楊成德, 王 振, 代萬(wàn)安, 郝蓉蓉, 劉心剛, 楊 杰

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 甘肅省草業(yè)工程實(shí)驗(yàn)室, 中-美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心,蘭州 730070; 2. 西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學(xué)院蔬菜研究所, 拉薩 850032)

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西藏設(shè)施茄子鐮孢根腐病病原的分離及鑒定

楊成德1, 王 振1, 代萬(wàn)安2, 郝蓉蓉1, 劉心剛1, 楊 杰2

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 甘肅省草業(yè)工程實(shí)驗(yàn)室, 中-美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心,蘭州 730070; 2. 西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學(xué)院蔬菜研究所, 拉薩 850032)

本試驗(yàn)對(duì)西藏設(shè)施茄子鐮孢根腐病癥狀和病原進(jìn)行了研究。結(jié)果表明,其癥狀主要表現(xiàn)為植株根部或莖基部逐漸腐爛,后導(dǎo)致整個(gè)植株萎蔫枯死。根據(jù)病原菌形態(tài)特征及ITS序列分析結(jié)果,將致病菌鑒定為層出鐮孢(Fusariumproliferatum),該病原菌的最適生長(zhǎng)溫度為30 ℃,最適碳源為樹(shù)膠醛糖和甘露糖,最適氮源為硝酸鈉;研究結(jié)果為該病害的綜合防治提供依據(jù)。

茄子根腐病; 鑒定; 生物學(xué)特性

隨著生活水平的提高,對(duì)蔬菜的需求量越來(lái)越大,且正向新鮮和安全的潔凈蔬菜轉(zhuǎn)變[1]。有“世界屋脊”之稱的西藏自治區(qū)從20世紀(jì)80年代在拉薩城關(guān)區(qū)蔡公堂鄉(xiāng)、堆龍德慶縣及林芝地區(qū)等地新建溫室或大棚進(jìn)行設(shè)施蔬菜生產(chǎn),極大地滿足了當(dāng)?shù)厝嗣駥?duì)各種蔬菜的需求,蔬菜播種面積由1985年占農(nóng)作物播種面積的1.61%提高到2011年的9.49%[2]。隨著蔬菜種植年限的增長(zhǎng),根腐病發(fā)生越來(lái)越重,主要原因是溫室大棚修建之后多年不移動(dòng),使用的土地相對(duì)固定,且在溫室和大棚種植的蔬菜主要集中在茄科和葫蘆科,輪作倒茬困難,使土壤中病原菌逐年積累;另一方面,農(nóng)戶對(duì)預(yù)防為主的防控策略重視不夠,如在土壤消毒、無(wú)病土育苗及有機(jī)肥充分腐熟等方面做得不到位,沒(méi)有徹底清潔溫室環(huán)境,病殘?bào)w隨意處理,造成人為傳播嚴(yán)重。設(shè)施蔬菜生產(chǎn)是農(nóng)業(yè)增效、農(nóng)民增收的重要途徑之一,也是促進(jìn)農(nóng)牧區(qū)農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)發(fā)展的重要措施之一。但根腐病成為制約設(shè)施蔬菜生產(chǎn)的主要問(wèn)題之一,同時(shí)根腐病的發(fā)生對(duì)新種植戶的積極性打擊較大,對(duì)設(shè)施蔬菜的示范推廣造成一定困難,也對(duì)市場(chǎng)蔬菜的供應(yīng)產(chǎn)生了影響[3]。因此,2011年對(duì)西藏拉薩郊縣和林芝等地區(qū)設(shè)施茄子生產(chǎn)地進(jìn)行了根腐病調(diào)查,以期明確設(shè)施茄子鐮孢根腐病菌的種類(lèi)和發(fā)生程度,為綜合防治提供依據(jù),也為設(shè)施蔬菜的持續(xù)發(fā)展提供技術(shù)支撐。

1 材料和方法

1.1 供試材料

供試病原菌：分離自西藏自治區(qū)拉薩市城關(guān)區(qū)設(shè)施茄子根部的鐮孢菌(Fusariumsp.)。

供試培養(yǎng)基[4]：PDA培養(yǎng)基和PSA培養(yǎng)基用于病原菌的分離和純化;PS液體培養(yǎng)基用于病原菌DNA的提取。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 癥狀的描述及病原的分離與純化

