杜 江, 成媛媛, 牛二波, 牛顏冰

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,太谷 030801)

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黃瓜綠斑駁花葉病毒山西西瓜分離物外殼蛋白基因序列分析

杜 江, 成媛媛, 牛二波, 牛顏冰*

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,太谷 030801)

通過病毒dsRNA分離技術(shù)、非序列依賴性PCR擴增(sequence-independent amplification, SIA)技術(shù)和RT-PCR等手段對采自山西太谷的西瓜病樣進行了檢測與鑒定，確定其為黃瓜綠斑駁花葉病毒(Cucumbergreenmottlemosaicvirus，CGMMV)所侵染。為明確CGMMV西瓜分離物(CGMMV-SXTG)的分類地位，本研究進一步克隆了CGMMV-SXTG的外殼蛋白基因(coat protein, CP)全序列并進行序列分析，系統(tǒng)進化樹分析顯示該分離物與亞洲分離物親緣關(guān)系較近，而與歐洲分離物親緣關(guān)系較遠，表明該病毒的不同分離物在分組上可能與地域有一定的關(guān)系；接著對不同分離物的CP基因核苷酸序列和氨基酸序列進行同源性比對分析，結(jié)果表明該分離物與中國山東分離物(TANG)同源性最高，分別達到99.8%和99.6%。

黃瓜綠斑駁花葉病毒； 序列分析； 外殼蛋白基因

黃瓜綠斑駁花葉病毒(Cucumbergreenmottlemosaicvirus，CGMMV)是一種正單鏈RNA病毒，直桿狀，大小為300 nm×18 nm，屬煙草花葉病毒屬(Tobamovirus)[1]。其危害多種葫蘆科作物，是我國農(nóng)業(yè)植物檢疫性有害生物[2]。1935年，英國Ainsworth[3]首次報道了黃瓜綠斑駁花葉病毒危害黃瓜。我國自2004年首次從日本進口的南瓜種子中截獲CGMMV以來已發(fā)生多起進口源性CGMMV[4]，2005年，廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院從廣西某農(nóng)業(yè)展示中心觀賞南瓜的葉片上分離到了CGMMV[5]；2006年，陳紅運等[6]從遼寧西瓜上檢測到CGMMV；2007年，李紅霞等[7]在甘肅南瓜上檢測到CGMMV；2008年，秦碧霞等[8]從廣西葫蘆上檢測到CGMMV；2009年，田永蕾等[9]又在北京甜瓜及山東西瓜上檢測到CGMMV。

黃瓜綠斑駁花葉病毒嚴(yán)重危害葫蘆科植物，不僅影響植物的正常生長，還給農(nóng)民帶來了巨大的經(jīng)濟損失。西瓜果實感染黃瓜綠斑駁花葉病毒后，種子周圍的果肉變?yōu)樽霞t色或暗紅色水漬狀，成熟時變?yōu)榘岛稚⒊霈F(xiàn)空洞，呈絲瓜瓤狀，俗稱“血果肉”。嚴(yán)重時，變色部位軟化溶解，呈脫落狀，味苦不能食用，失去經(jīng)濟價值[10]。山西太谷西瓜聞名三晉，種植面積一度在全國達到最大，有1.73萬hm2，成為當(dāng)?shù)剞r(nóng)民增加收入、促進農(nóng)村發(fā)展的重要產(chǎn)業(yè)之一。2013年筆者在山西太谷西瓜地發(fā)現(xiàn)疫情，發(fā)病率高達90%，病株綠色葉面上具有淺黃、淺綠相間的斑紋，或是葉片皺縮、卷曲。將明顯花葉和蕨葉癥狀的病樣采回，應(yīng)用分子生物學(xué)方法，對其進行了病毒分離檢測與鑒定，確定其被CGMMV所侵染，對CGMMV的外殼蛋白基因(CP)進行了克隆、測序與序列分析，為研究CGMMV的基因遺傳和變異提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

病毒病樣：病樣葉片采集于山西太谷西瓜地，具有典型的花葉癥狀(圖1)。

圖1 病毒病在西瓜葉片上表現(xiàn)的癥狀Fig.1 Symptoms on leaves of watermelon infected by virus

主要試劑：莫洛尼鼠白血病病毒逆轉(zhuǎn)錄酶(M-MLV)購自Promega公司；Ribonuclease Inhibitor核酸酶抑制劑購自TaKaRa公司；克隆載體pUCm-T、Taqplus DNA polymerse和瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒等購自上海生工(Sangon Biotech)公司。

