劉秀麗, 龐 博, 張金文*, 王 蒂*, 張俊蓮

(1.甘肅省作物遺傳改良與種質(zhì)創(chuàng)新重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅省干旱生境作物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，蘭州 730070；2. 隴東學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，慶陽(yáng) 745000)

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雙重PCR檢測(cè)馬鈴薯晚疫病和環(huán)腐病方法的建立

劉秀麗1,2, 龐 博1, 張金文1*, 王 蒂1*, 張俊蓮1

(1.甘肅省作物遺傳改良與種質(zhì)創(chuàng)新重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅省干旱生境作物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，蘭州 730070；2. 隴東學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，慶陽(yáng) 745000)

通過(guò)克隆馬鈴薯環(huán)腐病菌和晚疫病菌轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)序列，并對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行同源性比較，選取差異位點(diǎn)分別設(shè)計(jì)了兩對(duì)引物 P.IN1/P.IN2和C.IN1/C.IN2，并檢測(cè)了引物的特異性及方法的靈敏度。引物 P.IN1/P.IN2可擴(kuò)增出1 條 363 bp 馬鈴薯晚疫病菌的特異性條帶，在 DNA 水平上其靈敏度達(dá)18 fg/μL；引物C.IN1/C.IN2可擴(kuò)增出1條218 bp 馬鈴薯環(huán)腐病菌的特異性條帶，在細(xì)菌數(shù)上檢測(cè)靈敏度為104cfu/mL?；旌线@兩對(duì)引物構(gòu)建雙重PCR反應(yīng)體系，能從馬鈴薯環(huán)腐病菌和晚疫病菌的混合 DNA 及感染這兩種菌的馬鈴薯植株中同時(shí)擴(kuò)增到 363 bp和218 bp的特異片段。實(shí)現(xiàn)了同時(shí)對(duì)馬鈴薯晚疫病菌和環(huán)腐病菌的快速可靠檢測(cè)。

馬鈴薯； 雙重PCR； 馬鈴薯晚疫病菌； 馬鈴薯環(huán)腐病菌

馬鈴薯晚疫病菌(Phytophthorainfestans)和環(huán)腐病菌(Clavibactermichiganensissubsp.sepedonicum)是馬鈴薯生產(chǎn)上可造成毀滅性破壞的兩大病害，均可致種薯帶有肉眼無(wú)法診查的潛伏侵染，這樣的種薯種植后，常造成馬鈴薯爛種、死苗，儲(chǔ)藏期間還可導(dǎo)致?tīng)€窖，給農(nóng)戶造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。在馬鈴薯病害的預(yù)防方面，對(duì)種薯的病原檢測(cè)是一項(xiàng)重要的工作。在傳統(tǒng)栽培中，一般僅是在播種之前淘汰肉眼能夠看到的爛薯，實(shí)際上對(duì)潛伏病原的種薯根本無(wú)法徹底根除。因此尋找一種快速、靈敏、準(zhǔn)確的檢測(cè)方法對(duì)保證馬鈴薯種薯的質(zhì)量以及預(yù)防晚疫病病菌和環(huán)腐病菌的蔓延具有重要的意義。