在西藏自治區(qū)拉薩市城關(guān)區(qū)蔡公堂鄉(xiāng)對(duì)典型病株進(jìn)行癥狀描述后采集病株帶回實(shí)驗(yàn)室,按照常規(guī)組織分離法分離病原菌,在PSA培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)與純化,將純化獲得的菌株黑暗培養(yǎng),待產(chǎn)孢后進(jìn)行單孢分離[5],進(jìn)一步純化后移入PSA斜面培養(yǎng)保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 致病性測(cè)定

在實(shí)驗(yàn)室采用根部接種法,將供試菌株用無(wú)菌水配制成孢子懸浮液(約 106個(gè)/mL)，取約10 mL接種到健康茄子植株根圍,以無(wú)菌水為對(duì)照,后連續(xù)觀察植株的發(fā)病情況,形成典型癥狀后,對(duì)病原菌進(jìn)行再分離,按柯赫氏法則確定病原菌。

1.2.3 不同溫度對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響

采用生長(zhǎng)速率法。經(jīng)活化的病原菌用0.5 cm直徑的打孔器切取菌餅,接種到PSA平板中央,置于0、5、10、15、20、25、30、35和40 ℃下培養(yǎng), 5次重復(fù),5 d后用十字交叉法測(cè)量菌落直徑,所得數(shù)據(jù)用Excel軟件作圖。

1.2.4 不同碳氮源對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響

將病原菌接種于含1%的碳源(葡萄糖、乳糖、D-樹(shù)膠醛糖、麥芽糖、氯醛糖、D-半乳糖、蔗糖、可溶性淀粉、甘露糖、D-木糖、D-果糖)和含0.25%氮源(氯化銨、硝酸銨、碳酸銨、硝酸鈉、L-谷氨酸、尿素、大豆蛋白胨、L-組氨酸、 L-精氨酸、亮氨酸、蛋白胨、甘氨酸)的馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基后置于最適溫度下培養(yǎng),分別以不加碳氮源的水瓊脂為對(duì)照,5次重復(fù),5 d后用十字交叉法測(cè)量菌落直徑,所得數(shù)據(jù)用Excel軟件作圖。

1.2.5 病原菌的鑒定

1.2.5.1 形態(tài)學(xué)鑒定

將經(jīng)致病性測(cè)定的病原菌培養(yǎng)產(chǎn)孢后,在顯微鏡(10倍×40倍)下觀察分生孢子梗和分生孢子特征,測(cè)定100個(gè)分生孢子大小,并顯微拍照。根據(jù)病原形態(tài)、大小,查閱相關(guān)資料[6-8],確定屬種。

1.2.5.2 基因序列分析鑒定

病原菌經(jīng)活化培養(yǎng)后取50～100 mg新鮮菌絲,液氮中充分研磨成粉末,采用上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司的UNIQ-10柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒提取病原菌基因組DNA。選取由上海生工生物工程有限公司合成的通用引物ITS1(5′-TCC GTA GGT GAA CCT GCG G-3′)和ITS4(5′-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3′)進(jìn)行PCR擴(kuò)增;擴(kuò)增體系為50 μL,即10×PCR buffer 5.0 μL,TaqDNA聚合酶(2 U/μL)1.2 μL,ITS1 (10 mmol/L)2.0 μL,ITS4 (10 mmol/L)2.0 μL,dNTPs (10 mmol/L)3.0 μL,DNA模板(10 ng/μL)2.0 μL (以加2.0 μL ddH2O為陰性對(duì)照),ddH2O 34.8 μL;擴(kuò)增程序?yàn)?5 ℃預(yù)變性3 min;94 ℃變性1 min,52 ℃退火1 min,72 ℃延伸1.5 min,30 個(gè)循環(huán);72 ℃終延伸10 min。將具特異性條帶的PCR產(chǎn)物送上海生工生物工程有限公司測(cè)序;所測(cè)序列提交到GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行相似性比較,并與GenBank中的相似序列在Claustal 1.8程序包中進(jìn)行多重序列匹配排列分析,最后形成一個(gè)多序列匹配排列陣,用MEGA 4.0程序包中的Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù),明確其系統(tǒng)發(fā)育地位。

