高 波, 王容燕, 馬 娟, 李秀花, 陳書龍

(河北省農(nóng)林科學(xué)院植物保護(hù)研究所,河北省農(nóng)業(yè)有害生物綜合防治工程技術(shù)研究中心,農(nóng)業(yè)部華北北部作物有害生物綜合治理重點實驗室, 保定 071000)

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河北省甘薯莖腐病研究初報

高 波, 王容燕, 馬 娟, 李秀花, 陳書龍*

(河北省農(nóng)林科學(xué)院植物保護(hù)研究所,河北省農(nóng)業(yè)有害生物綜合防治工程技術(shù)研究中心,農(nóng)業(yè)部華北北部作物有害生物綜合治理重點實驗室, 保定 071000)

甘薯莖腐病是近幾年在我國發(fā)現(xiàn)的一種新的細(xì)菌性病害,目前該病已在我國的福建、廣東、江西、廣西、海南、河南、重慶、江蘇等地發(fā)生。2013年10月在對河北省甘薯病害的調(diào)查中在文安縣發(fā)現(xiàn)了大量疑似甘薯莖腐病的病株,給當(dāng)?shù)氐母适砩a(chǎn)造成了嚴(yán)重的影響。經(jīng)對疑似病株病原菌的分離純化、柯赫氏法則驗證、形態(tài)觀察以及基于16S rDNA序列的分析,最終確定該病害為甘薯莖腐病,病原菌為達(dá)旦提狄克氏菌(Dickeyadadantii)。這是該病害首次在河北省被發(fā)現(xiàn)。

甘薯莖腐病; 細(xì)菌性病害; 達(dá)旦提狄克氏菌

甘薯[Ipomoeabatatas(L.)Lam.]在我國是繼小麥、水稻、玉米、大豆之后的第五大糧食作物,種植面積和總產(chǎn)量分別約占世界的70%和85%,常年種植面積在700萬hm2左右[1],但病蟲害的發(fā)生卻嚴(yán)重地制約著我國甘薯的產(chǎn)量和品質(zhì)。

甘薯莖腐病(又名甘薯黑腐病)是國內(nèi)外甘薯生產(chǎn)上的重要病害之一,是由達(dá)旦提狄克氏菌(Dickeyadadantii)(又名Erwiniachrysanthemi)引起的一種細(xì)菌性病害。該病于1974年在美國的喬治亞州首次暴發(fā)流行,給該州的甘薯產(chǎn)業(yè)造成了嚴(yán)重的影響。該病的病原最初由Martin等[2]鑒定為胡蘿卜軟腐歐文氏菌(E.carotovora),之后Schaad等[3]通過對比3種歐文氏菌的生理生化指標(biāo)最終確定引起甘薯莖腐病的病原為E.chrysanthemi,對14個甘薯品種的抗病性進(jìn)行檢測發(fā)現(xiàn)所有品種均不具抗性。該病菌寄主范圍廣泛,除危害甘薯外,還可侵染菊花、雛菊、煙草、番茄、馬鈴薯、茄子、卷心菜、大豆、矮牽牛等多種植物。1989年,Clark等[4]研究發(fā)現(xiàn)甘薯莖腐病的發(fā)病率與病原菌的侵染濃度、甘薯的品種抗性以及甘薯受侵染的部位有關(guān)。1992年,Duarte等[5]對該病的病害循環(huán)進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)攜帶病菌的薯塊和莖蔓都能成為來年的初侵染源。2005年,Samon等[6]對龐雜的E.chrysanthemi重新進(jìn)行分類并建立了Dickeya屬,設(shè)定了4個新種D.dadantii、D.dianthicola、D.dieffenbachiae和D.zeae。甘薯莖腐病在我國最早于1990年在福建地區(qū)暴發(fā)流行,根據(jù)其癥狀特點初步被鑒定為Erwiniasp.[7]。2010年Huang等報道了該病在我國廣東地區(qū)的暴發(fā)流行,并根據(jù)病原菌的形態(tài)特征、培養(yǎng)性狀、生理生化及16S rDNA序列分析,以及最新的分類系統(tǒng)將其鑒定為D.dadantii[8]。目前該病已在我國的福建、廣東、江西、廣西、海南、河南、重慶、江蘇等地發(fā)現(xiàn),且已經(jīng)成為南方薯區(qū)發(fā)病面積最大、危害最重的病害之一[9-10]。