植物學(xué)家對(duì)這兩種病原菌的分子檢測(cè)進(jìn)行了研究，取得了一定的成果。2000年Judelson等[1]根據(jù)晚疫病菌全基因組中33段DNA重復(fù)序列的08序列設(shè)計(jì)出的 08-3 和 08-4 引物對(duì)晚疫病菌具有很強(qiáng)的特異性和較高的靈敏度。隨后，2004 年徐安傳等[2]將這對(duì)引物，通過(guò) PCR技術(shù)直接應(yīng)用到了馬鈴薯種薯的帶菌檢測(cè)上，進(jìn)一步證明了該引物的特異性和靈敏度以及它的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。在馬鈴薯環(huán)腐病菌檢測(cè)方面，1997 年 Mills 等[3]通過(guò)消減雜交技術(shù)獲得環(huán)腐病菌株特異性序列并設(shè)計(jì)引物達(dá)到對(duì)其進(jìn)行分子檢測(cè)的目的。2011 年韓廣濤等[4]針對(duì)馬鈴薯環(huán)腐病菌 pCS1 質(zhì)粒上的纖維素酶A 基因序列設(shè)計(jì)特異性引物，與已經(jīng)報(bào)道過(guò)的馬鈴薯黑脛病菌特異性引物[5]組合建立雙重 PCR 體系，達(dá)到在短時(shí)間內(nèi)能夠同時(shí)檢測(cè)兩種病原的目的。而雙重 PCR 技術(shù)已經(jīng)在很多作物的病原檢測(cè)中得到了應(yīng)用，包括小麥條紋花葉病毒和小麥花葉病毒的檢測(cè)[6]、水稻白葉枯病菌和細(xì)菌性條斑病菌的檢測(cè)[7]、洋蔥黃矮病毒和蔥潛隱病毒的檢測(cè)[8]以及馬鈴薯晚疫病菌和青枯病菌的檢測(cè)[9]等。本研究利用細(xì)菌和真菌的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)序列在種間變異和種內(nèi)穩(wěn)定的特點(diǎn)，克隆出馬鈴薯晚疫病菌的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)序列和馬鈴薯環(huán)腐病菌的 16S-23S 間隔區(qū)序列，并設(shè)計(jì)針對(duì)馬鈴薯晚疫病菌和環(huán)腐病菌的特異性引物，構(gòu)建雙重 PCR 體系，達(dá)到在同一反應(yīng)中可以特異、靈敏地檢測(cè)兩種病原菌的目的，以期為這兩種病害的預(yù)防及有效的防控提供可靠依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株及材料來(lái)源

本研究選用來(lái)自于甘肅省渭源縣的馬鈴薯晚疫病菌及感染晚疫病植株，來(lái)自于甘肅省隴南的感染環(huán)腐病菌的馬鈴薯植株以及來(lái)自于甘肅省農(nóng)科院植保所和甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室的其他參試真菌和細(xì)菌進(jìn)行測(cè)定。本研究所用到的接種病原物的馬鈴薯均系用菌懸液侵染新鮮馬鈴薯塊莖切片所得，直到在塊莖上可觀察到明顯感病癥狀。

1.2 菌株培養(yǎng)及 DNA 的提取

晚疫病菌的培養(yǎng)采用黑麥培養(yǎng)基[10]，馬鈴薯環(huán)腐病菌培養(yǎng)采用肉汁胨培養(yǎng)基(BPA)[4]。其他供試真菌使用馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基培養(yǎng)?；蚪M的提取根據(jù)薩姆布魯克編著的《分子實(shí)驗(yàn)指南》并稍作改良，真菌菌絲體和馬鈴薯發(fā)病葉片中DNA的提取采用改良的 CTAB 法，馬鈴薯發(fā)病塊莖和細(xì)菌DNA采用 SDS 法提取。

1.3 ITS區(qū)段的克隆及引物的設(shè)計(jì)

根據(jù) GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)中馬鈴薯晚疫病菌和馬鈴薯環(huán)腐病菌的基因組信息，設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增晚疫病菌 18S 和 28S 之間包含 ITS1 和 ITS2 兩個(gè)內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)的片段和環(huán)腐病菌 16S 和 23S 之間間隔區(qū)的片段。反應(yīng)體系均為 25 μL：含 2.5 μL 10×PCR buffer (Mg2+Plus)，0.8 mmol/L dNTP，1.0 U TaKaRaTaqDNA 聚合酶，0.2 μmol/L引物，100 ng DNA 模板，不足部分由無(wú)菌超純水補(bǔ)足。在 TProfessional PCR 儀(Biometra)上按以下程序擴(kuò)增：94 ℃ 5 min；94 ℃ 40 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。擴(kuò)增結(jié)束后取 5.0 μL PCR 產(chǎn)物于 2%瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠成像系統(tǒng)上檢測(cè)并拍照。

回收 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物連接載體 pMD19-T vector，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，篩選出陽(yáng)性克隆，送北京華大工程有限公司測(cè)序。用 DNAMAN 軟件及 NCBI-BLAST 功能對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行同源性比較，選取差異位點(diǎn)設(shè)計(jì)檢測(cè)馬鈴薯環(huán)腐病菌和晚疫病菌的引物。

