靳 光，張元慶，張喜忠，王 曦，王棟材，李 博，薛艷蓉

（山西省農(nóng)科院畜牧獸醫(yī)研究所，太原 030000）

繁殖與生理

維生素D對牛卵巢卵泡顆粒細(xì)胞的影響

靳 光，張元慶，張喜忠，王 曦，王棟材，李 博，薛艷蓉

（山西省農(nóng)科院畜牧獸醫(yī)研究所，太原 030000）

試驗旨在探尋具有生物活性的維生素D（1α，25-（OH）2D3）對體外培養(yǎng)的牛卵巢卵泡顆粒細(xì)胞的活力、增殖及雌激素分泌的影響。在體外培養(yǎng)的牛卵巢卵泡顆粒細(xì)胞中加入不同梯度的1α，25-（OH）2D3（0，1，10，100 nM），用CCK-8檢測細(xì)胞活力，細(xì)胞計數(shù)檢測增殖，ELISA法檢測雌二醇濃度。結(jié)果表明：1、10、100 nM的1α，25-（OH）2D3均能提高卵泡顆粒細(xì)胞的活性，1α，25-（OH）2D3為100 nM時其刺激作用最強(qiáng)；10、100 nM的1α，25-（OH）2D3能刺激卵泡顆粒細(xì)胞增殖與雌二醇分泌，100 nM的1α，25-（OH）2D3刺激增殖作用最強(qiáng)，10 nM的1α，25-（OH）2D3刺激雌二醇分泌的能力最強(qiáng)。

維生素D；牛；卵泡顆粒細(xì)胞；細(xì)胞活力；增殖；雌二醇

維生素D是一種脂溶性維生素，其主要作用是升高血漿中鈣、磷的水平，以促進(jìn)骨的鈣化。維生素D可以通過食物攝取也可以在體內(nèi)合成。維生素D在體內(nèi)代謝產(chǎn)物有數(shù)十種，但在體內(nèi)最終的活性形式只有一種，那就是1α，25-二羥維生素D3（1α，25-（OH）2D3）［1-2］。

1α，25-（OH）2D3發(fā)揮其生物學(xué)作用需要靶細(xì)胞上維生素D受體（VDR）的介導(dǎo)。VDR是核受體家族成員之一，調(diào)控了人及小鼠約3%的基因表達(dá)［1，3］。隨著研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)VDR存在于雄性動物的睪丸、附睪、前列腺、精囊腺等重要器官［4-5］。另外，在人精子內(nèi)VDR存在于精子細(xì)胞核內(nèi)［6］。VDR在雄性動物生殖系統(tǒng)內(nèi)的表達(dá)，說明1α，25-（OH）2D3能夠在其中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。

維生素D對生殖的影響已有諸多研究。對于VDR基因敲除的小鼠其精液品質(zhì)下降，表現(xiàn)為精子數(shù)目與精子活率降低，精子形態(tài)異常［7］。對于未成熟大鼠的睪丸支持細(xì)胞，1α，25-（OH）2D3能夠提高芳香化酶（控制雌激素生成的關(guān)鍵酶）mRNA的表達(dá)量［8］。對于精子，1α，25-（OH）2D3能夠增加精子細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度，提高精子運(yùn)動能力和頂體酶活性，有利于精子獲能并延長精子體外生存時間［9-10］。

雖然維生素D對于雄性動物生殖的影響已有大量研究，但是對于雌性動物的研究較少，并且維生素D對母牛生殖方面的研究還未見報道。因此，本試驗以母牛為研究對象，探究維生素D對母牛卵巢卵泡顆粒細(xì)胞的細(xì)胞活力、增殖以及雌激素分泌水平的影響。

1　材料與方法

1.1樣品采集

選取健康的成年山西省晉南牛作為研究對象，在當(dāng)?shù)赝涝讏鰧游镌讱⒑蟛杉殉?。迅速用生理鹽水沖洗卵巢并放入4℃無菌PBS緩沖液內(nèi)，2 h內(nèi)帶回實(shí)驗室。

1.2主要試劑

DMEM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)基、青鏈霉素混合液、Cell Counting Kit-8（CCK-8）試劑盒購于武漢博士德生物公司；胎牛血清（FBS）購于杭州四季青公司；牛雌二醇ELISA試劑盒購于上海藍(lán)基生物公司；1α，25-（OH）2D3購于Selleck公司。

