李文鳳，王曉燕，黃應(yīng)昆，張榮躍，單紅麗，尹 炯，申 科，羅志明

(云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院甘蔗研究所，云南省甘蔗遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，開遠(yuǎn) 661699)

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甘蔗抗褐銹病基因Bru1分子檢測(cè)體系的建立與應(yīng)用

李文鳳，王曉燕，黃應(yīng)昆*，張榮躍，單紅麗，尹 炯，申 科，羅志明

(云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院甘蔗研究所，云南省甘蔗遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，開遠(yuǎn) 661699)

為建立高效、快速、準(zhǔn)確的甘蔗抗褐銹病鑒定方法，提高抗褐銹病育種效率。本研究以5個(gè)已知含抗褐銹病基因Bru1和5個(gè)高感褐銹病的甘蔗品種為試材，通過(guò)優(yōu)化PCR反應(yīng)體系、酶切體系和循環(huán)條件，構(gòu)建了甘蔗抗褐銹病基因Bru1的分子檢測(cè)體系。經(jīng)反復(fù)驗(yàn)證，該體系能高效、穩(wěn)定、準(zhǔn)確地檢測(cè)出抗褐銹病基因Bru1。22份生產(chǎn)品種抗褐銹病基因Bru1的PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，‘閩糖69-421’、‘閩糖70-611’、‘粵糖 86-368’、‘新臺(tái)糖10號(hào)’、‘新臺(tái)糖16號(hào)’、‘新臺(tái)糖22號(hào)’、‘新臺(tái)糖25號(hào)’、‘桂糖11’、‘桂糖21’、‘云蔗71-388’、‘云蔗81-173’、‘云蔗89-151’、‘云瑞99-601’、‘贛蔗95-108’等14份抗褐銹病品種含抗褐銹病基因Bru1，另8個(gè)抗褐銹病品種未檢測(cè)到抗褐銹病基因Bru1。研究結(jié)果為深入開展甘蔗抗褐銹病育種，選育和推廣優(yōu)良抗病品種，有效防控甘蔗褐銹病提供了關(guān)鍵技術(shù)和優(yōu)良抗源材料。

甘蔗褐銹病； 抗病基因Bru1； 分子檢測(cè)

由黑頂柄銹菌(PucciniamelanocephalaH.Sydow & P. Sydow)引起的甘蔗褐銹病是世界性的重要病害，常造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。該病最早于1890年在爪哇發(fā)現(xiàn)；印度自1949年以來(lái)經(jīng)常發(fā)生流行，主栽品種‘Co475’因高度感病而被迫取消栽種；20世紀(jì)70年代后，在古巴、牙買加、澳大利亞、美國(guó)、墨西哥、印度、泰國(guó)和毛里求斯等植蔗國(guó)家和地區(qū)普遍發(fā)生，并多次暴發(fā)流行，致使一些豐產(chǎn)高糖當(dāng)家品種如‘Co475’、‘T34362’、‘CP78-1247’等慘遭淘汰[1-6]。我國(guó)臺(tái)灣1977年首次發(fā)生甘蔗銹病，1982年首次在中國(guó)大陸云南甘蔗種植區(qū)發(fā)現(xiàn)該病害，之后在福建、廣東、四川、江西和廣西等蔗區(qū)先后報(bào)道。目前，該病在國(guó)內(nèi)蔗區(qū)普遍發(fā)生和蔓延危害，造成甘蔗種質(zhì)退化、產(chǎn)量降低[7-10]。發(fā)病田塊一般減產(chǎn)15%～30%，嚴(yán)重地塊減產(chǎn)幅度可達(dá)40%以上，蔗糖含量降低10%～36%[11-12]。尤其近年，我國(guó)蔗區(qū)主栽的一批豐產(chǎn)高糖品種如‘桂糖15’、‘桂糖17’、‘桂引9號(hào)’、‘P44’、‘臺(tái)糖86-1626’和主推品種‘粵糖60號(hào)’和‘德蔗03-83’等也因高度感染銹病而面臨淘汰，極大地影響了蔗糖產(chǎn)業(yè)的持續(xù)穩(wěn)定發(fā)展[11]。

