李 帥, 朱 敏, 夏子豪, 王 廿, 周 濤,董家紅, 陳永對(duì), 張仲凱, 范在豐*

(1. 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病理學(xué)系, 北京 100193; 2. 云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)與種質(zhì)資源研究所, 昆明 650223)

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研究簡(jiǎn)報(bào)ResearchNotes

云南省玉溪市玉米致死性壞死病毒原的分子鑒定

李 帥1#, 朱 敏1#, 夏子豪1, 王 廿1, 周 濤1,董家紅2*, 陳永對(duì)2, 張仲凱2, 范在豐1*

(1. 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病理學(xué)系, 北京 100193; 2. 云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)與種質(zhì)資源研究所, 昆明 650223)

玉米致死性壞死病是由玉米褪綠斑駁病毒(Maizechloroticmottlevirus, MCMV)和一種或多種馬鈴薯Y病毒科病毒復(fù)合侵染引起的。2014年1月在對(duì)云南省玉溪市玉米病毒病害的調(diào)查中發(fā)現(xiàn)了一些表現(xiàn)嚴(yán)重花葉、矮化葉片甚至整個(gè)植株壞死癥狀的玉米。對(duì)采集樣品進(jìn)行RT-PCR檢測(cè),所有樣品中都同時(shí)檢測(cè)到了MCMV和甘蔗花葉病毒(Sugarcanemosaicvirus, SCMV),在一個(gè)樣品中同時(shí)檢測(cè)到了MCMV、SCMV和南方水稻黑條矮縮病毒(Southern rice black-streaked dwarf virus)。

玉米致死性壞死病; 玉米; RT-PCR

玉米致死性壞死病(corn lethal necrosis, CLN或maize lethal necrosis disease, MLND)最早于1973年發(fā)現(xiàn)于秘魯[1],隨后在美國(guó)的堪薩斯州和內(nèi)布拉斯加州也發(fā)現(xiàn)了該病害[2]。該病害是由玉米褪綠斑駁病毒(Maizechloroticmottlevirus, MCMV)和馬鈴薯Y病毒科(Potyviridae)中侵染禾本科植物的病毒[例如小麥線條花葉病毒(Wheatstreakmosaicvirus, WSMV)、玉米矮花葉病毒(Maizedwarfmosaicvirus, MDMV)、甘蔗花葉病毒(Sugarcanemosaicvirus, SCMV)]復(fù)合侵染后發(fā)生協(xié)生作用而導(dǎo)致的,其癥狀表現(xiàn)為褪綠斑駁、花葉,葉片壞死,甚至整個(gè)植株壞死。玉米產(chǎn)量損失嚴(yán)重時(shí)高達(dá)90%[1-4]。周雪平課題組于2011年首次報(bào)道了MCMV和玉米致死性壞死病在我國(guó)云南省的發(fā)生[5]。

MCMV主要分布在阿根廷、墨西哥、秘魯和美國(guó)等國(guó)家,近年已擴(kuò)展到亞洲和非洲的部分玉米種植區(qū)[6-8]。在臨近云南省北部的四川省攀枝花地區(qū)的玉米標(biāo)樣中也檢測(cè)出了MCMV[9]。該病毒的寄主限于禾本科植物(包括玉米、小麥、大麥、燕麥、高粱等),可以通過機(jī)械摩擦[1-4]和種子[7]傳播。MCMV的夏威夷分離株可由玉米花薊馬(威廉斯花薊馬Frankliniellawilliamsi)傳播[8],從泰國(guó)進(jìn)境的分離株可由西花薊馬(F.occidentalis)傳播[10]。用MCMV-Kansas株系作毒原研究發(fā)現(xiàn)葉甲科的谷物葉甲(Oulemamelanopa)、玉米跳甲(Chaetocnemapulicaria)、紅頭跳甲(Systenafrontalis)、南部玉米食根葉甲(Diabroticaundecimpunctata)、北部玉米食根葉甲(D.longicornis)和西部玉米食根葉甲(D.virgifera)等6種昆蟲是MCMV的傳播介體,以非持久性方式傳毒[11]。受該病毒侵染的玉米在侵染初期主要表現(xiàn)出輕度的褪綠斑駁,逐步發(fā)展為黃色條紋,甚至還引起雌花的畸形和植株的矮化等。MCMV屬于番茄叢矮病毒科(Tombusviridae),玉米褪綠斑駁病毒屬(Machlomovirus),病毒粒子為球狀,直徑約為30 nm;其基因組為正義單鏈RNA分子,全長(zhǎng)為4 436～4 437 nt[12-13],包含7個(gè)開放讀框[13]。