引物設(shè)計與合成：本試驗中所用的引物269和177由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)植保學(xué)院陶小榮老師惠贈，M4T為本實驗室所有；根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中公布的CGMMV基因組全序列(GenBank登錄號AF417242)設(shè)計特異引物(XG-CP-F/R)，序列如表1所示，由上海生工(Sangon Biotech)公司合成。

表1 PCR擴增所用引物序列1)

1)N=A，T，C or G。

1.2 方法

1.2.1 植物病原雙鏈RNA(dsRNA)的提取

參照牛顏冰等[11-12]和Tzanetakis等[13]的方法并加以改進，提取dsRNA。

1.2.2 非序列依賴性擴增(SIA)檢測

以提取的病樣dsRNA為模板，隨機錨定引物269為反轉(zhuǎn)錄引物進行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA第一鏈，然后采用錨定引物177進行PCR擴增。

反應(yīng)結(jié)束后，進行瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.3 特異引物PCR檢測

以提取的病樣dsRNA為模板，M4T為反轉(zhuǎn)錄引物進行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA第一鏈，然后采用特異引物XG-CP-F/R進行PCR擴增。

反應(yīng)結(jié)束后，進行瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.4 PCR產(chǎn)物克隆及序列分析

利用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收目的片段，并將其與克隆載體pUCm-T進行連接轉(zhuǎn)化，陽性克隆通過PCR和酶切鑒定后送至上海生工公司進行測序。登錄GenBank對所得序列利用BLAST進行檢索，結(jié)合NCBI-GenBank部分共享數(shù)據(jù)，利用DNAMAN軟件將所測序列與已報道的分離物序列進行核苷酸序列、氨基酸序列的同源性比較分析，運用MEGA 4.1軟件構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，以同屬的小西葫蘆綠斑駁花葉病毒 (Zucchinigreenmottlemosaicvirus，ZGMMV)為外群。

2 結(jié)果與分析

2.1 SIA檢測

以提取的dsRNA為模板，269/177為引物進行SIA鑒定，擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳后得到大小為1 000 bp 左右的片段，而健康樣品中未擴增出任何片段(圖2)。經(jīng)克隆、測序和序列比對發(fā)現(xiàn)，該部分序列與NCBI中多種黃瓜綠斑駁花葉病毒分離物相似度在88%～99%之間，其中與分離物JSHZ12(KC852073)、KW(AF417242)、TANG(HM008919)和C(FJ654658)相似度達到99%，由此初步認定其為CGMMV。

圖2 西瓜病毒病SIA檢測電泳圖Fig.2 Electrophoresis of SIA products of watermelon virus

2.2 特異引物PCR檢測

為了進一步明確引起西瓜病毒病病原的種類和分類地位，以提取的dsRNA為模板，M4T為反轉(zhuǎn)錄引物，XG-CP-F/R為PCR引物，進行特異引物PCR檢測，擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，得到大小為875 bp的目的片段，而健康樣品中未擴增出片段(圖3)。經(jīng)序列比對分析，發(fā)現(xiàn)該部分序列與NCBI中多種CGMMV分離物同源性在91%～99%之間。說明西瓜病毒病為CGMMV侵染所致，并將該分離物命名為CGMMV-SXTG。

圖3 特異引物擴增電泳圖Fig.3 Electrophoresis of PCR products by specific primers

2.3 同源性與系統(tǒng)進化樹分析

在GenBank上選擇不同地區(qū)的23個CGMMV分離物，利用DNAMAN軟件對這些分離物CP基因進行核苷酸序列和氨基酸序列同源性比對分析(表2)。結(jié)果表明，CGMMV-SXTG CP基因核苷酸序列與氨基酸序列同CGMMV其他株系序列同源性都高于90%，而與ZGMMV代表株系的序列同源性遠遠低于90%。對這些分離物CP基因的核苷酸序列進行系統(tǒng)進化樹構(gòu)建的結(jié)果見圖4。

表2 CGMMV-SXTG CP 與已報道的CGMMV分離物核苷酸與氨基酸的相似性比對分析

續(xù)表2 Table 2(Continued)