1.4 引物的特異性檢測(cè)

用所設(shè)計(jì)的引物對(duì)參試菌株的基因組 DNA 進(jìn)行擴(kuò)增，優(yōu)化 PCR 反應(yīng)參數(shù)，包括退火溫度、循環(huán)次數(shù)及延伸時(shí)間，并檢測(cè)引物的特異性。最終 PCR 反應(yīng)體系為 25 μL：包括2.5 μL 10×PCR buffer (Mg2+Plus)， 0.4 mmol/L dNTP，0.75 U TaKaRaTaqDNA 聚合酶，0.2 μmol/L引物，25 ng DNA模板，不足部分由無(wú)菌超純水補(bǔ)足。擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，62 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，30 個(gè)循環(huán)； 72 ℃ 10 min。擴(kuò)增結(jié)束后取 5.0 μL PCR 產(chǎn)物于2%瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠成像系統(tǒng)上檢測(cè)并拍照。

1.5 引物靈敏性檢測(cè)

1.5.1 引物P.IN1/P.IN2對(duì)晚疫病菌DNA的靈敏度檢測(cè)

采用10倍梯度稀釋法將提取的晚疫病菌純DNA稀釋成1.8 μg/μL、180 ng/μL、18 ng/μL、1.8 ng/μL、180 pg/μL、18 pg/μL、1.8 pg/μL、180 fg/μL、18 fg/μL和1.8 fg/μL共10種不同濃度梯度，測(cè)定引物P.IN1/P.IN2檢測(cè)晚疫病原菌的靈敏度。反應(yīng)體系及反應(yīng)程序同1.4。

1.5.2 引物 C.IN1/C.IN2 對(duì)馬鈴薯環(huán)腐病菌懸浮液的靈敏性檢測(cè)

采用 10 倍梯度稀釋法， 將馬鈴薯環(huán)腐病菌懸浮液稀釋成 1011、1010、109、108、107、106、105、104、 103、102cfu/mL共 10 種不同濃度梯度，測(cè)定引物 C.IN1/C.IN2檢測(cè)環(huán)腐病菌的靈敏度。PCR 反應(yīng)體系、擴(kuò)增程序同 1.4。

1.6 雙重 PCR 體系的建立

1.6.1 雙重 PCR 體系的建立

把設(shè)計(jì)的檢測(cè)馬鈴薯晚疫病菌、環(huán)腐病菌的2對(duì)特異引物混合，構(gòu)建雙重 PCR 體系。對(duì)雙重 PCR體系中的退火溫度、循環(huán)次數(shù)、dNTP 濃度、酶量這4個(gè)參數(shù)設(shè)置單個(gè)因素梯度，在不改變其他因素條件下，分別對(duì) PCR 反應(yīng)體系中的各組分進(jìn)行梯度試驗(yàn)，比較不同處理對(duì)擴(kuò)增結(jié)果的影響。退火溫度從 56～65 ℃變化10個(gè)溫度，循環(huán)次數(shù)從25～35次變化10個(gè)梯度，dNTP濃度設(shè)置 0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mmol/L 5個(gè)濃度梯度，50 μL體系中酶量設(shè)置1、1.25、1.5、1.75、2.0 U 5個(gè)酶量梯度。設(shè)置2對(duì)引物在0.1、0.2、0.3 μmol/L 3個(gè)濃度水平上的組合試驗(yàn)，篩選雙重PCR反應(yīng)體系中引物的最佳配比方案。

1.6.2 雙重PCR體系的特異性檢測(cè)

應(yīng)用P.IN1/P.IN2 和C.IN1/C.IN2 及建立并優(yōu)化的雙重 PCR 體系對(duì)晚疫病菌和環(huán)腐病菌及其他參試菌株進(jìn)行擴(kuò)增，檢測(cè)雙重 PCR 反應(yīng)體系對(duì)馬鈴薯晚疫病菌和環(huán)腐病菌的特異性。反應(yīng)體系及反應(yīng)程序同 1.6.1。