SCMV是引起我國(guó)玉米矮花葉病的主要病原,其自然寄主限于禾本科植物。植株受侵染后主要表現(xiàn)為葉片不均勻褪綠而形成花葉、條紋等,重病株表現(xiàn)不同程度的矮化,不能抽穗,千粒重下降等。SCMV是馬鈴薯Y病毒屬(Potyvirus)的成員,基因組為正義單鏈RNA分子,全長(zhǎng)約為 9.6 kb[14]。SCMV基因組RNA編碼一個(gè)大的多聚蛋白和一個(gè)移碼蛋白,經(jīng)病毒自身編碼的蛋白酶切割后形成11個(gè)成熟的蛋白質(zhì)[14-15]。

南方水稻黑條矮縮病毒(Southern rice black-streaked dwarf virus, SRBSDV)是在我國(guó)首先發(fā)現(xiàn)的一種導(dǎo)致水稻黑條矮縮病的病毒[16-17]。該病毒屬于呼腸孤病毒科(Reoviridae),斐濟(jì)病毒屬(Fijivirus)[16-17],由白背飛虱以持久性方式傳播[17-18]。SRBSDV的基因組由10條雙鏈RNA組成[16]。

2014年1月,作者在對(duì)云南省玉溪市玉米病毒病害的調(diào)查中發(fā)現(xiàn)了一些表現(xiàn)嚴(yán)重花葉、矮化、葉片甚至整株壞死以及粗縮癥狀的玉米,嚴(yán)重地塊發(fā)病率達(dá)50%以上。采集了8個(gè)癥狀明顯的樣品提取葉片總RNA,使用MCMV,SCMV和SRBSDV的特異性引物進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)、序列測(cè)定和比對(duì)分析后,發(fā)現(xiàn)上述8個(gè)樣品中均含有MCMV和SCMV,其中1個(gè)表現(xiàn)粗縮癥狀的樣品受到MCMV、SCMV和SRBSDV 3種病毒的復(fù)合侵染。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

2014年1月在云南省玉溪市元江縣采集表現(xiàn)嚴(yán)重花葉、矮化，葉片甚至整個(gè)植株壞死癥狀(圖1)的玉米植株8份,經(jīng)整理后一部分用于病毒的檢測(cè),其余樣品于-40 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

圖1 玉米致死性壞死病的田間癥狀Fig.1 The symptom of maize lethal necrosis disease in the field

1.2 葉片總RNA的提取

利用TRIzol法提取玉米葉片總RNA。取約0.1 g的葉片用液氮研磨成粉末狀,迅速移入1.5 mL離心管中后立即加入1 mL TRIzol,劇烈振蕩混勻,室溫靜置5 min后加入200 μL氯仿,劇烈振蕩20 s再于室溫靜置3 min后于4 ℃,12 000g離心15 min,取上層水相(約500～550 μL)轉(zhuǎn)移到新的1.5 mL離心管中,加入等體積的異丙醇,混勻后于室溫靜置10 min,然后于4 ℃,12 000g離心10 min后用75%乙醇洗滌沉淀2次。最后用DEPC處理的ddH2O溶解沉淀。

1.3 反轉(zhuǎn)錄PCR、序列克隆和測(cè)定

以2 μg總RNA為模板,加入0.5 μL Oligo(dT)引物(0.5 μg/μL)(Promega公司),0.5 μL隨機(jī)六聚體引物(Promega公司)(10 μmol/L),1 μL dNTPs(10 mmol/L),4 μL 5×RT緩沖液,0.5 μL核酸酶抑制劑(ribonuclease inhibitor),1 μL M-MLV(Promega公司),最后加入DEPC處理的ddH2O將反應(yīng)體系補(bǔ)齊至20 μL,充分混勻后于37 ℃反應(yīng)60 min。

