劉建密, 紀翠紅, 陳細紅, 林積秀, 黃培枝,嚴叔平, 陳文樂, 陳彩霞, 張宇翔, 牟海青

(1. 福建三明市植保植檢站, 三明 365000; 2. 福建永安市植保植檢站, 永安 366000;3. 福建廈門出入境檢驗檢疫局, 廈門 361012; 4. 中國檢驗檢疫科學研究院, 北京 100029)

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福建永安市辣椒叢枝病植原體的分子檢測及鑒定

劉建密1, 紀翠紅2, 陳細紅3, 林積秀2, 黃培枝2,嚴叔平1, 陳文樂1, 陳彩霞1, 張宇翔2, 牟海青4*

(1. 福建三明市植保植檢站, 三明 365000; 2. 福建永安市植保植檢站, 永安 366000;3. 福建廈門出入境檢驗檢疫局, 廈門 361012; 4. 中國檢驗檢疫科學研究院, 北京 100029)

永安地區(qū)發(fā)病辣椒植株表現(xiàn)小葉、黃化、叢枝、簇芽等癥狀。利用植原體16S rDNA基因的通用引物R16 mF2/R16 mR2和R16F2n/R16R2,對發(fā)病辣椒植株總DNA進行巢式PCR檢測,獲得約1.2 kb的特異性DNA片段。經(jīng)測序并在GenBank數(shù)據(jù)庫進行比對分析,共獲得4條植原體特定的16S rDNA基因序列(CHY-C4-1、CHY-Y1-1、CHY-Y7-1、CHY-G1-1)。將測得的4條序列與已報道的植原體序列進行同源性比對,并構建系統(tǒng)進化樹,結果顯示獲得的4條植原體序列均聚類到16SrI組,其中CHY-Y1-1、CHY-Y7-1、CHY-G1-1與16SrI-B亞組植原體聚類到同一支,而CHY-C4-1與已報道的16SrI組內(nèi)的6個亞組均未聚類到一支,因此建議將CHY-C4-1命名為新的亞組。利用iPhyClassifier 在線分析軟件對獲得的4條植原體序列進行虛擬RFLP分析,結果與進化樹獲得的結果一致。

辣椒; 植原體; 16S rDNA; 巢式-PCR; 系統(tǒng)進化分析

植原體(phytoplasma)(原稱類菌原體mycoplasma-like organism, MLO)為單細胞原核生物,無細胞壁,由生物膜包圍,定殖于植物韌皮部篩管細胞[1],主要靠吸食植物韌皮部汁液的昆蟲介體傳播,如葉蟬、茶翅蝽、飛虱、蚜蟲等[2]。自20世紀60年代以來,全世界范圍內(nèi)的1 000余種植物病害均被發(fā)現(xiàn)與植原體的侵染有關,其引起的癥狀主要包括叢枝、黃化、小葉、花變?nèi)~、花器退化等,嚴重時引起植株提早衰老,直至整個植株枯死[3]。我國也報道了100余種與之相關的植物病害[4]。

由于植原體無法人工培養(yǎng)[5],不能像其他原核生物一樣進行系統(tǒng)的分類鑒定,單依靠發(fā)病植物癥狀、寄主或傳播媒介往往不能精確地分類,比如同一植原體在不同寄主上的癥狀表現(xiàn)可能不同,不同植原體可能由同一介體昆蟲傳播,或引起的病害在癥狀表現(xiàn)上相同[6-9]。最初,植原體檢測主要依靠電子顯微鏡以及借助于組織化學的方法。近年來,隨著分子生物學技術的發(fā)展,核酸雜交和PCR等技術的廣泛應用大大促進了植原體的分類鑒定[10]。特別是植原體16S rDNA PCR產(chǎn)物的RFLP分析,可以作為區(qū)分和鑒定植原體的一種簡便、可靠、實用的方法,有助于揭示植原體之間的同源性和系統(tǒng)發(fā)育關系及遺傳相關性[4]。值得一提的是,隨著DNA測序技術和生物信息學技術的發(fā)展,2008年,Wei等利用計算機程序分析植原體16S rDNA的RFLP圖譜,將所有的植原體劃分為28個16Sr組和100個亞組[11-12]。根據(jù)NCBI分類數(shù)據(jù)庫(Taxonomy)統(tǒng)計結果,目前已報道的16Sr植原體組增加到32個。

辣椒(CapsicumannuumL.)廣泛分布于世界各地,是重要的蔬菜之一,在我國各地普遍栽培。辣椒上的植原體病害在亞洲、美洲和歐洲均有報道,并造成嚴重危害[13-16]。目前,國內(nèi)有關辣椒植原體病害的報道較少,對其尚缺乏了解,加上植原體病害的癥狀與病毒病的癥狀相似往往被誤認為是病毒病,因此單從癥狀上難以準確診斷,這為病害的防治帶來困難。筆者對永安市辣椒田進行調(diào)查,采集的50株樣本中發(fā)現(xiàn)有30株含有植原體,發(fā)病率達5%～30%[17],嚴重威脅著辣椒種植業(yè)?；诖?本文對永安辣椒發(fā)病株進行植原體16S rDNA 巢式PCR擴增和序列測定,獲取其分子生物學信息,確定其分類地位和系統(tǒng)發(fā)育關系,為辣椒植原體病害的早期診斷,準確和快速檢測,以及防控措施的制定提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