1.6.3 雙重PCR體系對(duì)感病馬鈴薯植株的檢測(cè)

提取感染環(huán)腐病和晚疫病的馬鈴薯植株或薯塊的DNA，應(yīng)用P.IN1/P.IN2和C.IN1/C.IN2 及建立的雙重 PCR 體系，進(jìn)行雙重 PCR 檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 馬鈴薯晚疫病菌和環(huán)腐病菌 ITS 區(qū)段克隆及特異性引物的設(shè)計(jì)

根據(jù) GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)中馬鈴薯環(huán)腐病菌和晚疫病菌的基因組信息，利用 Primer 軟件設(shè)計(jì)引物克隆晚疫病菌 18S 和28S 之間包含 ITS1 和 ITS2 兩個(gè)內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)的片段，長(zhǎng) 868 bp；克隆環(huán)腐病菌 16S 和23S 之間間隔區(qū)的片段，長(zhǎng) 708 bp?？寺〗Y(jié)果見(jiàn)圖1，電泳檢測(cè)條帶大小與預(yù)期相符。

圖1 馬鈴薯晚疫病菌和環(huán)腐病菌ITS序列的PCR擴(kuò)增Fig.1 PCR products of ITS sequences of P.infestans and C.michiganensis subsp. sepedonicum

回收 DNA 并測(cè)序，結(jié)合 DNAMAN、Oligo、Primer 5.0及NCBI-BLAST功能對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行同源性比較，選取差異位點(diǎn)分別設(shè)計(jì)檢測(cè)馬鈴薯環(huán)腐病菌和晚疫病菌的特異引物 C.IN1/C.IN2、P.IN1/P.IN2(表1)，用于構(gòu)建雙重 PCR。

表1 本研究中雙重 PCR 所用的引物

2.2 引物的特異性檢測(cè)

以設(shè)計(jì)的檢測(cè)馬鈴薯晚疫病菌和環(huán)腐病菌的特異引物 P.IN1/P.IN2、C.IN1/C.IN2 分別對(duì)馬鈴薯晚疫病菌和馬鈴薯環(huán)腐病菌以及參試的其他細(xì)菌和真菌進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，結(jié)果表明，只有在馬鈴薯晚疫病菌及其感染的馬鈴薯植株中能產(chǎn)生一條 363 bp 的條帶(圖2)，只有在馬鈴薯環(huán)腐病菌及其感染的馬鈴薯植株中能產(chǎn)生一條218 bp 的條帶(圖3)，其他參試菌株無(wú)擴(kuò)增產(chǎn)物。說(shuō)明這2對(duì)引物在該反應(yīng)體系下分別對(duì)馬鈴薯晚疫病菌和環(huán)腐病菌具有較強(qiáng)的特異性。

圖2 引物 P.IN1/P.IN2的特異性分子檢測(cè)Fig.2 The specificity of the primers P.IN1/ P.IN2 in molecular detection

圖3 引物 C.IN1/C.IN2的特異性分子檢測(cè)Fig.3 The specificity of the primers C.IN1/ C.IN2 in molecular detection

2.3 引物的靈敏度檢測(cè)

2.3.1 引物P.IN1/P.IN2的靈敏度

將提取的馬鈴薯晚疫病菌DNA濃度從1.8 μg/μL依次稀釋10倍至1.8 fg/μL，分別取1 μL模板擴(kuò)增，反應(yīng)體系、反應(yīng)程序同1.4，測(cè)定引物的靈敏度。結(jié)果(圖4)表明，該P(yáng)CR反應(yīng)的最小檢測(cè)濃度為18 fg/μL。

圖4 引物P.IN1/P.IN2對(duì)晚疫病菌的靈敏度Fig.4 The sensitivity of the primers P.IN1/P.IN2 in molecular detection of P.infestans

2.3.2 引物C.IN1/C.IN2的靈敏度

將馬鈴薯環(huán)腐病菌懸浮液濃度從 1011cfu/mL依次稀釋 10 倍至 102cfu/mL，利用 1.4 中的 PCR 反應(yīng)體系、反應(yīng)程序，對(duì)引物靈敏度進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果(圖5)表明，該 PCR 反應(yīng)的最小檢測(cè)濃度為 104cfu/mL。

