趙巍巍，楊家強(qiáng)，周小毛*，吳青君*

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)藥研究所，長(zhǎng)沙 410128；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所，北京 100081)

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番茄斑萎病毒4種檢測(cè)方法比較

趙巍巍1，楊家強(qiáng)2，周小毛1*，吳青君2*

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)藥研究所，長(zhǎng)沙 410128；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所，北京 100081)

本研究根據(jù)番茄斑萎病毒(TSWV)S RNA上的核衣殼蛋白(N)基因保守序列設(shè)計(jì)特異性引物，比較了4種檢測(cè)方法的靈敏度。結(jié)果表明，特異性引物可擴(kuò)增出397 bp的片段，序列和已發(fā)表的TSWV核苷酸序列同源性高達(dá)99%，可用于常規(guī)PCR和熒光定量RT-PCR(qRT-PCR)檢測(cè)。qRT-PCR的靈敏度比快速檢測(cè)試紙條、雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法(DAS-ELISA)和常規(guī)PCR分別高出15 625倍、3 125倍和125倍，且能夠準(zhǔn)確定量；常規(guī)PCR 靈敏度較高，但不能準(zhǔn)確定量；DAS-ELISA方法適用于批量定性測(cè)定，但檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng)；試紙條法檢測(cè)速度最快，但靈敏度最低，使用時(shí)可根據(jù)癥狀程度和試驗(yàn)條件選擇適宜的檢測(cè)方法。

番茄斑萎病毒； DAS-ELISA； 常規(guī)PCR； 快速檢測(cè)試紙條； qRT-PCR； 靈敏度

番茄斑萎病毒(Tomatospottedwiltvirus，TSWV)是布尼亞病毒科(Bunyaviridae)，番茄斑萎病毒屬(Tospovirus)代表性成員[1]，病毒粒子近似球形[2]，寄主植物廣泛，主要侵染番茄、煙草、花生、辣椒、萵苣、大豆等蔬菜作物和數(shù)以千計(jì)的觀賞植物[3-5]。目前在世界多個(gè)國(guó)家和地區(qū)廣泛分布，在夏威夷，生菜、番茄和胡椒上由其造成的損失達(dá)60%～70%[6-7]；在法國(guó)和西班牙等歐洲國(guó)家和地區(qū)，曾因該病毒大量擴(kuò)散而引起番茄、辣椒等作物感病，造成毀滅性損失，重病地塊損失達(dá)100%；20世紀(jì)90年代末期，TSWV 在日本的菊花上嚴(yán)重發(fā)生，因其廣泛的寄主范圍和造成的巨大經(jīng)濟(jì)損失已被列為世界危害最大的十種植物病毒之一[8]。自然界中TSWV主要通過(guò)薊馬傳播，并以一種持久性循環(huán)增殖的方式傳播[9]，其中西花薊馬是其最有效的傳播載體。國(guó)外的許多研究表明，TSWV總是伴隨西花薊馬的暴發(fā)而發(fā)生。自2003年西花薊馬在北京首次發(fā)現(xiàn)，目前已分布于山東、廣東、云南、廣西、西藏等地區(qū)[10-12]。我國(guó)首次于1984年在廣州發(fā)現(xiàn)TSWV，并得到其分離物[13]。2006年，我國(guó)首次將TSWV列為全國(guó)農(nóng)業(yè)植物檢疫性有害病毒[14]，2008年，在云南蝴蝶蘭上檢測(cè)到TSWV[15]， 2009—2010年，董家紅等在云南昆明的多個(gè)地區(qū)檢測(cè)到TSWV[16]，2012年廣州檢驗(yàn)檢疫中心首次在美國(guó)進(jìn)境生菜種子中截獲TSWV[17]，李飛等2012年在北京檢測(cè)到TSWV[18]。自1915年首次在澳大利亞發(fā)現(xiàn)TSWV到現(xiàn)在已有近百年的歷史[19]，除使用抗病毒品種和對(duì)傳播介體進(jìn)行防治外，預(yù)防該病毒病的發(fā)生也很重要?？焖佟?zhǔn)確地檢測(cè)TSWV是預(yù)防工作的重要前提。