2013年07月11日和2013年07月12日在永安辣椒田采集表現(xiàn)為小葉、叢枝、黃化等癥狀的辣椒植原體病害疑似株及健康株樣品,保存于4 ℃冰箱中。試驗所需引物由Invitrogen生物公司合成,其他試劑均購自天根生化科技(北京)有限公司。

1.2 辣椒葉片總DNA提取

采用植物基因組提取試劑盒提取辣椒葉片總DNA,置于-20 ℃冰箱中保存,備用。

1.3 16S rDNA的PCR擴增

1.3.1 引物

采用植原體16S rDNA的通用引物對[18-19]。

R16 mF2/R16 mR2為外側引物對,R16 mF2：5′-CATGCAAGTCGAACGGA-3′,R16 mR2：5′-CTTAACCCCAATCATCGAC-3′。

R16F2n/R16R2為內(nèi)側引物對, R16F2n：5′-GAAACGACTGCTAAGACTGG-3′,R16R2：5′-TGACGGGCGGTGTGTACAAACCCCG-3′。

1.3.2 直接PCR(Direct-PCR)擴增

以供試樣品總DNA為模板,R16 mF2/R16 mR2為擴增引物。反應體系(25 μL)：DNA 模板1.0 μL,引物(10 μmol/L)各1.0 μL,dNTPs(10 mmol/L)1.0 μL,10×PCR buffer(MgCl2,2.5 mmol/L)2.5 μL,TaqDNA聚合酶(2.5 U/μL)0.5 μL,ddH2O 18 μL。反應條件：94 ℃預變性5 min;94 ℃變性50 s,55 ℃復性50 s,72 ℃延伸2 min,35個循環(huán);72 ℃延伸7 min。

1.3.3 巢式PCR(Nested-PCR)擴增

把1.3.2中擴增的產(chǎn)物作模板,以R16F2n/R16R2為引物進行巢式PCR擴增,PCR反應體系及條件同1.3.2。

1.3.4 PCR產(chǎn)物電泳分析

取5 μL PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳,EB染色,使用凝膠成像系統(tǒng)觀察并攝影記錄。

1.4 核苷酸序列測定與分析

將含有目的片段的Nested-PCR產(chǎn)物進行序列測定,由Invitrogen生物公司完成。將測得的16Sr DNA基因序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中進行BLAST分析,利用MEGA5與已報道的序列進行同源性比對,構建系統(tǒng)進化樹。

1.5 植原體16S rDNA序列iPhyClassifier在線分析

利用植原體分類鑒定在線工具iPhyClassifier(http：∥plantpathology.ba.ars.usda.gov∕cgi-bin∕resource∕iphyclassifier.cgi)將測得16S rDNA序列(R16F2n/R16R2)進行虛擬酶切,并進行基于相似系數(shù)分析的16Sr組/亞組的確定(16Sr group/subgroup classification based on similarity coefficient)。

2 結果與分析

2.1 感病植株癥狀表現(xiàn)

如圖1所示,辣椒植原體病害的癥狀表現(xiàn)為小葉,黃化,叢枝。早期發(fā)病的植株矮小,小葉,葉色發(fā)黃,不結果或結果很少;中后期發(fā)病的植株矮化或矮化不明顯,中下部葉片正常,中上部葉片狹窄皺縮,葉柄變長,發(fā)病嚴重的植株黃化,葉片提早掉落,偶見有黃化斑駁癥狀。

圖1 辣椒植原體病害外觀特征Fig.1 Symptoms of pepper plants infected with phytoplasmas

2.2 PCR 檢測

在永安市辣椒種植田取感病植株7株，分別以感病以及健康辣椒植株總DNA為模板,經(jīng)R16 mF2/R16 mR2以及R16F2n/R16R2引物進行巢式PCR擴增,其中從4株發(fā)病樣品中獲得較亮的DNA片段,約1.2 kb,而健康植株和雙蒸水對照均未擴增出特異條帶。因此,推測發(fā)病辣椒植株中含有植原體病原,將該植原體暫定為辣椒叢枝植原體(pepper witches’-broom phytoplasma),該病害命名為辣椒叢枝病。

2.3 16S rDNA序列獲得以及虛擬RFLP分析

將巢式PCR擴增產(chǎn)物進行克隆測序,共獲得4條植原體序列,分別命名為CHY-C4-1(GenBank accession: KJ140783)、CHY-Y1-1(GenBank accession: KJ140784)、CHY-Y7-1(GenBank accession: KJ140785)、CHY-G1-1(GenBank accession: KJ140786)。通過在線分析軟件iPhyClassifier,將獲得的4條植原體序列進行虛擬RFLP分析,結果顯示CHY-Y1-1、CHY-Y7-1、CHY-G1-1與16SrI-B亞組植原體(GenBank accession: NC_005303)相似度分別是0.98、1、0.98,因此應該歸屬于16SrI-B亞組;而CHY-C4-1序列與16SrI-B亞組植原體(GenBank accession: NC_005303)相似度最低,為0.97,根據(jù)Wei等[11]對植原體亞組劃分的規(guī)定,建議將CHY-C4-1植原體命名為新的亞組。