圖5 引物 C.IN1/C.IN2 對(duì)環(huán)腐病菌懸浮液的靈敏度Fig.5 The sensitivity of the primers C.IN1/C.IN2 in molecular detection of C.michiganensis subsp. sepedonicum

2.4 雙重 PCR 體系建立

分別以馬鈴薯晚疫病菌和環(huán)腐病菌的單一 DNA 以及2 種菌的混合 DNA 為模板，同時(shí)加入2 對(duì)引物進(jìn)行擴(kuò)增，對(duì)雙重PCR體系中的退火溫度、循環(huán)次數(shù)、dNTP濃度、酶的用量和2對(duì)引物的濃度等參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，最終優(yōu)化PCR反應(yīng)體系為25 μL:含2.5 μL 10×PCR buffer (Mg2+)，0.1 mmol/L dNTP，0.75 U TaKaRaTaqDNA 聚合酶(大連寶生物工程有限公司)，0.2 μmol/L引物，DMSO 0.3 μL，不足部分由無(wú)菌超純水補(bǔ)足。最終優(yōu)化的程序?yàn)椋?4 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，62 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s， 30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。結(jié)果表明，該系統(tǒng)從單一菌株DNA和混合菌株DNA中均能靈敏準(zhǔn)確地檢測(cè)出馬鈴薯晚疫病菌(363 bp)和環(huán)腐病菌(218 bp)(圖6)。

圖6 雙重引物 P.IN1/P.IN2、C.IN1/C.IN2對(duì)晚疫病菌和環(huán)腐病菌的 PCR 檢測(cè)Fig.6 PCR detection of P.infestans and C.michiganensis subsp. sepedonicum by using P.IN1/P.IN2 and C.IN1/C.IN2

2.5 雙重PCR體系的特異性

利用 1.6.1 中的PCR反應(yīng)體系、反應(yīng)程序，以馬鈴薯環(huán)腐病菌、晚疫病菌單一DNA，馬鈴薯環(huán)腐病菌和晚疫病菌混合DNA，感染馬鈴薯環(huán)腐病菌、晚疫病菌的馬鈴薯組織DNA及其他參試菌株DNA為模板，結(jié)果顯示(圖7)兩種病原菌混合DNA及兩種病原菌侵染的馬鈴薯DNA的檢測(cè)中可檢測(cè)到363 bp和218 bp的2條條帶；在馬鈴薯晚疫病菌、環(huán)腐病菌單一DNA及分別感染晚疫病菌和環(huán)腐病菌的馬鈴薯組織中，可以分別檢出晚疫病菌和環(huán)腐病菌的單一特異性條帶，而以健康馬鈴薯及其他供試菌株DNA為模板進(jìn)行的擴(kuò)增，沒(méi)有出現(xiàn)任何條帶。

圖7 雙重PCR的特異性檢測(cè)Fig.7 Specificity test of duplex PCR

2.6 雙重PCR對(duì)感病馬鈴薯植株的檢測(cè)

對(duì)接種了馬鈴薯環(huán)腐病菌和晚疫病菌的馬鈴薯植株以及根據(jù)癥狀選取的天然感病植株提取DNA，按照1.6.1的反應(yīng)體系和反應(yīng)程序，用雙重引物P.IN1/P.IN2、C.IN1/C.IN2進(jìn)行PCR擴(kuò)增。結(jié)果顯示(圖8)，從感染馬鈴薯環(huán)腐病和晚疫病的植株中均可擴(kuò)增出218 bp和363 bp的特異性條帶，從分別感染其中一種病原菌的馬鈴薯植株中，均能檢測(cè)到相對(duì)應(yīng)的218 bp或363 bp的特異性條帶。