選育并推廣抗病品種是控制病害最經(jīng)濟(jì)、有效的途徑，而抗病性鑒定直接影響抗病育種成效[1-2]。目前，國(guó)外研究人員已在栽培品種‘R570’上發(fā)現(xiàn)和定位了甘蔗抗褐銹病的主效基因Bru1[13-14]，該基因被證實(shí)對(duì)來(lái)自不同國(guó)家和地區(qū)的褐銹病菌具有抗性[13]，并開發(fā)出了與Bru1密切相關(guān)的2個(gè)分子標(biāo)記用于輔助選擇抗病育種[15]。而我國(guó)對(duì)甘蔗銹病的抗性鑒定評(píng)價(jià)還停留在人工接種后表型的觀察階段，尚未開展抗銹病基因標(biāo)記選擇方面的研究。傳統(tǒng)的人工接種表型選擇抗病性鑒定耗時(shí)、低效，難以滿足育種家對(duì)抗病育種的要求[16-20]。因此，為高效、準(zhǔn)確地開展甘蔗抗褐銹病鑒定和抗病育種選擇，本課題組開展了甘蔗抗銹病基因分子檢測(cè)研究，優(yōu)化建立了甘蔗抗褐銹病基因Bru1的PCR快速檢測(cè)方法，有助于提高抗性鑒定的準(zhǔn)確性和選擇效率；同時(shí)應(yīng)用建立的PCR方法對(duì)部分生產(chǎn)品種進(jìn)行了抗褐銹病基因Bru1檢測(cè)，以期為選育和利用抗病品種有效防控甘蔗銹病提供科學(xué)依據(jù)和優(yōu)良抗源材料。

1 材料與方法

1.1 材料

5份已知含抗褐銹病基因Bru1的材料‘R570’、‘新臺(tái)糖1號(hào)’、‘新臺(tái)糖9號(hào)’、‘臺(tái)糖160’、‘Q127’[18](編號(hào)R1～R5)、5份高感褐銹病材料‘CO290’、‘Q138’、‘P44’、‘桂糖15’、‘選3’(編號(hào)S1～S5)和22份抗褐銹病生產(chǎn)品種(編號(hào)為1～22，表1)共32份材料均由國(guó)家甘蔗種質(zhì)資源圃提供。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)

甘蔗抗褐銹病基因Bru1的PCR標(biāo)記R12H16和9O20-F4引物參照文獻(xiàn)[15]的方法設(shè)計(jì)，委托上海生物工程公司合成。

R12H16標(biāo)記上游引物5′-CTACGATG-AAACTACACCCTTGTC-3′，下游引物5′-CTTATGTTAGCGTGACCTATGGTC-3′，預(yù)期擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為570 bp；9O20-F4標(biāo)記上游引物5′-TACATAATTTTAGTGGCACTCA GC-3′，下游引物為5′-ACCATAATTCAATTCTGCAGGTAC-3′，預(yù)期擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)RsaⅠ酶切后可得到長(zhǎng)度為200 bp的片段。

1.2.2 甘蔗抗褐銹病基因Bru1的PCR檢測(cè)體系建立

采用北京全式金生物技術(shù)公司Easy PureTMplant Genqmic DNA Kit植物DNA提取試劑盒對(duì)R1～R5、S1～S5共10份已知基因載體的材料進(jìn)行葉片總DNA提取，具體方法步驟按照說(shuō)明書進(jìn)行，提取后用Eppendorf AG 22331蛋白/核酸分析儀鑒定提取質(zhì)量。

以抽提的葉片總DNA為模板，采用天根生化科技(北京)有限公司的TaqPCR MasterMix進(jìn)行PCR擴(kuò)增。對(duì)2個(gè)標(biāo)記PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系的DNA模板、引物濃度、TaqPCR MasterMix用量、退火溫度、循環(huán)參數(shù)等主要因子分別設(shè)多個(gè)處理進(jìn)行優(yōu)化，篩選出PCR反應(yīng)體系最佳模式。R12H16標(biāo)記最佳模式擴(kuò)增體系25 μL：ddH2O 9.5 μL、2×PCRTaqMix 12.5 μL、DNA模板2.0 μL、上下游引物各0.5 μL(20 μg/μL)；9O20-F4標(biāo)記最佳模式擴(kuò)增體系25 μL：ddH2O 12.7 μL、2×PCRTaqMix 10.5 μL、DNA模板1.0 μL、上下游引物各0.4 μL(20 μg/μL)。2個(gè)標(biāo)記的PCR擴(kuò)增程序均為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。R12H16標(biāo)記的陽(yáng)性結(jié)果需要通過(guò)限制性內(nèi)切酶RsaⅠ的消化來(lái)辨別，即PCR擴(kuò)增產(chǎn)物直接用1.5%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)；9O20-F4標(biāo)記的陽(yáng)性結(jié)果需要通過(guò)限制性內(nèi)切酶RsaⅠ的消化來(lái)判別，即PCR擴(kuò)增結(jié)束后取PCR產(chǎn)物15 μL、10×NEB buffer 2.5 μL、RsaI(10 000 U)1.0 μL、加ddH2O補(bǔ)足至25 μL 進(jìn)行酶切。酶切反應(yīng)程序：37 ℃ 2 h、65 ℃10 min，酶切結(jié)束取酶切反應(yīng)產(chǎn)物10 μL，2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.2.3 生產(chǎn)品種抗褐銹病基因Bru1的 PCR檢測(cè)