2013年我們在甘薯病害調(diào)查中,于河北文安縣發(fā)現(xiàn)一種與甘薯莖腐病相似的病害,主要癥狀表現(xiàn)為甘薯莖基部腐爛變褐,地下薯塊呈水浸狀腐爛,掰開后呈“烤紅薯”狀,田間發(fā)病率在5%左右(n=50×3),受害植株基本無產(chǎn)量。本文主要對疑似病株的病原菌進(jìn)行了分離、鑒定和回接驗證,以確定病害種類,并為北方薯區(qū)甘薯病害的識別及防治提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 病原菌分離

2013年10月從河北文安縣采集‘龍薯9號’發(fā)病的薯塊,切取病健交界處組織,搗碎后用接菌環(huán)蘸取菌液畫線接種于LB平板上,30 ℃培養(yǎng)24 h,單菌落純化3次后,于LB液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng),獲得菌液于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 柯赫氏法則回接鑒定

1.2.1 接種莖蔓

將獲得的菌株于LB固體培養(yǎng)基上畫線,30 ℃培養(yǎng)24 h后挑取單菌落,于30 ℃,180 r/min搖菌培養(yǎng),直至A值達(dá)0.6～1.0。將帶有3～4片葉子的甘薯‘龍薯9號’莖蔓切口浸蘸菌液20 min后栽種到盛有滅菌土的花盆中,以蘸滅菌水的莖蔓為空白對照,置于光照培養(yǎng)箱中,30 ℃,L∥D=16 h∥8 h,每天適量澆水保持土壤濕度,并觀察發(fā)病情況。取發(fā)病植株按照1.1中方法分離病菌。

1.2.2 接種薯塊

剪取0.5 cm×0.5 cm的濾紙片蘸取菌液后貼附于薯塊的針刺微創(chuàng)口處,以蘸滅菌水的濾紙片為對照,每菌株3個重復(fù)。接種后的薯塊置于濕潤的沙土中,30 ℃保濕培養(yǎng),每隔24 h觀察1次發(fā)病情況。取發(fā)病組織按照1.1中的方法再次分離病菌。

1.3 病原菌形態(tài)觀察

將分離的菌株接種到LB平板上,30 ℃培養(yǎng)24 h后,挑取少量菌體進(jìn)行革蘭氏染色,顯微鏡下對菌體進(jìn)行觀察,記錄其形態(tài)、大小,顏色反應(yīng)等。

1.4 病原菌分子鑒定

1.4.1 病原菌16S rDNA的擴(kuò)增

利用微波法快速制備細(xì)菌的基因組DNA[11],根據(jù)Blackwood等[12]的報道合成細(xì)菌鑒定通用引物8F/1492R(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′/5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′),并以細(xì)菌基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為：2×EsTaqMasterMix(北京康為世紀(jì)公司)10 μL,正反向引物(10 μmol/L)各0.5 μL,DNA模板1 μL,加ddH2O至20 μL。反應(yīng)程序為：94 ℃,3 min;94 ℃ 30 s,55 ℃ 30 s,72 ℃ 2 min,共30個循環(huán);72 ℃延伸10 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳,EB染色,用凝膠成像系統(tǒng)觀察、拍照,用瓊脂糖凝膠回收試劑盒(北京康為世紀(jì)公司)回收目的條帶。

1.4.2 16S rDNA的克隆、測序以及比對分析

將回收純化后的PCR產(chǎn)物與pMD18-T載體4 ℃過夜連接,連接產(chǎn)物用熱激法轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α,并于含氨芐青霉素(50 mg/L)的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)12～14 h篩選陽性克隆。挑取單菌落用4 mL含氨芐青霉素(50 mg/L)的LB液體培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng),將獲得的菌液利用質(zhì)粒小提試劑盒(北京康為世紀(jì)公司)提取質(zhì)粒后進(jìn)行PCR驗證。最后將經(jīng)PCR驗證的陽性克隆(至少3個)送至上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測序。利用DNAstar軟件包的SeqMan進(jìn)行序列拼接比對。所得序列提交NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST比對分析。采用MEGA 5.2軟件包中的Neighbor-Joining(NJ)聚類分析法對所測定的序列進(jìn)行聚類分析。