2 結(jié)果與分析

2.1 癥狀描述

茄子發(fā)病后,初期表現(xiàn)為葉片變黃,生長(zhǎng)緩慢,后下部葉片萎蔫下垂,植株莖基部或根部表皮逐漸腐爛,并與木質(zhì)部分離,最后整個(gè)植株萎蔫枯死,潮濕時(shí)發(fā)病部位有白色霉層。

2.2 病原的分離和致病性測(cè)定

利用常規(guī)分離方法獲得6株鐮孢霉屬真菌,經(jīng)室內(nèi)接種只有1株可以引起典型癥狀,并從發(fā)病植株上再次分離到了所接種的菌株,表明該鐮孢霉菌即為茄子鐮孢根腐病的病原菌。

2.3 病原鑒定

2.3.1 形態(tài)學(xué)鑒定

從拉薩市城關(guān)區(qū)分離的茄子鐮孢根腐病的病原菌菌落白色,均勻隆起,絨狀,較厚,菌背白色;菌絲無(wú)色,有隔,直徑1.2～3.5 μm,有球狀膨大體;大型分生孢子馬特型,稍彎曲,隔膜不清晰(圖1),大小(18.8～23.5)μm×(2.4～2.9)μm;小型分生孢子短桿狀,兩端圓,較多,大小(5.9～11.8)(8.2)μm×(1.4～2.4)(1.8)μm;產(chǎn)孢梗單瓶梗,大小(9.4～37.6)(17.9)μm×(1.8～2.9)(2.1)μm。根據(jù)其形態(tài)特征鑒定其為鐮孢屬真菌Fusariumsp.,種待定。

圖1 茄子鐮孢根腐病菌的大型分生孢子Fig.1 The macroconidia of eggplant Fusarium rot

2.3.2 病原ITS鑒定

經(jīng)PCR擴(kuò)增和測(cè)序,病原菌rDNA-ITS的堿基長(zhǎng)度為563 bp,在系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中,茄子鐮孢根腐病病原菌與GenBank中層出鐮孢菌(Fusariumproliferatum)(FJ040179)聚在一起(圖2),且相似性在99%以上,結(jié)合形態(tài)特征鑒定其為層出鐮孢菌(F.proliferatum)。

圖2 茄子根腐病菌的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.2 The phylogenetic tree of Fusarium proliferatum

2.4 病原生物學(xué)及培養(yǎng)性狀測(cè)定

2.4.1 生長(zhǎng)溫度測(cè)定

圖3表明,茄子層出鐮孢菌在10～40 ℃均可生長(zhǎng),適宜溫度為25～35 ℃,最適溫度為30 ℃。

2.4.2 碳源利用能力測(cè)定

圖4表明,茄子層出鐮孢菌對(duì)供試的11種碳源均可利用,在以乳糖為碳源的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)最慢,菌落直徑只大于水瓊脂對(duì)照1.1 cm;在以D-樹(shù)膠醛糖和甘露糖為碳源的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)最快,菌落直徑大于對(duì)照(水瓊脂)2.7 cm;在其他供試碳源上生長(zhǎng)速率差異不明顯,但菌落直徑均大于水瓊脂培養(yǎng)基上的菌落直徑。

圖3 溫度對(duì)茄子層出鐮孢菌菌絲生長(zhǎng)的影響Fig.3 The effect of temperature on mycelium growth of Fusarium proliferatum

圖4 碳源對(duì)茄子層出鐮孢菌菌絲生長(zhǎng)的影響Fig.4 The effect of C-source on mycelium growth of Fusarium proliferatum

2.4.3 氮源利用能力測(cè)定

圖5表明,茄子層出鐮孢菌對(duì)供試的12種氮源均可利用,在以碳酸銨、L-谷氨酸為氮源的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)最慢,菌落直徑小于水瓊脂對(duì)照2.3～4.0 cm;在以氯化銨、硝酸銨、硝酸鈉、大豆蛋白胨、亮氨酸和蛋白胨為氮源的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)速率差異不大,但均高于水瓊脂對(duì)照,說(shuō)明這些供試氮源對(duì)該病原菌有促進(jìn)作用。