1.3牛卵巢卵泡顆粒細(xì)胞的收集

無菌條件下將卵泡從卵巢上剪下，然后剪開卵泡，用刮刀刮取卵泡壁內(nèi)層的卵泡顆粒細(xì)胞。用PBS將收集的卵泡顆粒細(xì)胞清洗3次，然后用臺盼藍(lán)鑒定活細(xì)胞。

1.4CCK-8測定細(xì)胞活性

將收集的卵泡顆粒細(xì)胞以每孔1×104個活細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板內(nèi)。培養(yǎng)液為DMEM/F12，其中含有10%FBS、100 IU/mL青霉素、0.1 mg/mL鏈霉素以及不同濃度梯度的1α，25-（OH）2D3（0、1、10、100 nM），每孔內(nèi)含培養(yǎng)液100 μL。每個1α，25-（OH）2D3濃度梯度設(shè)定5個復(fù)孔，試驗重復(fù)6次。卵泡顆粒細(xì)胞在37℃，5%CO2濃度條件下培養(yǎng)24 h。24 h以后每孔加入10 μLCCK-8溶液，繼續(xù)培養(yǎng)3 h。3 h后使用酶標(biāo)儀測定培養(yǎng)板內(nèi)各孔在450 nm下的吸光度值。

1.5雌二醇測定及細(xì)胞計數(shù)

將收集的卵巢卵泡顆粒細(xì)胞以每孔5×104個活細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板內(nèi)。培養(yǎng)液組成及1α，25-（OH）2D3濃度梯度同上，每孔內(nèi)含培養(yǎng)液200 μL。每個1α，25-（OH）2D3濃度梯度設(shè)定3個復(fù)孔，試驗重復(fù)6次。卵巢顆粒細(xì)胞在37℃、5%CO2濃度條件下培養(yǎng)6 d，期間每48 h換液一次。6 d以后抽取細(xì)胞上清液，用牛雌二醇ELISA試劑盒，按其說明書步驟對各樣品雌二醇濃度進(jìn)行測定。吸取上清后，用胰酶消化剩余細(xì)胞，將細(xì)胞吹散后終止消化，然后用血細(xì)胞計數(shù)板對各個孔細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)。

1.6統(tǒng)計分析

所有數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。方差分析使用單因素方差分析，多重比較采用Duncan法。

2　結(jié)果

2.11α，25-（OH）2D3對牛卵泡顆粒細(xì)胞活力的影響

牛卵泡顆粒細(xì)胞經(jīng)體外培養(yǎng)24 h后，不同濃度1α，25-（OH）2D3對牛卵泡顆粒細(xì)胞活力的影響如圖1所示。與不添加1α，25-（OH）2D3的對照組相比，當(dāng)1α，25-（OH）2D3添加量為1、10、100 nM時，顆粒細(xì)胞的活力都有顯著提高（P<0.01）。當(dāng)添加濃度為100 nM時，顆粒細(xì)胞的活力最高。

圖1　1α，25-（OH）2D3對牛卵巢卵泡顆粒細(xì)胞活力的影響

2.21α，25-（OH）2D3對牛卵泡顆粒細(xì)胞增殖的影響

牛卵泡顆粒細(xì)胞經(jīng)體外培養(yǎng)6 d后，不同濃度1α，25-（OH）2D3對牛卵泡顆粒細(xì)胞增殖的影響如圖2所示。與不添加1α，25-（OH）2D3的對照組相比，當(dāng)1α，25-（OH）2D3添加量為10、100 nM時，顆粒細(xì)胞的數(shù)目都顯著提高（P<0.01），當(dāng)添加濃度為100 nM時，顆粒細(xì)胞的數(shù)目最多。

圖2　1α，25-（OH）2D3對牛卵巢卵泡顆粒細(xì)胞增殖的影響

2.31α，25-（OH）2D3對牛卵泡顆粒細(xì)胞雌二醇分泌的影響

牛卵泡顆粒細(xì)胞經(jīng)體外培養(yǎng)6 d后，不同濃度1α，25-（OH）2D3對牛卵泡顆粒細(xì)胞雌二醇分泌的影響如圖3所示。與不添加1α，25-（OH）2D3的對照組相比，當(dāng)1α，25-（OH）2D3添加量為10、100 nM時，卵泡顆粒細(xì)胞雌二醇分泌顯著提高（P<0.01），當(dāng)添加濃度為10 nM時，顆粒細(xì)胞雌二醇分泌量最大。