2 結(jié)果和分析

2.1 癥狀觀察

病害發(fā)生地點為河北省文安縣大柳河鎮(zhèn)北張村,甘薯品種為‘龍薯9號’。收獲時,發(fā)現(xiàn)有些植株薯蔓與薯塊相連處變褐腐爛,嚴(yán)重的整塊薯腐爛,有酸腐的味道,薯塊表皮沒有明顯的病斑,地上部的薯秧、葉片正常,沒有表現(xiàn)癥狀,發(fā)病率在5%左右(n=50×3)。

從采集的病薯上共分離得到了3株細(xì)菌菌株,將它們分別進(jìn)行回接。在薯塊上,只有接種WA1301菌株的薯塊在接種2 d后發(fā)病,癥狀表現(xiàn)為接種點周圍外表皮完好,內(nèi)部變褐并軟化腐爛,7 d后薯塊有80%以上腐爛,外表皮仍然保持完好,薯塊掰開后內(nèi)部呈現(xiàn)水浸狀腐爛,形如“烤紅薯”(圖1b、c)。在甘薯莖蔓上,同樣是只有接種WA1301的莖蔓發(fā)病,其發(fā)病速度比薯塊慢,在10 d后才開始出現(xiàn)明顯癥狀,主要表現(xiàn)出生長緩慢,葉片黃化萎蔫,莖基部有褐色腐爛斑,撥開土壤發(fā)現(xiàn)土層以下部分已經(jīng)褐化腐爛(圖1a)。以上薯塊和莖蔓上的發(fā)病癥狀均與田間癥狀一致,另外從發(fā)病的莖蔓和薯塊中均又重新分離到了相似的菌株,說明WA1301為其病原菌。切開發(fā)病薯塊觀察發(fā)現(xiàn),其發(fā)病部位主要是沿著薯塊的中心向兩頭不斷發(fā)展,且韌皮部早期并未發(fā)現(xiàn)有褐化的現(xiàn)象。

圖1 回接菌株WA1301的甘薯秧苗及薯塊的發(fā)病癥狀 Fig.1 Symptoms of the sweet potato stem and storage root inoculated with strain WA1301

2.2 病原菌形態(tài)

WA1301菌體短桿狀,大小為(0.5～0.8)μm×(1. 0～2. 7)μm,革蘭氏染色陰性,在LB培養(yǎng)基上30 ℃培養(yǎng)24 h后,菌落呈淺黃色,邊緣整齊。

2.3 病原菌分子鑒定

對WA1301菌株進(jìn)行16S rDNA擴(kuò)增，獲得了一條約1 500 bp的條帶,切膠回收該條帶并進(jìn)行克隆后測序,最終獲得的序列為1 503 bp(登錄號：KJ541470)。將獲得的序列提交GenBank數(shù)據(jù)庫進(jìn)

行BLAST比對分析,結(jié)果顯示該菌株的16S rDNA與D.dadantii模式菌株3973(登錄號：CP002038)以及Huang等[8]報道的E.chrysanthemi菌株H12(GU252371)和09-1(HM222417)的相似性均達(dá)99%。將WA1301菌株與其他狄克氏菌屬菌株一起構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2),結(jié)果顯示W(wǎng)A1301菌株與D.dadantii聚為一簇。綜合回接病株癥狀以及分子鑒定結(jié)果,證明在河北文安甘薯田發(fā)現(xiàn)的細(xì)菌性腐爛病為甘薯莖腐病。

圖2 利用鄰接法基于16S rDNA序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Neighbor-Joining tree calculated from the 16S rDNA sequences

3 討論

本研究從甘薯發(fā)病組織中分離獲得了3種菌落形態(tài)的菌株,經(jīng)回接后確定WA1301為致病菌,通過分子生物學(xué)方法對其16S rDNA進(jìn)行測定和分析,并結(jié)合其致病癥狀表現(xiàn)最終確定其為達(dá)旦提狄克氏菌(D.dadantii),該病菌在甘薯上危害造成甘薯莖腐病發(fā)生,這是我國首次在河北省發(fā)現(xiàn)甘薯莖腐病。