番茄斑萎病毒的檢測(cè)方法主要包括生物學(xué)檢測(cè)、電子顯微鏡檢測(cè)、血清學(xué)檢測(cè)以及分子生物學(xué)檢測(cè)等技術(shù)。生物學(xué)檢測(cè)依靠寄主植物上的典型癥狀來(lái)判斷，該方法直觀便捷，但對(duì)于其他具有類似癥狀的病毒較難分辨[20]。電鏡檢測(cè)可以直接觀察病毒的形態(tài)結(jié)構(gòu)以及病毒侵染寄主植物后所引起的植物超微結(jié)構(gòu)變化，是一種最直接的觀察工具[21]，但該方法對(duì)于病毒的分類和歸屬較難判定。血清學(xué)檢測(cè)是將免疫反應(yīng)和酶的高效催化反應(yīng)有機(jī)結(jié)合的方法，目前該方法被廣泛用于植物病毒檢測(cè)[22]。1977年，Clark和Adams采用DAS-ELISA的方法檢測(cè)出TSWV，INSV和WSMOV[22]。分子生物學(xué)檢測(cè)主要包括常規(guī)PCR、免疫捕捉RT-PCR和qRT-PCR[23]。分子生物學(xué)檢測(cè)靈敏度高，Roberts等應(yīng)用qRT-PCR技術(shù)從植物葉片總RNA中檢測(cè)到TSWV，靈敏度可達(dá)500 fg[24]，2002年，Boonham等利用Taq-Man的qRT-PCR技術(shù)成功檢測(cè)單頭西花薊馬成蟲體內(nèi)的TSWV病毒[25]。不同方法在使用成本、操作難易和靈敏度方面均存在差異[26]。

近年來(lái)，隨著我國(guó)進(jìn)出口貿(mào)易頻繁，存在TSWV暴發(fā)的潛在威脅，常規(guī)PCR和qRT-PCR在植物病毒檢測(cè)中具有靈敏度高、準(zhǔn)確快速等優(yōu)點(diǎn)備受青睞。本研究針對(duì)TSWV核衣殼蛋白(N)基因保守序列設(shè)計(jì)常規(guī)PCR和qRT-PCR新的特異引物，并建立了適宜的反應(yīng)體系和擴(kuò)增程序，同時(shí)比較了快速檢測(cè)試紙條、DAS-ELISA、常規(guī)PCR和qRT-PCR 4種方法檢測(cè)番茄斑萎病毒的靈敏度，旨在為國(guó)內(nèi)TSWV的檢驗(yàn)檢疫提供快速、準(zhǔn)確和靈敏的檢測(cè)技術(shù)，同時(shí)也為防控TSWV提供更好的技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 病毒

TSWV(TSWV-YN)病毒毒源由浙江省農(nóng)科院植物保護(hù)與微生物研究所張治軍博士提供，通過(guò)人工摩擦的方法接種于曼陀羅(Daturastramonium)上活體保存[27]，然后再轉(zhuǎn)接到試驗(yàn)寄主植株上。

1.1.2 植物材料

辣椒(CapsicumannuumL.)品種為‘中椒6號(hào)’，在溫室(27±1)℃、相對(duì)濕度70%±5%、光照周期L∥D=16 h∥8 h條件下培養(yǎng)至2～3片真葉期時(shí)用于測(cè)試，保持無(wú)蟲為害狀態(tài)。

1.2 材料處理

以具有疑似TSWV癥狀的田間辣椒植株為待測(cè)樣品；以改進(jìn)的人工摩擦法接種TSWV的辣椒植株為陽(yáng)性對(duì)照(緩沖液為0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液，pH=7.0，0.2%NaSO3，0.01 mol/L巰基乙醇)[27]；健康辣椒植株為陰性對(duì)照，共3個(gè)處理，每處理3次重復(fù)。所有處理的植株均在(27±1)℃，RH70%±5%，L∥D=16 h∥8 h的光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。經(jīng)DAS-ELISA檢測(cè)確認(rèn)發(fā)病后備用。

分別選取不同處理的辣椒葉片，剪碎混勻并等重稱取4份，分別用快速檢測(cè)試紙條、DAS-ELISA、常規(guī)PCR和qRT-PCR 4種方法進(jìn)行檢測(cè)。