圖8 雙重PCR對(duì)感病馬鈴薯的檢測(cè)Fig.8 Duplex PCR detection of diseased potatoes

3 討論

核糖體基因轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)ITS是自Gonzalea 1990年提出后逐步發(fā)展起來(lái)的全新的分子標(biāo)記，其優(yōu)點(diǎn)在于：①具有高拷貝數(shù)；②同時(shí)包含保守和變異序列；③能根據(jù)保守序列中的變異位點(diǎn)設(shè)計(jì)特殊引物進(jìn)行特異性擴(kuò)增[11]。近幾年，利用ITS序列設(shè)計(jì)引物在棉花、番茄、西瓜等作物的病害的檢測(cè)中得到了廣泛的應(yīng)用[12]。同時(shí)，利用細(xì)菌16S-23S rDNA序列對(duì)微生物進(jìn)行種屬分析的研究也有很多相關(guān)的報(bào)道[13-14]，該段DNA序列的多態(tài)性彌補(bǔ)了16S序列高保守、分化程度不強(qiáng)的缺陷[15]。本研究通過(guò)對(duì)馬鈴薯晚疫病菌ITS序列和馬鈴薯環(huán)腐病菌16S-23S rDNA間隔區(qū)序列進(jìn)行克隆，根據(jù)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行序列分析并設(shè)計(jì)引物，同時(shí)利用相關(guān)軟件分析來(lái)確保引物的特異性，最終建立雙重PCR檢測(cè)體系，并對(duì)反應(yīng)體系的各參數(shù)，包括退火溫度、引物濃度、dNTP濃度、循環(huán)次數(shù)等進(jìn)行優(yōu)化，達(dá)到通過(guò)一個(gè)反應(yīng)同時(shí)對(duì)兩種病原菌進(jìn)行高特異性、高靈敏度的檢測(cè)。根據(jù)馬鈴薯晚疫病菌ITS序列設(shè)計(jì)的引物P.IN1/P.IN2可以針對(duì)馬鈴薯晚疫病菌特異地?cái)U(kuò)增出一條363 bp的片段，該引物的檢測(cè)靈敏度在DNA水平上可達(dá)18 fg/μL。根據(jù)馬鈴薯環(huán)腐病菌16～23S間隔區(qū)設(shè)計(jì)的引物C.IN1/C.IN2可以針對(duì)馬鈴薯環(huán)腐病菌特異性地?cái)U(kuò)增出一條218 bp的片段，該引物的檢測(cè)靈敏度可達(dá)104cfu/mL。由這兩種引物構(gòu)建的雙重PCR體系對(duì)馬鈴薯環(huán)腐病菌和晚疫病菌混合DNA、感染環(huán)腐病菌和感染晚疫病菌馬鈴薯植株進(jìn)行檢測(cè)，都同時(shí)或分別得到了363 bp和218 bp的片段，而健康馬鈴薯植株無(wú)擴(kuò)增產(chǎn)物。說(shuō)明該檢測(cè)體系成功地通過(guò)一個(gè)反應(yīng)達(dá)到對(duì)兩種病原菌的檢測(cè)，為馬鈴薯晚疫病和環(huán)腐病的診斷和預(yù)防提供了技術(shù)支撐，同時(shí)也為其他作物的病原檢測(cè)技術(shù)的開(kāi)發(fā)提供了參考。

[1] Judelson H S, Tooley P W. Enhanced polymerase chain reaction methods for detecting and quantifyingPhytophthorainfestansin plants [J]. Phytopatholgy,2000, 90: 1112-1119.

[2] 徐安傳，羅文富，楊艷麗，等. 馬鈴薯晚疫病種薯帶菌的分子檢測(cè)[J]. 中國(guó)馬鈴薯，2004，18 (2): 73-76.

[3] Mills D, Russell B W, Hanus J W. Specific detection ofClavibactermichiganensissubsp.sepedonicusby amplification of three unique DNA sequences isolated by subtraction hybridization [J]. Phytopathology, 1997, 87(8): 853-861.

[4] 韓廣濤，楊志輝，朱杰華，等. 雙重PCR技術(shù)檢測(cè)馬鈴薯環(huán)腐病菌和黑脛病菌方法的建立[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué),2011,44(20):4199-4206.

[5] De Boer S H, Ward L J. PCR detection ofErwiniacarotovorasubsp.atrosepticaassociated with potato tissue [J]. Phytopathology, 1995, 85(8): 854-858.