3 結(jié)論與討論

鐮孢菌(Fusariumspp.)因其在無(wú)性階段產(chǎn)生的大型分生孢子形似鐮刀而得名。1809年Link首先從錦葵科植物上發(fā)現(xiàn)第一株鐮孢菌,定名為粉紅鐮孢菌(F.roseumLink)。鐮孢菌種類(lèi)多,迄今已發(fā)現(xiàn)40余種,普遍存在于土壤及動(dòng)植物有機(jī)體內(nèi),其中不少是導(dǎo)致多種農(nóng)林植物病害的病原菌。鐮孢菌的分類(lèi)鑒定是一項(xiàng)十分復(fù)雜的工作,一般植物病原真菌主要依據(jù)營(yíng)養(yǎng)體和子實(shí)體進(jìn)行鑒定[9-10],但是,大部分鐮孢菌形態(tài)相似,且一些鐮孢菌的產(chǎn)孢條件難于摸索[11],利用鐮孢菌形態(tài)特征在種水平上進(jìn)行鑒定并非易事。近年研究表明真菌rDNA的ITS 區(qū)段既具保守性,又在科、屬、種水平上均有特異性,因此,常常將這一可變區(qū)作為真菌種和分離物鑒定的可靠依據(jù)之一[12-13],如Volossiouk[14]根據(jù) ITS序列設(shè)計(jì)合成的引物ITS-Fu-f和ITS-Fu-r在棉花枯萎病菌(F.oxysporumf.sp.vasinfectum)的專(zhuān)化性和靈敏度方面做了深入研究。本研究采用形態(tài)學(xué)和分子鑒定相結(jié)合的方法,將致病菌鑒定為層出鐮孢菌(Fusariumproliferatum),該菌有侵染玉米的報(bào)道[15],但侵染茄子為首次報(bào)道。

圖5 氮源對(duì)茄子層出鐮孢菌菌絲生長(zhǎng)的影響Fig.5 The effect of N-source on mycelium growth of Fusarium proliferatum

該病原菌生物學(xué)特性研究表明,病原菌生長(zhǎng)最適溫為30 ℃,能夠在10～40 ℃條件下生長(zhǎng),溫度過(guò)高或過(guò)低對(duì)菌絲生長(zhǎng)均不利;在供試的所有碳源中,最佳碳源是樹(shù)膠醛糖和甘露糖;氯化銨、硝酸銨、硝酸鈉、大豆蛋白胨、亮氨酸和蛋白胨等氮源對(duì)菌絲生長(zhǎng)有促進(jìn)作用,但差異不顯著,碳酸銨、谷氨酸可抑制

該病原菌的生長(zhǎng)。本試驗(yàn)較全面地研究了西藏設(shè)施茄子鐮孢根腐病的癥狀和病原的培養(yǎng)性狀及生物學(xué)特性等,且利用ITS序列分析對(duì)其進(jìn)行了鑒定,為西藏設(shè)施茄子根腐病的診斷和綜合防治提供依據(jù)。

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(責(zé)任編輯：楊明麗)

Isolation and identification of the pathogen of eggplant root rot in Tibet Autonomous Region

Yang Chengde1, Wang Zhen1, Dai Wan’an2, Hao Rongrong1, Liu Xingang1, Yang Jie2

(1. College of Prataculture, Gansu Agricultural University; Key Laboratory of Grassland Ecosystem, Ministry of Education;Pratacultural Engineering Laboratory of Gansu Province; Sino-U.S.Center for Grazingland Ecosystem Sustainability, Lanzhou 730070, China; 2. Institute of Vegetables, Tibetan Institute of Agriculture and Animal Husbandry, Lhasa 850032, China)

The symptoms and pathogen of eggplant root rot were studied. The results showed that the symptom was rot of roots or stems, and then the plants wilted. Based on morphological characteristics and ITS sequence analysis, the pathogenic fungus was identified asFusariumproliferatum. The optimum growth temperature was 30 ℃. The optimum carbon source were arabinose and mannose, and the optimum nitrogen source was sodium nitrate. This study provided a foundation for controlling the disease.

eggplant root rot; identification; biological characteristics

2014-03-17

2014-05-12

西藏自治區(qū)科技廳重點(diǎn)科研項(xiàng)目(2012年)

S 436.41

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2015.03.024

聯(lián)系方式 E-mail: yangcd@gsau.edu.cn