1.3 主要儀器

SANYO MLR-351植物培養(yǎng)箱，日本SANYO公司；SpectraMax M 2酶標(biāo)儀，美國(guó)分子儀器公司；S-1000 Thermal Cycler PCR 儀， Molecular Imager ChemiDoc凝膠成像系統(tǒng)，美國(guó)Bio-Rad公司；ABI 7500 real time PCR儀，美國(guó)ABI公司；冷凍離心機(jī)3K15，美國(guó)Sigma公司。

1.4 主要試劑

快速檢測(cè)試紙條，DAS-ELISA TSWV試劑盒，安德珍生物技術(shù)(北京)有限公司；華越洋超快型植物RNA提取試劑盒，北京華越洋生物科技有限公司；TaKaRa PrimeScriptTMRT Reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)試劑盒、瓊脂糖，pMDTM18T Vector Cloning Kit，寶生物工程(大連)有限公司；DNA純化回收試劑盒，上海捷瑞生物工程有限公司；快速質(zhì)粒小提取試劑盒，SuperReal PreMix Plus(SYBR Green I)，天根生化科技(北京)有限公司；EcoR V限制性內(nèi)切酶，NEB(北京)有限公司； 2×ESTaqMaster Mix，北京康為世紀(jì)生物科技有限公司。

1.5 快速檢測(cè)試紙條檢測(cè)TSWV

參照安德珍快速檢測(cè)試紙條說(shuō)明書，將待測(cè)樣品提取液5倍梯度稀釋(51～54倍)，取100 μL到試紙條的點(diǎn)樣孔中，30 s后若對(duì)照線(C)不顯色，則結(jié)果無(wú)效；若觀察孔內(nèi)C線和待測(cè)(T)線同時(shí)顯色，該樣品呈陽(yáng)性；若C線顯色而T線不顯色，則該樣品為陰性，T線的顏色深淺可粗略判斷病毒含量的高低。

1.6 DAS-ELISA檢測(cè)TSWV

參照安德珍TSWV DAS-ELISA試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行，待測(cè)樣品置于常規(guī)提取緩沖液中碾碎，樣品和提取液比例是1 g/10 mL，然后將上清液按5倍梯度稀釋51～55倍后進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)，并在405 nm波長(zhǎng)下讀取吸光值，每個(gè)濃度3次重復(fù)。

1.7 常規(guī)PCR檢測(cè)TSWV

樣品總RNA提取參照華越洋超快型植物RNA提取試劑盒說(shuō)明書，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA完整性，Nanodrop 2000 c分光光度計(jì)檢測(cè)RNA純度，A260/A280比值在1.9～2.0之間可進(jìn)行下一步試驗(yàn)。使用TaKaRa PrimerScriptTMRT Reagent Kit with gDNA Eraser合成cDNA第一鏈，定量到1 ng/μL，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

根據(jù)NCBI中GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)已登錄的不同分離株的TSWV 核衣殼蛋白基因(N)序列(TSWV-N)，經(jīng)序列多重比對(duì)，根據(jù)保守序列設(shè)計(jì)擴(kuò)增產(chǎn)物為397 bp的特異性引物：TSWV-F：5′-CAGGATTGGAGCCACCGACAT-3′，TSWV-R：5′-AGCATACTCTTTCCCTTTCT-3′，并根據(jù)此擴(kuò)增產(chǎn)物設(shè)計(jì)片段大小為113 bp的定量引物：TSWV-113F：5′-CTTGCCATAATGCTGGGAGGTAG-3′，TSWV-113R：5′-ATCC-CGAGGTCTTTGTATTTTGC-3′，引物均由上海生工有限公司合成。

將待測(cè)樣品的cDNA用DEPC處理的去離子水按5倍梯度稀釋51～58倍，以不同稀釋倍數(shù)的cDNA作為模板進(jìn)行常規(guī)PCR，以檢測(cè)其靈敏度。PCR反應(yīng)體系為20 μL：模板2 μL、TSWV-F 0.5 μL、TSWV-R 0.5 μL、2×ESTaqMasterMix 10 μL、ddH2O 7 μL。PCR程序?yàn)?4 ℃預(yù)變性5 min； 94 ℃變性30 s，58 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。擴(kuò)增產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，并由北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司測(cè)序，測(cè)序后的序列通過(guò)BLAST進(jìn)行序列比對(duì)分析。

1.8 qRT-PCR檢測(cè)