[6] Price J A, Smith J, Simmons A, et al. Multiplex real-time RT-PCR for detection ofWheatstreakmosaicvirusandTritcummosaicvirus[J]. Journal of Virological Methods,2010, 165(2): 198-201.

[7] 張華. 水稻白葉枯病菌和細(xì)菌性條斑病菌的分子檢測(cè)技術(shù)研究[D]. 南京: 南京農(nóng)業(yè)大學(xué),2004.

[8] Majumder S, Baranwal V K, Joshi S. Simultaneous detection ofOnionyellowdwarfvirusandShallotlatentvirusin infected leaves and cloves of garlic by duplex RT-PCR [J]. Journal of Plant Pathology,2008, 90(2): 371-374.

[9] 陳慶河，李本金，蘭成忠,等. 雙重 PCR檢測(cè)馬鈴薯晚疫病菌和青枯病菌方法的建立及應(yīng)用[J].植物病理學(xué)報(bào),2009, 39(6): 578-583.

[10]李惠霞，劉永剛，王蒂,等. 馬鈴薯晚疫病菌培養(yǎng)條件的研究[J].中國(guó)馬鈴薯,2007,21(4):203-205.

[11]劉春來(lái)，文景芝，楊明秀，等. rDNA-ITS在植物病原真菌分子檢測(cè)中的應(yīng)用[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，38(1)：101-106.

[12]王國(guó)芬，彭軍，代鵬，等. 香蕉枯萎病鐮刀菌ITS序列的PCR擴(kuò)增及其分子檢測(cè)[J].華南熱帶農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2007，13(3)：1-5.

[13]傅君芬，盧美萍，尚世強(qiáng),等.16S-23S rRNA基因區(qū)間細(xì)菌鑒定實(shí)驗(yàn)研究[J].浙江大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2002，31(6):448-452.

[14]傅君芬，徐美春，尚世強(qiáng),等.應(yīng)用 16S-23S rRNA 基因區(qū)間對(duì)敗血癥常見(jiàn)菌的鑒定[J]. 中華傳染病雜志，2002，20(5)：261-264.

[15]劉裕田. 分枝桿菌 16S-23S r RNA 基因轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)序列分析的研究[D]. 沈陽(yáng)：沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)，2007.

Development of duplex PCR assay for detection of PhytophthorainfestansandClavibactermichiganensissubsp.sepedonicum

Liu Xiuli1,2, Pang Bo1, Zhang Jinwen1, Wang Di1, Zhang Junlian1

(1.Gansu Key Laboratory of Crop Improvement & Germplasm Enhancement,Gansu Provincial Key Laboratory of Aridland Crop Science,College of Agronomy, Gansu Agricultural University, Lanzhou 730070, China; 2. College of Life Science and Technology, Longdong University, Qingyang 745000, China)

Based on cloning and analysis of the internal transcribed spacer (ITS) sequences ofPhytophthorainfestansandClavibactermichiganensissubsp.sepedonicum，two specific pairs of primer, P.IN1/P.IN2 and C.IN1/C.IN2, were designed to establish a duplex PCR system, with the optimized PCR parameters to ensure the sensitivity and specificity. The system could simultaneously detect the two pathogens of potato. Using P.IN1/P.IN2, a single unique PCR band of 363 bp was amplified fromP.infestansand the sensitivity was 18 fg/μL of DNA. Using C.IN1/C.IN2, a single unique PCR band of 218 bp was amplified fromC.michiganensissubsp.sepedonicumand the sensitivity was 104cfu/mL of bacteria. With the duplex PCR system, the 363 bp and 218 bp PCR bands fromP.infestansandC.michiganensissubsp.sepedonicumcould be specifically amplified. So a duplex PCR system has been developed for simultaneously and rapidly detectingP.infestansandC.michiganensissubsp.sepedonicum.

potato; duplex PCR;Phytophthorainfestans；Clavibactermichiganensissubsp.sepedonicum

2014-02-23

2014-06-11

甘肅省科技重大專項(xiàng)(1102NKDA025 )；國(guó)家自然科學(xué)基金(31260343)

S 435.32

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2015.02.020

* 通信作者 E-mail：jwzhang305@163.com; wangd@gsau.edu.cn