按照1.2.2 建立的擴(kuò)增體系對(duì)22份抗褐銹病生產(chǎn)品種進(jìn)行抗褐銹病基因Bru1的 PCR檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 甘蔗基因組DNA提取

采用植物DNA提取試劑盒提取甘蔗基因組DNA并檢測(cè)A值。所提取的DNA為清晰的一條帶，且A260/A280值在1.8～2.0之間，表明提取的DNA質(zhì)量較好。

2.2 甘蔗抗褐銹病基因Bru1 的PCR檢測(cè)體系

分別以抗褐銹病基因Bru1的2個(gè)特異性標(biāo)記R12H16和9O20-F4序列為引物，提取的甘蔗DNA為模板，按照1.2.2建立的方法對(duì)5份已知含Bru1的抗病材料(R1～R5)和5份感病材料(S1～S5)進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測(cè)和酶切檢測(cè)。結(jié)果顯示：5份抗病材料均穩(wěn)定擴(kuò)增出2個(gè)標(biāo)記的特異性條帶，而5份感病材料未擴(kuò)出特異性條帶(圖1)，各樣品重復(fù)檢測(cè)結(jié)果一致，表明2個(gè)特異性標(biāo)記R12H16和9O20-F4均能穩(wěn)定地檢測(cè)出抗褐銹病基因Bru1。

圖1 5份含Bru1抗病材料(R1～R5)和5份感病材料(S1～S5)的PCR擴(kuò)增和酶切結(jié)果Fig.1 PCR amplification and restriction enzyme analysis of five resistant cultivars containing Bru1 (R1-R5) and five susceptible cultivars (S1-S5)

2.3 生產(chǎn)品種抗褐銹病基因Bru1的 PCR檢測(cè)

對(duì)22份生產(chǎn)品種抗褐銹病基因Bru1的PCR檢測(cè)結(jié)果表明(表1)，‘閩糖69-421’、‘閩糖70-611’、‘粵糖 86-368’、‘新臺(tái)糖10號(hào)’、‘新臺(tái)糖16號(hào)’、‘新臺(tái)糖22號(hào)’、‘新臺(tái)糖25號(hào)’、‘桂糖11’、‘桂糖21’、‘云蔗71-388’、‘云蔗81-173’、‘云蔗89-151’、‘云瑞99-601’、‘贛蔗95-108’等14份品種和已知含抗褐銹病基因Bru1的‘R570’擴(kuò)增出目的條帶；‘粵糖93-159’、‘粵糖00-236’、‘德蔗93-94’、‘德蔗93-88’、‘川糖61-408’、‘贛蔗02-70’、‘納印310’、‘納印376’等8份品種、感病品種‘選3’均未擴(kuò)增出目的條帶(圖2)。

表1 22個(gè)生產(chǎn)品種抗褐銹病基因Bru1的 PCR檢測(cè)結(jié)果

續(xù)表1 Table 1(Continued)

樣品編號(hào)Sampleno．品種名稱Variety抗病等級(jí)Resistancegrade抗病性Resistanceresponse擴(kuò)增結(jié)果Amplificationresult10桂糖11(Guitang11)3中抗(MR)Bru111桂糖21(Guitang21)1高抗(HR)Bru112云蔗71?388(Yunzhe71?388)1高抗(HR)Bru113云蔗81?173(Yunzhe81?173)1高抗(HR)Bru114云蔗89?151(Yunzhe89?151)1高抗(HR)Bru115云瑞99?601(Yunri99?601)2抗病(R)Bru116德蔗93?94(Dezhe93?94)2抗病(R)無(wú)17德蔗93?88(Dezhe93?88)2抗病(R)無(wú)18川糖61?408(Chuantang61?408)1高抗(HR)無(wú)19贛蔗95?108(Ganzhe95?108)1高抗(HR)Bru120贛蔗02?70(Ganzhe02?70)1高抗(HR)無(wú)21納印310(NCO310)1高抗(HR)無(wú)22納印376(NCO376)1高抗(HR)無(wú)PCR5701高抗(HR)Bru1NC選3(Xuan3)9高感2(HS2)無(wú)

圖2 22份生產(chǎn)品種抗褐銹病基因Bru1的PCR擴(kuò)增和酶切結(jié)果Fig.2 PCR detection results of sugarcane brown rust resistance gene Bru1 of 22 commercial varieties