圖3　1α，25-（OH）2D3對牛卵巢卵泡顆粒細(xì)胞雌二醇分泌的影響

3　討論

維生素D是一種脂溶性維生素，屬于類固醇激素家族的一員。近年來，維生素D對動物生殖的影響多有報道，但是對母牛生殖的影響未見報道。本研究首次以母牛為研究對象，探尋了維生素D對母牛卵巢卵泡顆粒細(xì)胞的影響。卵巢卵泡顆粒細(xì)胞是雌性動物至關(guān)重要的細(xì)胞，因為它是雌激素的主要來源，而雌激素決定了雌性動物的性成熟與生殖。

CCK-8近來廣泛用于細(xì)胞活力檢測［11］，其能與細(xì)胞線粒體內(nèi)脫氫酶進(jìn)行反應(yīng)，生成黃色的甲瓚化合物，顏色越深則說明細(xì)胞活力越強(qiáng)。本研究用CCK-8證明1α，25-（OH）2D3對卵泡顆粒細(xì)胞活力有促進(jìn)作用。顆粒細(xì)胞的活力越強(qiáng)則其增殖與分泌功能也應(yīng)越強(qiáng)，隨后對于顆粒細(xì)胞增殖的試驗與雌二醇分泌的試驗也證實(shí)了這一點(diǎn)。不過對于雌二醇而言，1α，25-（OH）2D3對其的最佳刺激濃度并不是100 nM，而是10 nM。這一點(diǎn)不同于細(xì)胞活力試驗與細(xì)胞增殖試驗的結(jié)果?？赡苁?α，25-（OH）2D3對雌二醇分泌的調(diào)節(jié)機(jī)制不同于另外兩者，因此造成了這樣的差異。

1α，25-（OH）2D3對細(xì)胞增殖的影響在非生殖細(xì)胞內(nèi)早有研究［12］，本研究也證明了1α，25-（OH）2D3對卵泡顆粒細(xì)胞的增殖有促進(jìn)作用，并且對雌二醇的分泌也有促進(jìn)作用。牛卵泡發(fā)育呈現(xiàn)卵泡波的形式，顆粒細(xì)胞增殖與其分泌的雌二醇在卵泡發(fā)育中起到至關(guān)重要的作用。在同一波的卵泡中，只有優(yōu)勢卵泡才能一直發(fā)育并最終排卵，而其它卵泡都不得不閉鎖退化掉。而優(yōu)勢卵泡的特點(diǎn)就是顆粒細(xì)胞增殖迅速，雌二醇分泌旺盛［13-14］。母牛自出生之日起，其卵巢內(nèi)卵子數(shù)目便不會再增加。但是母牛的卵泡會不停地閉鎖退化，導(dǎo)致母牛終生可用的卵子數(shù)目不足1%。1α，25-（OH）2D3對母牛卵泡顆粒細(xì)胞的增殖及雌二醇的分泌都有促進(jìn)作用，或許會因此改善母牛的生殖能力，對于這一點(diǎn)還需要繼續(xù)深入研究。

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Effects of Vitamin D on Follicular Granulose Cells of Cattle Ovarian

Jin Guang，ZhangYuanqing，Xue Yanrong，et al
（Animal Husbandryand VeterinaryInstitute，Shanxi AcademyofAgricultural Sciences，Taiyuan,030000，China）

The objectives of present study were to investigate the effects of bioactive vitamin D（1α，25-（OH）2D3）on cell viability，proliferation and estradiol production of follicular granulose cells of cattle ovarian in vitro.The granulose cells were cultured with different concentrations of1α，25-（OH）2D3，then the cell viabilitywas measured byCCK-8，the cell proliferation was measuredby cell counting and the concentrations of estradiol were measured by ELISA.The results showed that 1α，25-（OH）2D3（1，10，100 nM）enhanced cell viability，100 nM1α，25-（OH）2D3worked best.The results also showed that 1α，25-（OH）2D3（10，100 nM）enhanced cell proliferation and estradiol production.When the concentration of1α，25-（OH）2D3was 100 nM，the stimulation on cell proliferation was the strongest.While the concentration of 1α，25-（OH）2D3was 10 nM，the stimulation on estradiol production was the strongest.

vitamin D；cattle；follicular granulose cell；cell viability；proliferation；estradiol

S823.3

A

2095-3887（2015）03-0019-04

10.3969/j.issn.2095-3887.2015.03.006

2015-02-16

山西省研究生創(chuàng)新項目（20133056）

靳光（1981-），男，助理研究員，碩士。

薛艷蓉（1982-），女，助理研究員，碩士。