株系或分離物IsolateGenBank登錄號GenBankaccessionnumber來源Source核苷酸序列同源性/%Nucleotidesequenceidentity氨基酸序列同源性/%AminoacidsequenceidentityKOMAF417243韓國Korea99．299．0JSDT12KC852072中國China99．299．0BGFJ654659中國臺灣Taiwan，China99．098．7CGMMV11HQ692886中國臺灣Taiwan，China99．098．7KWAF417242韓國Korea99．098．7AL1AJ748352印度India98．798．5CFJ654658中國臺灣Taiwan，China98．798．5CGMMV?SA?W1KC295231沙特阿拉伯SaudiArabia98．598．5NW?2EU016088韓國Korea98．298．0TYKF155229以色列Israel97．997．7GXGQ277655中國China97．597．3BG?SBFJ654657中國臺灣Taiwan，China97．196．9RdKF155230以色列Israel96．596．2VIROG?43MGQ495274俄羅斯Russia92．392．1Alm08GQ411361西班牙Spain91．291．0ZGMMVAJ252188韓國Korea56．956．6

圖4 CGMMV-SXTG和其他相關(guān)病毒外殼蛋白核苷酸序列的系統(tǒng)進化樹分析Fig.4 Phylogenetic tree analysis on nucleotide sequences of CGMMV-SXTG and other reported isolates

3 討論

本試驗首先通過非序列依賴性PCR擴增(SIA)技術(shù)，對染病西瓜進行病毒病病原的分子鑒定，序列分析發(fā)現(xiàn)染病癥狀是由CGMMV侵染所致。SIA技術(shù)是將隨機引物加入dsRNA中，該引物5′端含有20個固定序列的核苷酸，3′端含有核苷酸隨機簡并序列，在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下延伸。在PCR延伸過程中加入固定序列部分作為引物，將擴增產(chǎn)物進行電泳分析、克隆和測序[14]。SIA的特點是試驗時間短，步驟簡單，得到病毒拷貝數(shù)高，不需特定試劑。

為了進一步確定CGMMV-SXTG的分類地位和進化關(guān)系，在SIA檢測的基礎(chǔ)上，依據(jù)待測病毒的保守序列設(shè)計引物，采用RT-PCR技術(shù)擴增該病毒的CP全序列，并將其測定結(jié)果進行同源關(guān)系和系統(tǒng)進化分析。通過系統(tǒng)進化樹可以明確地看到CGMMV分離物大致可以分成兩組，第Ⅰ組屬于亞洲國家，第Ⅱ組屬于歐洲國家。CGMMV-SXTG與亞洲國家(如：韓國、日本)分離物同源性較為相近，與我國內(nèi)陸地區(qū)的分離物同源性最為相近；而與西班牙分離物和俄羅斯分離物相距較遠，存在非常明顯的進化差異。由此可以說明CGMMV不同分離物的基因組變異表現(xiàn)出一定的地域相關(guān)性。

通過進一步的序列比對發(fā)現(xiàn)與中國山東分離物TANG(HM008919)的核苷酸序列和氨基酸序列的同源性最高，分別為99.8%和99.6%；與韓國的分離物(AF417243)和日本的分離物(D12505)核苷酸序列同源性達到了99.2%，氨基酸序列同源性為99.0%。這說明CGMMV-SXTG與日、韓報道的CGMMV有共同的流行學(xué)意義上的侵染源，同時也進一步驗證了我國的CGMMV可能由國外引種傳入的論斷[15]。本試驗的研究方法可為后期病毒病原的分子鑒定提供借鑒，同時本文也為有效地預(yù)防和控制西瓜上CGMMV的流行提供了重要依據(jù)。

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Sequence analysis of CP gene of Cucumber green mottle mosaic virus isolate infecting watermelon from Shanxi Province

Du Jiang, Cheng Yuanyuan, Niu Erbo, Niu Yanbing

(College of Life Science, Shanxi Agricultural University, Taigu 030801, China)

Based on dsRNA isolation, sequence-independent amplification (SIA) and Two-step RT-PCR methods, the pathogen infected watermelon in Taigu of Shanxi Province was identified to beCucumbergreenmottlemosaicvirus(CGMMV). To further characterize the CGMMV isolate on watermelon (CGMMV-SXTG), the coat protein gene(CP)coded by CGMMV-SXTG were cloned and sequenced. Phylogenetic tree analysis showed that CGMMV-SXTG had close relatives with Asia isolates and distant relatives with European isolates, suggesting that the classification of the CGMMV isolates may be related to the regions at some degree. Sequence alignments revealed that CGMMV-SXTG had the highest sequence identities with strain TANG by 99.8% in nucleotide and 99.6% in deduced amino acid identity, respectively.

CGMMV; sequence analysis; CP gene

2014-02-22

2014-07-28

公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(201303028)；山西省自然科學(xué)基金(2012011032-5)

S 432.41

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2015.02.026

* 通信作者 E-mail：niuyanbingbest@163.com