3 結(jié)論與討論

本研究以5個(gè)已知含抗褐銹病基因Bru1和5個(gè)高感褐銹病的甘蔗品種為試材，通過(guò)優(yōu)化PCR反應(yīng)體系、酶切體系和循環(huán)條件，構(gòu)建了甘蔗抗褐銹病基因Bru1的分子快速檢測(cè)體系。經(jīng)反復(fù)驗(yàn)證，該體系能高效、穩(wěn)定、準(zhǔn)確地檢測(cè)出抗褐銹病基因Bru1，為抗褐銹病甘蔗種質(zhì)資源的鑒定評(píng)價(jià)和抗褐銹病甘蔗育種提供了關(guān)鍵技術(shù)支撐。采用本研究建立的抗褐銹病基因Bru1分子快速檢測(cè)體系可以有效地選擇甘蔗抗褐銹病基因型，提高選擇效率；有助于在甘蔗種質(zhì)資源及大批量后代材料中高效、準(zhǔn)確地篩選抗銹病材料，縮短育種時(shí)間，增加抗褐銹病育種的成功率。

22份生產(chǎn)品種抗褐銹病基因Bru1的PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，‘閩糖69-421’、‘閩糖70-611’、‘粵糖 86-368’、‘新臺(tái)糖10號(hào)’、‘新臺(tái)糖16號(hào)’、‘新臺(tái)糖22號(hào)’、‘新臺(tái)糖25號(hào)’、‘桂糖11’、‘桂糖21’、‘云蔗71-388’、‘云蔗81-173’、‘云蔗89-151’、‘云瑞99-601’、‘贛蔗95-108’等14份抗褐銹病品種含抗褐銹病基因Bru1，它們是選育抗褐銹病甘蔗品種很有利用潛力的育種材料，在大力推廣應(yīng)用的同時(shí)，可作為抗病親本與野生資源雜交，分析評(píng)價(jià)其抗病遺傳力，并建立抗病種質(zhì)基因庫(kù)，進(jìn)一步選育抗褐銹病甘蔗新品種，供生產(chǎn)上推廣應(yīng)用。在甘蔗褐銹病高發(fā)蔗區(qū)加強(qiáng)‘粵糖 86-368’、‘新臺(tái)糖22號(hào)’、‘新臺(tái)糖25號(hào)’、‘云瑞99-601’、‘贛蔗95-108’等抗褐銹病優(yōu)良品種的推廣應(yīng)用，可有效控制甘蔗褐銹病大發(fā)生流行。

另一方面，8個(gè)抗褐銹病品種未檢測(cè)到抗褐銹病基因Bru1，顯示除了Bru1外，可能還有其他抗褐銹病基因存在，有待于進(jìn)一步深入研究發(fā)掘新的抗性基因源，從而克服抗源單一，有選擇性增加其他類型抗病基因在抗病育種中的引入與利用，避免由銹菌致病性發(fā)生變異引起B(yǎng)ru1抗性喪失的潛在威脅。

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Establishment and application of molecular detection approach for sugarcane brown rust resistance geneBru1

Li Wenfeng, Wang Xiaoyan, Huang Yingkun, Zhang Rongyue，Shan Hongli，Yin Jiong，Shen Ke，Luo Zhiming

(Sugarcane Research Institute, Yunnan Academy of Agricultural Sciences， Yunnan Key Laboratory of Sugarcane Genetic Improvement, Kaiyuan 661699, China)

In order to establish an efficient, rapid and accurate method for sugarcane brown rust resistance identification, and improving the breeding efficiency of brown rust resistance. In this study, five well-known cultivars containing brown rust resistance geneBru1 and five cultivars showing high susceptibility to brown rust were used as testing materials. The molecular detection approach for sugarcane brown rust resistance geneBru1 was established by optimizing the PCR reaction system, enzymatic system and cycling conditions. After repeated test and verification, this approach could effectively, stably and accurately detect sugarcane brown rust resistance geneBru1. The PCR detection results of sugarcane brown rust resistance geneBru1 of 22 commercial cultivars showed thatBru1 was detected in 14 resistant cultivars, including ‘Mintang 69-421’,‘ Mintang 70-611’,‘ Yuetang 86-368’, ‘ROC10’, ‘ROC16’, ‘ROC22’, ‘ROC25’, ‘Guitang 11’, ‘Guitang 21’, ‘Yunzhe 71-388’, ‘Yunzhe 81-173’,‘ Yunzhe 89-151’, ‘Yunri 99-601’ and ‘Ganzhe 95-108’. The geneBru1 was not detected in the other 8 resistant cultivars. These results can provide critical technique and elite resistance resources for selection and breeding of brown rust resistance, popularizing elite resistant varieties and effectively controling sugarcane brown rust disease.

sugarcane brown rust disease; resistance geneBru1; molecular detection

2014-03-03

2014-06-19

國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系(CARS-20-2-2)；云南省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系；云南省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2013BB013)。

S 435.661

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2015.02.021

* 通信作者 E-mail： huangyk64@163.com