王 巖，馮萬宇，劉 宇，李 丹，王 爽，史同瑞

（黑龍江省獸醫(yī)科學(xué)研究所，齊齊哈爾 161006）

保護劑在益生菌保藏過程中的應(yīng)用

王 巖，馮萬宇，劉 宇，李 丹，王 爽，史同瑞

（黑龍江省獸醫(yī)科學(xué)研究所，齊齊哈爾 161006）

保護劑是影響益生菌活力最重要的外部因素，具有無免疫原性、無毒副作用、易溶解，能充分保持生物活性等特點，在益生菌保藏過程中可充分發(fā)揮其良好的保護效果。文章簡單地介紹了保護劑的基本概念、分類情況，重點闡述了保護劑的作用機理和在益生菌保藏過程中的應(yīng)用情況，并對保護劑的應(yīng)用前景進行了分析和展望。

保護劑；益生菌；保藏；冷凍；干燥

益生菌是定植于人與動物體腸道、生殖系統(tǒng)內(nèi)，能產(chǎn)生確切健康功效，從而改善宿主微生態(tài)平衡、發(fā)揮有益作用的活性有益微生物的總稱。由于其較難長期保存，益生菌的保藏成了熱門研究課題。

益生菌的保藏過程是一個多步驟過程，例如冷凍干燥會產(chǎn)生低溫、凍結(jié)和脫水等多種效應(yīng)；即使成功完成冷凍干燥過程后，在長期保藏過程中也很難保證凍干制品活性組分的穩(wěn)定性。為了防止益生菌在冷凍干燥和貯藏過程中活性組分的變性，研究者們研究和探索了大量有效的保護添加劑。當(dāng)益生菌添加保護劑時，可以有效改變冷凍干燥時菌體細胞所處的物理、化學(xué)環(huán)境，減輕或防止冷凍干燥對菌體細胞的損害，使益生菌保持原有的理化特性和生物活性，因此保護劑有效利用已成為提高菌種存活率的關(guān)鍵技術(shù)［1］。不同的保護劑各有優(yōu)缺點，單一保護劑不能滿足菌體抵抗外界惡劣環(huán)境的條件，而復(fù)配保護劑中各保護劑在冷凍干燥中則均發(fā)揮著各自的作用，同時相互間又具有協(xié)同作用［2］，因而將各保護劑調(diào)整合適的比例及濃度進行復(fù)配，以達到對益生菌的最佳保護作用，才是研究者們今后研究和探索的方向。

1　保護劑概述及分類

保護劑也稱穩(wěn)定劑（stabilizer），是指一類能防止生物活性物質(zhì)在冷凍真空干燥時受到破壞的物質(zhì)。按分子量大小分為低分子化合物（lowmolecular compound）與高分子化合物（high molecular compound）；按其功能和性質(zhì)可分為凍干保護劑（lyoprotectant）、抗氧化劑（antioxidant）、填充劑（lyoprotectant）、酸堿調(diào)整劑（pH modifier）（表1）；按物質(zhì)的種類分類，可分糖/多元醇類（sugars/polyols）、聚合物類（polymers）、表面活性劑類（surfactants）、氨基酸類（aminoacids）、鹽類（salts）（表2）。

表1　保護劑的分類（一）

表2　保護劑的分類（二）

2　保護劑的作用機理

保護劑對益生菌的保護作用與其化學(xué)結(jié)構(gòu)有密切關(guān)系，目前普遍接受的機理主要是優(yōu)先化理論、水替代假說與玻璃化假說。前者主要用于闡釋在冷凍過程中保護劑的作用原理，后兩者用于解釋益生菌干燥過程中保護劑的作用機理。

優(yōu)先化理論涉及兩方面內(nèi)容：一是優(yōu)先水化，即蛋白質(zhì)優(yōu)先和水發(fā)生作用；二是優(yōu)先排斥，保護劑優(yōu)先從蛋白質(zhì)表面進入溶液中，使其能在冷凍的過程中發(fā)揮保護蛋白質(zhì)的作用［2］。此機理發(fā)揮保護作用的本質(zhì)是提高蛋白質(zhì)變性自由能，使蛋白質(zhì)變性過程條件更加苛刻以阻止蛋白質(zhì)變性［4］。由于在干燥過程中，蛋白質(zhì)參與水合作用的單層外殼已經(jīng)消失，故優(yōu)先交互作用機制不復(fù)存在，因此許多在溶液中能穩(wěn)定蛋白質(zhì)的輔料在干燥過程中不再具有保護作用［5］。