將常規(guī)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物連接至pMDTM18T載體，方法參照載體說(shuō)明書。挑取陽(yáng)性克隆于含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜，按照天根快速質(zhì)粒小提取試劑盒說(shuō)明書提取質(zhì)粒，提取完后用限制性內(nèi)切酶EcoR V將質(zhì)粒線性化并鑒定，測(cè)定質(zhì)粒濃度，-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

參照SuperReal PreMix Plus(SYBR Green I)試劑盒說(shuō)明書加樣，反應(yīng)體系為20 μL：cDNA 1 μL，TSWV-113F 0.5 μL，TSWV-113R 0.5 μL，2×SuperReal PreMix Plus 10 μL，50×ROX Reference Dye 1 μL，ddH2O 7 μL。最佳反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃預(yù)變性15 min；95 ℃變性10 s、60 ℃退火32 s、72 ℃延伸32 s，40個(gè)循環(huán)每個(gè)模板4次技術(shù)重復(fù)。樣品加完后放置于ABI 7500 Real Time PCR儀中進(jìn)行擴(kuò)增。以質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品為模板(91.7 ng/μL)按5倍梯度稀釋成8個(gè)不同濃度，利用熒光定量引物TSWV-113F/TSWV-113R進(jìn)行qRT-PCR，生成外部標(biāo)準(zhǔn)曲線。

為檢測(cè)qRT-PCR靈敏度，將待測(cè)樣品的cDNA用DEPC處理的去離子水以5倍梯度稀釋51～59倍，以稀釋的cDNA為模板進(jìn)行qRT-PCR。

1.9 數(shù)據(jù)分析

DAS-ELISA數(shù)據(jù)由SpectraMax M 2儀器的SoftMax Pro軟件導(dǎo)出，實(shí)時(shí)熒光定量PCR數(shù)據(jù)由ABI 7500 Real Time PCR儀軟件7500 software v 2.0.1獲取，數(shù)據(jù)分析使用SPSS 18.0，圖表使用SigmaPlot 12.5軟件制作。

2 結(jié)果與分析

2.1 快速檢測(cè)試紙條檢測(cè)TSWV

梯度稀釋的待測(cè)樣品進(jìn)行快速試紙條檢測(cè)結(jié)果顯示，樣品在51倍稀釋后窗口區(qū)C線和T線均出現(xiàn)明顯的條帶，在52倍稀釋后條帶微弱、模糊，表明52倍稀釋達(dá)到快速檢測(cè)試紙條靈敏度的極限(圖1)。

圖1 不同稀釋倍數(shù)待測(cè)樣品快速檢測(cè)試紙條檢測(cè)結(jié)果Fig.1 Detection of TSWV samples at different dilution ratios with rapid detection test strip

2.2 DAS-ELISA檢測(cè)TSWV

根據(jù)安德珍DAS-ELISA TSWV診斷試劑盒說(shuō)明書，若樣品顏色為明顯黃色且2孔的吸收值均高于該板陰性平均值的3倍，該樣品計(jì)為陽(yáng)性；若樣品僅1孔高于陰性平均值3倍，則該樣品不參與統(tǒng)計(jì)。根據(jù)圖2結(jié)果顯示，當(dāng)待測(cè)樣品連續(xù)進(jìn)行5個(gè)梯度稀釋后， 稀釋倍數(shù)為51～53的3個(gè)樣品A405 nm平均值高于陰性3倍，54低于3倍，接近陰性對(duì)照，表明54倍稀釋達(dá)到DAS-ELISA檢測(cè)的極限。

圖2 不同稀釋倍數(shù)樣品DAS-ELISA檢測(cè)結(jié)果Fig.2 Detection of TSWV samples at different dilution ratios with DAS-ELISA

2.3 常規(guī)PCR檢測(cè)TSWV

采用TSWV-F/TSWV-R對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行常規(guī)PCR擴(kuò)增，在400 bp左右可以看到與預(yù)期片段大小一致的目標(biāo)條帶(圖3)，將獲得的目的條帶進(jìn)行測(cè)序，并通過(guò)BLAST比對(duì)發(fā)現(xiàn)待測(cè)樣品序列與陽(yáng)性對(duì)照序列一致，大小為397 bp，且該病毒的核衣殼蛋白基因(N)序列和已發(fā)表的番茄斑萎病毒核苷酸序列(KC294570.1)同源性高達(dá)99%，表明該樣品攜帶番茄斑萎病毒。