以反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板,分別用檢測(cè)SCMV,MCMV和SRBSDV的特異性引物進(jìn)行PCR。各檢測(cè)引物的序列、退火溫度、目的片段長(zhǎng)度及參考文獻(xiàn)見表1。50 μL PCR反應(yīng)體系如下：2 μL cDNA,5 μL 10×Taq緩沖液,1 μL dNTPs(10 mmol/L),上下游檢測(cè)引物(10 μmol/L)各2 μL,0.4 μL GoldenTaqDNA 聚合酶,37.6 μL ddH2O。PCR反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性5 min;按以下條件進(jìn)行30個(gè)循環(huán)：94 ℃變性30 s,50或58 ℃(視引物的Tm值而定)退火30 s,72 ℃延伸(延伸時(shí)間視目標(biāo)片段大小而定);最后72 ℃延伸10 min。所有PCR產(chǎn)物經(jīng)1% 瓊脂糖凝膠電泳分析后,切取目標(biāo)條帶,經(jīng)天根公司的瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收純化后克隆到pMD18-T載體(TaKaRa,大連)。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α菌株,取陽(yáng)性克隆測(cè)序獲得序列。

表1 檢測(cè)使用引物信息1)

1) Y=C/T;N=A/G/C/T;R=A/G;V=A/G/C

1.4 序列比對(duì)和分析

利用NCBI網(wǎng)站(http:∥blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)上的BLAST程序?qū)寺〉玫降男蛄羞M(jìn)行比對(duì)分析,根據(jù)核苷酸序列的相似性確定病毒的種類。采用Clustal W(http:∥www.genome.jp/tools/clustalw/)進(jìn)行相關(guān)核苷酸序列的初步比對(duì)運(yùn)算,再用MEGA 6.06軟件構(gòu)建進(jìn)化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品的RT-PCR檢測(cè)

以cDNA為模板,分別用SCMV、MCMV和SRBSDV的特異性引物進(jìn)行PCR檢測(cè)。從采集的8個(gè)樣品中均擴(kuò)增得到了約710 bp和約1 800 bp的條帶(圖2a,b),從5號(hào)樣品中擴(kuò)增得到了約569 bp的條帶(圖2c)。結(jié)果表明8個(gè)樣品均被MCMV和SCMV侵染;5號(hào)樣品受到MCMV、SCMV和SRBSDV 3種病毒的復(fù)合侵染。

2.2 序列分析

將PCR獲得的目標(biāo)片段純化,克隆到pMD18-T載體并進(jìn)行序列測(cè)定。用BLAST程序進(jìn)行序列相似性比對(duì)分析的結(jié)果表明：從云南玉溪市采集的8個(gè)玉米樣品中分離得到的710 bp片段的序列完全相同(MCMV-Yuanjiang 2,GenBank登錄號(hào)：KJ873134.1)與MCMV四川分離物(MCMV-Sichuan,GenBank登錄號(hào)：JQ982470.1)的序列一致率最高,為99%;從這8個(gè)樣品中擴(kuò)增得到的約1 800 bp片段的序列與SCMV廣東分離物(SCMV-GD,GenBank登錄號(hào)：AJ310105.1)的序列一致率最高,均為98%;而從5號(hào)樣品中擴(kuò)增得到的569 bp片段的序列與SRBSDV云南分離物(SRBSDV-YN,GenBank登錄號(hào)：JQ773428.1)的序列一致率最高,為100%。表明,在云南省玉溪市采集的8個(gè)玉米樣品均受到MCMV和SCMV的復(fù)合侵染,其中5號(hào)樣品受到MCMV、SCMV和SRBSDV這3種病毒的復(fù)合侵染。

圖2 利用反轉(zhuǎn)錄PCR檢測(cè)發(fā)病玉米樣品中SCMV,MCMV和SRBSDVFig.2 Detection of SCMV, MCMV and SRBSDV in diseased maize samples through RT-PCR