玻璃態(tài)假說認(rèn)為在凍干過程中，有些保護劑體系會隨溫度降低而使電解質(zhì)形成一種粘度極大的非晶體的玻璃態(tài)，保護劑體系發(fā)生玻璃態(tài)轉(zhuǎn)化的溫度稱為玻璃態(tài)轉(zhuǎn)化溫度［4］。研究表明，單糖、雙糖、多羥基化合物以及結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)、酶等均能形成玻璃態(tài)，只是玻璃化轉(zhuǎn)變溫度不同。在玻璃態(tài)下，物質(zhì)兼有固體和流體的行為，當(dāng)干燥蛋白質(zhì)藥物時，保護劑可緊密地包裹相鄰近的蛋白質(zhì)分子，形成一種在結(jié)構(gòu)上與冰相似的碳水化合物玻璃體，由于粘度高擴散系數(shù)低，蛋白質(zhì)分子運動能力減弱，其亞穩(wěn)態(tài)的構(gòu)象互變及構(gòu)象松弛減慢，大分子物質(zhì)的鏈段運動受阻，使其伸展和聚集受到抑制，分子空間結(jié)構(gòu)得到維持，從而起到保護作用。

水替代假說認(rèn)為，在凍干過程中，由于糖類形成氫鍵能力較強，在氫鍵形成中既可作為孤對電子的受體，又可作為供體。因此，在凍干過程中，糖的羥基與蛋白質(zhì)的極性基團形成氫鍵而代替蛋白質(zhì)極性基團周圍的水分子，使蛋白質(zhì)表面形成一層假定的水化膜，這樣可保護氫鍵的聯(lián)結(jié)位置不直接暴露在周圍環(huán)境中，穩(wěn)定蛋白質(zhì)的高級結(jié)構(gòu)可防止蛋白質(zhì)因凍干而變性，使其即使在低溫冷凍和干燥失水的情況下仍保持其結(jié)構(gòu)與功能的完整性。DePaz等［6］研究顯示，雙糖能通過形成氫鍵與枯草桿菌蛋白酶結(jié)合取代水的位置，阻止干燥誘導(dǎo)的變性。Santivarangkna等［7］通過紅外光譜的方法發(fā)現(xiàn)，保護劑和蛋白質(zhì)在凍干過程中形成了氫鍵，由于不同的保護劑和不同的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)差別都較大，所以它們之間形成氫鍵的能力也不相同。例如麥芽低聚糖的保護能力隨著二糖單位數(shù)量的增加而降低，這是由于蛋白質(zhì)相互作用的羥基數(shù)量減少造成的［8］。

3　保護劑在益生菌保藏過程中的應(yīng)用

在益生菌的保藏過程中，一種優(yōu)良的保護劑應(yīng)具備玻璃化溫度高、吸濕性能和結(jié)晶速率低及不具有還原性基團等多種保護特性。單一保護劑的天然缺陷使其保護效果有限而致使其保護菌種不理想，研制復(fù)合型保護劑是當(dāng)今乃至今后一段時間內(nèi)益生菌保藏的重點方向和主要趨勢之一。但由于復(fù)合保護劑研究必然涉及復(fù)配的種類和用量的要求，而且同一配方的復(fù)合保護劑對于不同菌種保護效果也不完全相同，所以正確的試驗設(shè)計對于益生菌復(fù)合保護劑的篩選就顯得非常重要了。

3.1保護劑在單一益生菌保藏過程中的應(yīng)用

在單一益生菌保藏過程中，可采用糖類、醇類、聚合物類、氨基酸類以及鹽類等物質(zhì)作保護劑。不同種類的保護劑也各有優(yōu)缺點，一些醇類雖對冷凍傷害有很好的預(yù)防作用，但由于吸濕性極強，一般不單獨用作凍干保護劑。大分子保護劑只能外部保護細胞表面免受損傷，不能滲透到細胞內(nèi)部使細胞內(nèi)溶質(zhì)的濃度升高，也不能減緩冰晶的生成從而減少凍干對細胞內(nèi)部的損傷，所以大分子保護劑單獨使用時，在保存期間對細胞的保護效果不明顯［9］，另外，不同保護劑對不同菌種的保護效果也不盡相同，這就需要通過反復(fù)多次實驗研究來確定效果最佳的復(fù)配保護劑。熊濤等［10］采用單因素和Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計聯(lián)用的方法篩選和優(yōu)化植物乳桿菌NCU116真空冷凍干燥的保護劑配方的研究結(jié)果表明，海藻糖、D-山梨醇和脫脂奶粉3種保護劑效果好，能夠顯著提高菌種對冷凍干燥環(huán)境的耐受能力，以9.24%脫脂奶粉、4.47%海藻糖和13.42%D-山梨醇作為凍干保護劑配方進行驗證試驗，細胞存活率可達（91.76±1.82）%，與理論預(yù)測值相符。Tadanori等［11］通過對海藻糖溶液中冰晶生長速率和形態(tài)學(xué)的研究表明，海藻糖溶液中冰晶生長速率要比純水中小得多，海藻糖抑制冰晶生長的能力是蔗糖的2倍。與蔗糖相比，它能顯著抑制冰晶生成的形態(tài)不穩(wěn)定性。他們認(rèn)為這是由于海藻糖能結(jié)合更多的水分所致。