待測(cè)樣品cDNA按照5倍梯度稀釋后進(jìn)行常規(guī)PCR，結(jié)果顯示(圖4)，稀釋倍數(shù)為51～53的3個(gè)樣品能擴(kuò)增出明顯的靶帶，稀釋倍數(shù)為54～55的2個(gè)樣品條帶微弱、模糊，當(dāng)cDNA稀釋倍數(shù)大于55時(shí)，擴(kuò)增不出任何條帶，表明55倍稀釋已達(dá)到常規(guī)PCR檢測(cè)極限。

圖3 常規(guī)PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.3 Electrophoresis of conventional PCR products

圖4 不同稀釋倍數(shù)樣品常規(guī)PCR檢測(cè)結(jié)果Fig.4 Detection of TSWV samples at different dilution ratios with conventional PCR

2.4 qRT-PCR檢測(cè)TSWV

以基因起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，以Ct值為縱坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。回歸方程為：y=-3.459 2x+43.47，相關(guān)系數(shù)為0.998 7，擴(kuò)增效率為94.57%，Ct值范圍在16.25～33.37(圖5)，斜率值范圍在-3.0～-3.6之間即可滿足qRT-PCR對(duì)擴(kuò)增效率的要求。本次試驗(yàn)制備標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率為-3.459 2，完全符合試驗(yàn)要求，表明該標(biāo)準(zhǔn)曲線可以用于TSWV定量檢測(cè)分析。質(zhì)粒的拷貝數(shù)(copies/μL)=6.02×1023(copies/mol)×質(zhì)粒濃度(g/μL)/質(zhì)粒分子量 (g/mol)[28]。

待測(cè)樣品5倍梯度稀釋后，qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，cDNA稀釋至58倍時(shí)仍可有效檢測(cè)，TSWV-N拷貝數(shù)為3.08×102copies/μL，而當(dāng)cDNA稀釋至59時(shí)(表1)，Ct值接近陰性對(duì)照，說(shuō)明qRT-PCR只能檢測(cè)到58倍稀釋。

2.5 4種檢測(cè)方法靈敏度匯總

試驗(yàn)結(jié)果顯示，4種不同檢測(cè)方法的靈敏度由高到低依次為qRT-PCR>常規(guī)PCR>DAS-ELISA>快速檢測(cè)試紙條(表2)，其中DAS-ELISA和快速檢測(cè)試紙條的檢測(cè)靈敏度接近，DAS-ELISA的靈敏度略高，而qRT-PCR的靈敏度比快速檢測(cè)試紙條、DAS-ELISA和常規(guī)PCR分別高出15 625倍、3 125倍和125倍。

表2 4種TSWV檢測(cè)方法靈敏度匯總1)

1)“+”表示能有效檢測(cè)；“-”代表未能有效檢測(cè)。

+, Effectively detected;-, Ineffectively detected.

3 討論

番茄斑萎病毒是世界范圍內(nèi)一種非常重要且極具破壞性的危險(xiǎn)性植物病毒病害，能感染多種花卉及蔬菜作物，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。早期快速、特異性檢測(cè)是植物病毒病害防控研究中最為重要的一個(gè)環(huán)節(jié)，對(duì)防止該病害的傳播蔓延具有極其重要的意義。雖然早在1984年我國(guó)就已報(bào)道發(fā)現(xiàn)該病毒，但隨后的10多年并未有大量報(bào)道。近年來(lái)隨著我國(guó)與其他國(guó)家花卉苗木貿(mào)易頻繁，加上西花薊馬危害范圍逐步擴(kuò)大，該病毒已在我國(guó)多個(gè)地區(qū)檢測(cè)到，為我國(guó)貿(mào)易生產(chǎn)帶來(lái)嚴(yán)重的安全隱患。

