P450單加氧酶、羧酸酯酶和谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶等解毒酶的活性，從而對殺蟲劑表現(xiàn)出增效作用，提高藥劑的防治效果，克服和延緩害蟲抗性發(fā)展，同時可根據(jù)不同增效劑產(chǎn)生的增效作用判斷試蟲代謝抗性的機制[26]。本研究利用這一方法的結果表明，所測的10個田間抗性種群對吡蟲啉抗性與P450單加氧酶活性有關，而與谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶無關，這與Gao等[18]的結果相似；高抗組的安徽和江蘇省5個灰飛虱種群和低抗組的福建福州和廣東廣州種群抗性與羧酸酯酶有關，但中抗組的3個浙江種群與羧酸酯酶無關，表明不同地區(qū)灰飛虱種群之間抗性機制存在差異。然而這一差異究竟與特定生存環(huán)境下地理種群不同[27]還是與殺蟲劑種類、用藥次數(shù)和用藥量不同而造成抗性水平差異有關尚不清楚，也可能是兩者協(xié)同作用所致，這是因為稻飛虱所處田間環(huán)境的復雜性是多方面的，包括越冬后寄主轉(zhuǎn)移，接受某一殺蟲劑的生育期，特殊生境下受不同農(nóng)藥(殺蟲劑、殺菌劑、除草劑[28]等)的輪流刺激以及遷飛習性造成的基因交流，這些因素都可能引起解毒酶表達響應?；绎w虱靶標不敏感是其產(chǎn)生抗藥性的另外一個途徑，如灰飛虱乙酰膽堿酯酶表達改變使其對有機磷殺蟲劑和氨基甲酸酯類殺蟲劑產(chǎn)生抗性[29]，而不同灰飛虱對吡蟲啉靶標不敏感性等機制差異以及抗性種群與其他殺蟲劑交互抗性分析尚需進一步研究。

由于一些稻區(qū)近年來灰飛虱對吡蟲啉的抗性并未下降，甚至還出現(xiàn)上升之勢，應嚴格控制吡蟲啉的使用時機和使用量，加強田間褐飛虱、白背飛虱和灰飛虱系統(tǒng)調(diào)查工作，根據(jù)田間飛虱種類、數(shù)量和防治目標，進行選擇性防治，在白背飛虱與褐飛虱或灰飛虱混合發(fā)生時應暫時停用吡蟲啉，搭配使用具有不同作用機制且與吡蟲啉無交互抗性的新型藥劑，可將噻蟲嗪、噻嗪酮、烯啶蟲胺、毒死蜱、吡蚜酮、異丙威以及敵敵畏等作為備選殺蟲劑[15]。當前缺少有效防治由稻飛虱傳毒引起的水稻病毒病藥劑，可選的抗病毒水稻品種數(shù)量也有限，一些農(nóng)業(yè)栽培措施值得推廣，如適當推遲水稻播種期、苗床覆蓋防蟲網(wǎng)、翻耕麥田等，均可大大降低灰飛虱的蟲口數(shù)量，減少田間用藥次數(shù)，從而延緩抗性的產(chǎn)生和發(fā)展。田間灰飛虱種群暴發(fā)形成的機制十分復雜[30]，相近地域種群對殺蟲劑的抗性水平常呈現(xiàn)出相近趨勢，與各地灰飛虱的寄主作物種植結構，以及施藥方式、施藥水平統(tǒng)一化關系密切，各地應當針對地域特點制定適宜的防治策略和方法。

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Imidacloprid resistance in Laodelphax striatellus (Fallén)populations from different areas in China

Liu Shuhua1, Shi Bifu2, Ge Shangshu3, Yang Baojun1, Liu Zewen3

(1. State Key Laboratory of Rice Biology, China National Rice Research Institute, Hangzhou 310006，China;2. Agricultural Service Center of Yeshan Town, Liuhe District, Nanjing 211524，China;3. College of Plant Protection， Key Laboratory of Integrated Pest Management of Crop in East China, Ministry of Agriculture, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095，China)

The resistant level of imidacloprid in 16 field populations of the small brown planthopper (SBPH),Laodelphaxstriatellus(Fallén), collected from different areas in China, were determined in 2012 by topical application method. The synergistic effectsinvivowith piperonyl butoxide (PBO), triphenyl phosphate (TPP) and diethyl maleate (DEM) were also determined in ten field populations with relative high resistance. The results showed that five populations from Anhui (Anqing, Hefei) and Jiangsu (Nanjing, Yancheng, Wuxi) Provinces demonstrated high resistance to imidacloprid with resistance ratios (RR) of 74.1-91.2 fold, three populations from Zhejiang Province (Hanghzou, Taizhou and Huzhou) showed medium resistance with RR of 35.8-47.7 fold, Fuzhou population from Fujian Province and Guangzhou population from Guangdong Province showed low resistance with RR of 18.4-21.3 fold, populations from other areas did not show obvious resistance to imidacloprid. Synergistic effects tests showed that PBO and TPP had significant synergistism on imidacloprid in 5 populations with high resistance and 2 populations with low resistance, indicating that the cytochrome P450-monooxygenases and carboxylesterases might be the main biochemical factors for imidacloprid resistance in these populations. By contrast, only PBO showed significant synergistic effects on imidacloprid in 3 populations with medium resistance, indicating that only P450-monooxygenases were the main factor for imidacloprid resistance in these populations. We suggest that imidacloprid should not be used in those moderate and high level resistance areas.

Laodelphaxstriatellus; imidacloprid resistance; synergistic effects; biochemical mechanisms

2014-02-26

2014-06-05

公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(201003031)；“十二五”農(nóng)村領域科技計劃(2012BAD19B01，2012BAD19B0112)

Q 965.9，S 481.4

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2015.02.035

* 通信作者 E-mail： yangbjy@126.com