2.4 16S rDNA序列系統(tǒng)進化樹構建及分析

將本研究獲得的4條植原體DNA序列與GenBank中已登錄的25條不同組的植原體16S rDNA 序列進行分析并構建進化樹(圖2)，結果表明，從發(fā)病辣椒中獲得的4條植原體16S rDNA 序列均屬于植原體16SrI組,其中CHY-Y1-1、CHY-Y7-1、CHY-G1-1與16SrI-B亞組植原體洋蔥黃化植原體OY-M(NC_005303)以及翠菊黃化植原體(HQ646367)聚類到同一支,而CHY-C4-1與已報道的16SrI組內(nèi)的6個亞組均未聚類到一支,形成一個獨立的分支。因此,根據(jù)構建進化樹分析獲得的結果與虛擬RFLP分析獲得的結果一致。

3 討論

迄今,國內(nèi)關于辣椒植原體病害的記載很少,只有仵光俊等運用傳統(tǒng)方法研究發(fā)現(xiàn)辣椒叢枝小葉病的病原為植原體[20]。經(jīng)比較,永安辣椒叢枝病與辣椒叢枝小葉病的癥狀相似,均有叢枝(簇芽)小葉的癥狀,病害均由植原體造成。本研究運用分子檢測鑒定的方法,對永安地區(qū)辣椒叢枝病病原進行了檢測鑒定。表明,該地區(qū)發(fā)病辣椒植株中含有16SrI組植原體,且其中3個株系屬于16SrI組的B亞組,一個株系應該歸屬16SrI組中的新亞組。

不同國家引起辣椒植原體病害的發(fā)病癥狀以及病原種類不同。西班牙辣椒僵頂病是植原體16SrⅥ組,癥狀表現(xiàn)為節(jié)間縮短,花芽變綠變大,萼片發(fā)育不完全,果實少[16];印度尼西亞紅辣椒上是植原體16SrⅡ組,癥狀多表現(xiàn)為葉片斑駁,小葉聚生[13];玻利維亞甜椒上是植原體16SrⅢ組,發(fā)病植株葉片變小,節(jié)間縮短[14];古巴甜椒上是植原體16SrⅠ組,常引起葉片黃化,節(jié)間縮短[15]。通過分子檢測方法,本研究對永安市辣椒叢枝病害的病原進行了檢測與鑒定,共發(fā)現(xiàn)4個植原體株系,其中3個株系屬于16SrI組的B亞組,一個株系屬于16SrI組中新的亞組,為該病害的預防與控制奠定了基礎。此外,發(fā)病辣椒植株中是否存在植原體復合侵染的情況,或是與其他病原菌的復合侵染情況,均有待于進一步的研究進行論證。

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(責任編輯：楊明麗)

Molecular detection and identification of the phytoplasma associated with pepper witches’ broom in Yong’an

Liu Jianmi1, Ji Cuihong2, Chen Xihong3, Lin Jixiu2, Huang Peizhi2, Yan Shuping1, Chen Wenle1, Chen Caixia1, Zhang Yuxiang2, Mou Haiqing4

(1. Sanming Plant Protection and Quarantine Station, Fujian 365000, China; 2. Yongan Plant Protection and Quarantine Station, Fujian 366000, China; 3.Xiamen Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau,Fujian 361012, China; 4. Chinese Academy of Inspection and Quarantine, Beijing 100029, China)

Symptoms of little leaf, leaf yellowing, witches’ broom and bunching of small leaves were observed in pepper fields in Yong’an City. By use of nested-PCR, the 16S rRNA gene of phytoplasma associated with infected pepper was amplified with universal primer pairs R16 mF2/R16 mR2 and R16F2n/R16R2. The specific DNA fragments of ca. 1.2 kb were obtained from the total DNA of diseased samples. After nucleotide sequencing and BLAST analysis in GenBank, four sequences of phytoplasma 16S rRNA gene (CHY-C4-1, CHY-Y1-1, CHY-Y7-1 and CHY-G1-1) were obtained. The similarity and phylogenetic analysis showed that the four sequences were closely related to 16SrI group of phytoplasma. In the phylogenetic trees constructed with 16S rDNA, CHY-Y1-1, CHY-Y7-1 and CHY-G1-1 were clustered together with subgroup B of aster yellows group (16SrI-B), and it was suggested that CHY-C4-1 should belong to a new subgroup because CHY-C4-1 was not clustered together with any other subgroups of 16SrI. The results of four 16S rDNA sequences were analyzed by virtual RFLP online usingiPhyClassifier software, and the result was correspondent with phylogenetic tree.

pepper; phytoplasma; 16S rDNA; nested-PCR; phylogenetic analysis

2014-03-13

2014-04-17

S 436.3

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2015.03.022

* 通信作者 E-mail: mouhaiqing@163.com