不同寄主植物上TSWV癥狀表現(xiàn)不盡相同，給病毒的檢測(cè)帶來(lái)困難，本研究比較了4種番茄斑萎病毒檢測(cè)方法的靈敏度，靈敏度由高到低依次為：qRT-PCR>常規(guī)PCR>DAS-ELISA>快速檢測(cè)試紙條?？焖贆z測(cè)試紙條是一種簡(jiǎn)便快捷的膠體金免疫層析技術(shù)，適合基層推廣使用，該方法由于檢測(cè)靈敏度和定量水平低，只適合在病毒濃度較高的情況下檢測(cè)；DAS-ELISA技術(shù)目前是我國(guó)進(jìn)出口檢驗(yàn)檢疫病毒的主要方法，也是病毒診斷與檢測(cè)的一種常規(guī)手段，該方法具有方法簡(jiǎn)便，成本低，能批量檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)，但是檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng)且存在非特異性顏色反應(yīng)干擾，容易出現(xiàn)假陽(yáng)性而不能滿足特異性和高靈敏度等的需要；常規(guī)PCR和qRT-PCR比快速檢測(cè)試紙條和DAS-ELISA特異性和靈敏度更高，但常規(guī)PCR不能準(zhǔn)確定量，也易出現(xiàn)交叉污染，產(chǎn)生假陽(yáng)性；qRT-PCR檢測(cè)靈敏度遠(yuǎn)高于常規(guī)PCR，為常規(guī)PCR 的近125 倍，qRT-PCR不僅能定性，更能直接定量，因其加樣只需打開一次蓋子，隨后完全是閉管操作，可以有效地防止擴(kuò)增過(guò)程中出現(xiàn)交叉污染和假陽(yáng)性且整個(gè)過(guò)程只需1～2 h，該技術(shù)不僅加快了檢測(cè)速度也有效地提高了檢測(cè)的靈敏度和準(zhǔn)確度，特別適用于在早期病毒含量較低時(shí)檢測(cè)，這項(xiàng)技術(shù)已成為植物病原鑒定和病害診斷的標(biāo)準(zhǔn)方法。但是由于對(duì)核酸質(zhì)量要求高，儀器設(shè)備昂貴等因素影響了該技術(shù)的廣泛應(yīng)用。建議在檢測(cè)TSWV 時(shí)應(yīng)根據(jù)實(shí)際情況選用適宜的方法，或?qū)⑸鲜龆喾N方法綜合使用，以避免錯(cuò)過(guò)防治的最佳時(shí)機(jī)。通常在檢測(cè)時(shí)，可先用快速檢測(cè)試紙條或DAS-ELISA對(duì)癥狀明顯的植株進(jìn)行初步鑒定，用常規(guī)PCR或qRT-PCR進(jìn)行最后的確診以得出更加準(zhǔn)確的檢測(cè)結(jié)果。

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Comparison of four methods for detecting Tomato spotted wilt virus

Zhao Weiwei1，Yang Jiaqiang2，Zhou Xiaomao1，Wu Qingjun2

(1. Institute of Pesticide Science， Hunan Agricultural University，Changsha 410128， China；2. Institute of Vegetables and Flowers，Chinese Academy of Agricultural Sciences， Beijing 100081， China)

Specific primers were designed according to the conserved sequence of the nucleocapsid protein (N) gene ofTomatospottedwiltvirus(TSWV) S RNA, and the sensitivities of four methods for detecting TSWV were compared. The results showed that a 397 bp fragment was amplified with the specific primers, and the sequence showed a homology of 99% with the published TSWV nucleotide sequence. The designed primers could be used for conventional PCR and quantitative reverse transcription-PCR (qRT-PCR) methods. The sensitivity of qRT-PCR for detecting TSWV was 15 625 fold, 3 125 fold and 125 fold higher than that of the rapid detection test strip (RDTT), double sandwich enzyme-linked immunosorbent assay (DAS-ELISA) and conventional PCR, respectively. Moreover, qRT-PCR method can be accurately quantified. Conventional PCR showed a higher sensitivity, but it cannot be accurately quantified. DAS-ELISA is suitable for batch qualitative detection but it needs a longer detection time. RDTT is the fastest method, but the sensitivity is the lowest. Suitable detection methods can be selected according to the symptom degree and the experimental conditions.

Tomatospottedwiltvirus; DAS-ELISA; conventional PCR; rapid detection test strip; qRT-PCR; sensitivity

2014-07-04

2014-10-09

國(guó)家科技支撐計(jì)劃(2012BAD19B06)；北京市自然科學(xué)基金(6122028)；現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系北京市葉類蔬菜創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)建設(shè)專項(xiàng)資金(blvt-15)；北京市科委課題(Z121100001212006)；蔬菜有害生物控制與優(yōu)質(zhì)栽培北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

S 432.41

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2015.02.019

* 通信作者 E-mail:zhouxm1972@126.com；wuqingjun@caas.cn