方樹民[7]和Huang等[8]先后在我國福建和廣東地區(qū)發(fā)現(xiàn)并報道了甘薯莖腐病的發(fā)生,本研究中發(fā)病的甘薯苗以及薯塊的癥狀表現(xiàn)均與其描述一致。甘薯瘟病(Ralstoniasolanacearum)是甘薯生產(chǎn)上的另一種重要病害,甘薯莖腐病與薯瘟病同屬細(xì)菌性病害,但兩者在癥狀上具有一定區(qū)別,薯瘟病危害初期在甘薯的莖蔓或薯塊不顯癥狀,而剖開后可見其維管束變黃或變褐,并呈現(xiàn)條紋狀,病株于晴天中午萎蔫呈青枯狀[13],而根據(jù)我們的觀察莖腐病并沒有這些癥狀。

D.dadantii可以侵染多種觀賞性園藝植物和農(nóng)作物[14],導(dǎo)致其發(fā)生軟腐病,嚴(yán)重威脅著我國多種作物的生產(chǎn)。由該菌引起的甘薯莖腐病于1990年在我國福建首次暴發(fā)并被報道以來[7],目前已遍布我國的南方薯區(qū)以及河南和江蘇等地的部分甘薯種植區(qū)[9-10],但還未見有在華北地區(qū)發(fā)生的報道。該病今年在我國北方薯區(qū)形成危害可能有以下幾方面原因[3, 15]：1)D.dadantii的寄主廣泛,且致病性強(qiáng),不排除從其他作物上傳播而來的可能性;2)帶菌種苗或種薯在市場上的流通,很可能使得甘薯在育苗期即形成了初侵染;3)病原菌通過田間的農(nóng)事操作進(jìn)一步擴(kuò)大了發(fā)病面積;4)與當(dāng)?shù)氐臍夂驐l件有關(guān),病原菌侵染的最適溫度在30 ℃左右[3],但是可以在低于27 ℃的很大范圍內(nèi)存活。河北2013年夏季雨量偏多,文安縣發(fā)病的甘薯田地勢低洼,形成了高溫高濕的環(huán)境,有利于病原菌的侵染和繁殖,從而導(dǎo)致該病的暴發(fā)。綜上所述,甘薯莖腐病的發(fā)生應(yīng)該引起北方甘薯種植區(qū)的足夠重視,從選育抗病品種、培育無病壯苗、田間排水排澇、硫酸鏈霉素浸秧噴霧等入手[15],做好綜合防治工作。

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(責(zé)任編輯：楊明麗)

A preliminary study on bacterial stem and root rot disease of sweet potato in Hebei Province

Gao Bo, Wang Rongyan, Ma Juan, Li Xiuhua, Chen Shulong

(Plant Protection Institute of Hebei Academy of Agricultural and Forestry Sciences; IPM Centre of Hebei Province; Key Laboratory of IPM on Crops in Northern Region of North China, Ministry of Agriculture, Baoding 071000, China)

The bacterial stem and root rot disease of sweet potato was a novel bacterial disease reported in China, which has occurred in the provinces of Fujian, Guangdong, Jiangxi, Guangxi, Hainan, Henan, Chongqing, Jiangsu and so on in recent years. In the survey of sweet potato diseases in Hebei Province in October 2013, a lot of sweet potato plants with similar symptoms of bacterial stem and root rot disease were found in the County Wen’an, which caused a serious loss to the local sweet potato production. In this study, bacterial strains were isolated and purified from the diseased tuberous roots. The pathogen of the disease was verified based on the Koch’s postulates and finally identified asDickeyadadantiiby morphological observation and the 16S rDNA sequence analysis. This is the first report on this disease in Hebei Province.

bacterial stem and root rot disease of sweet potato; bacterial disease;Dickeyadadantii

2014-03-18

2014-05-09

國家甘薯產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系(CARS-11-B-08)

S 432.42

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2015.03.023

* 通信作者 E-mail:chenshulong@gmail.com