3 討論

玉米致死性壞死病是一種毀滅性的病毒病害,近年來在東南亞及非洲東部的部分國(guó)家和地區(qū)大面積發(fā)生[6, 21],造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失,威脅了當(dāng)?shù)氐募Z食安全。MCMV是玉米致死性壞死病的主要病原,也是我國(guó)進(jìn)境檢疫性病毒,目前僅在我國(guó)的云南和四川兩省有發(fā)生[5, 9]。其在云南主要發(fā)生在冬春玉米上,嚴(yán)重時(shí)連片發(fā)生幾千畝。該病毒可由葉甲或薊馬傳播,也可經(jīng)種子傳播[7-8,10-11]。我國(guó)植物檢疫部門多次從國(guó)外進(jìn)境的玉米種子中檢測(cè)到MCMV[19, 21-22]。MCMV與馬鈴薯Y病毒科的一種或多種病毒的復(fù)合侵染，例如MCMV與SCMV復(fù)合侵染可導(dǎo)致玉米致死性壞死病的發(fā)生。我們的檢測(cè)結(jié)果顯示,從云南省玉溪市采集的玉米樣品中擴(kuò)增得到的MCMV的片段序列與MCMV-Sichuan的序列一致率高達(dá)99%,將我國(guó)和部分美國(guó)的MCMV外殼蛋白基因繪制成系統(tǒng)發(fā)生進(jìn)化樹(圖3),進(jìn)化樹顯示我國(guó)的MCMV聚為一類且與美國(guó)的MCMV相似。從這批樣品中擴(kuò)增得到的SCMV的片段序列與SCMV-GD的序列一致率高達(dá)98%。這表明這兩種病毒可能是通過種子攜帶在華南和西南地區(qū)傳播的。近年冬春季,許多育種單位在云南進(jìn)行南繁育種,這可能是該類病害傳入云南的途徑之一。因此,加強(qiáng)對(duì)玉米種子調(diào)運(yùn)的管理以及嚴(yán)格執(zhí)行檢疫措施將有利于控制該病毒在國(guó)內(nèi)外的傳播和擴(kuò)散,對(duì)于預(yù)防和阻止玉米致死性壞死病的發(fā)生和蔓延具有重要作用[21-22]。此外,我國(guó)是全球主要的玉米消費(fèi)國(guó),每年從國(guó)外進(jìn)口大量的玉米,加大對(duì)玉米種子的檢測(cè)力度也能在很大程度上防止各種檢疫性危險(xiǎn)病毒的入侵。

圖3 MCMV不同分離物外殼蛋白基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.3 Phylogenetic tree based on nucleotide sequences of the coat protein gene of different isolates of MCMV

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(責(zé)任編輯：楊明麗)

Molecular identification of the viruses causing maize lethal necrosis disease in Yuxi, Yunnan Province

Li Shuai1, Zhu Min1, Xia Zihao1, Wang Nian1, Zhou Tao1, Dong Jiahong2, Chen Yongdui2, Zhang Zhongkai2, Fan Zaifeng1

(1. Department of Plant Pathology, China Agricultural University, Beijing 100193, China; 2. Institute of Biotechnology and Germplasm Resources, Yunnan Academy of Agricultural Sciences, Kunming 650223, China)

Maize lethal necrosis disease is caused by synergistic interaction betweenMaizechloroticmottlevirus(MCMV) and one or several potyviruses. Severe mosaic, leaf necrosis (even plant lethal necrosis) or rough dwarf were found during a survey on virus diseases in maize carried out in Yuxi District, Yunnan Province in January 2014. RT-PCR, molecular cloning and sequence analysis were performed to identify the viruses present in the sampled plants. The results showed that all of the diseased samples tested were co-infected with MCMV andSugarcanemosaicvirus(SCMV) and one of the plants was co-infected with MCMV, SCMV and Southern rice black-streaked dwarf virus (SRBSDV).

corn lethal necrosis disease; maize; RT-PCR

2014-03-25

2014-06-10

國(guó)家科技重大專項(xiàng)(2013ZX08003-001); 云南省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2012CH007)

S 432.41

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2015.03.021

* 通信作者 E-mail:dongjhn@126.com;fanzf@cau.edu.cn

# 對(duì)文章有同等貢獻(xiàn)，為并列第一作者