胥振國等［12］對凍干高活力納豆芽胞桿菌菌粉保護劑進行篩選和優(yōu)化，結(jié)果表明，納豆芽胞桿菌的最佳冷凍干燥保護劑配方是脫脂乳粉10%、甘露醇4%、L-抗壞血酸鈉1%，其存活率達91.63%。菌粉在－20℃、4℃、25℃下保存12個月后，存活率分別為88.79%、70.16%和10.52%，說明菌粉在－20℃和4℃下保存穩(wěn)定性較好，25℃下保存穩(wěn)定性較差。劉松玲等［13］為提高長雙歧桿菌BBMN68的冷凍保藏效果，以冷凍存活率和菌株活力為評價指標(biāo)，分別評價了4個類型的18種冷凍保護劑。結(jié)果表明，脫脂乳、海藻糖、果糖、甘油、維生素C、L-Glu能對BBMN68有效保護。采用二次回歸正交設(shè)計對篩選的6種保護劑進行復(fù)配，得到復(fù)配保護劑的最優(yōu)配方質(zhì)量分?jǐn)?shù)為甘油3%、海藻糖5%、果糖5%、脫脂乳8%、維生素C 0.05%、L-Glu 0.05%。在復(fù)配保護劑的作用下，－80℃保藏期間BBMN68菌數(shù)穩(wěn)定，活菌對數(shù)值始終保持在105cfu/mL。冷凍濃縮物作為直投發(fā)酵劑應(yīng)用于酸奶中，在21 d內(nèi)菌數(shù)變化不大，始終保持在107cfu/mL以上。

王世寬等［14］采用單因素實驗和響應(yīng)面實驗設(shè)計聯(lián)用的方法，篩選優(yōu)化植物乳桿菌和凝結(jié)芽孢桿菌真空冷凍干燥的保護劑配方。單因素實驗結(jié)果表明，脫脂奶粉、麥芽糖和谷氨酸鈉3種保護劑效果較好，能夠顯著提高菌種對冷凍干燥環(huán)境的耐受能力。以細胞存活率為響應(yīng)值，混合保護劑的最佳配方為脫脂奶粉7.06%、麥芽糖6.46%、谷氨酸鈉6.70%，植物乳桿菌冷凍干燥存活率達92.95%，凝結(jié)芽孢桿菌的冷凍干燥存活率達94.1%。

3.2保護劑在混合益生菌保藏過程中的應(yīng)用

在混合益生菌保藏過程中，也可采用糖類、醇類、聚合物類、氨基酸類、鹽類等物質(zhì)作為保護劑。由于混合益生菌是由幾種菌組合而成，這就需要所篩選的復(fù)配保護劑組方必須同時滿足幾種益生菌的要求，才能達到最佳的保護效果。陳賀佳等［15］將嗜熱鏈球菌、保加利亞乳桿菌、嗜酸乳桿菌按3:2:1比例制備乳酸菌凍干保護劑。通過正交試驗確定混合乳酸菌最佳保護劑配方為甘氨酸1.0%、脫脂乳10.0%、海藻糖7.0%、山梨醇1.0%。研究結(jié)果表明，冷凍干燥法制備的復(fù)合凍干保護劑對菌種保護效果優(yōu)于單一保護劑。杜磊等［16］通過在保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌混合菌懸液中添加不同的保護劑，并測定了冷凍前后乳酸菌菌數(shù)，篩選出適用的保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌混合菌的保護劑。最終確定的保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌混合菌保護劑配方為10%蔗糖、10%脫脂乳、5%谷氨酸鈉。菌體經(jīng)冷凍處理后，冷凍存活率可達95.00%，比不添加保護劑的菌體存活率大大提高。

4　保護劑的應(yīng)用前景

益生菌在冷凍干燥過程中容易造成部分菌體細胞的損傷、死亡及某些酶蛋白分子的鈍化，因此，為了提高益生菌凍干后的存活率，凍干前必須加入保護介質(zhì)來減少它的凍干損傷和增加蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性。但蛋白質(zhì)的穩(wěn)定機制相當(dāng)復(fù)雜，對蛋白質(zhì)凍干制品的研究仍有待進一步深化。開發(fā)更優(yōu)越的凍干保護劑，提高蛋白質(zhì)藥物凍干制品的質(zhì)量仍是現(xiàn)今生物技術(shù)藥物研究的重點與方向。在選擇復(fù)配保護劑時，通常采用不同種類的保護劑才能獲得顯著的保護效果，而且選用盡可能少的輔料種類對實際生產(chǎn)有著重要意義。復(fù)配保護劑在冷凍干燥過程中發(fā)揮著各自作用的同時又具有相互協(xié)同作用，保護劑的比例及濃度達到協(xié)調(diào)時將會加速干燥，且能在干燥和保存期間維持較高的益生菌存活率，從而達到最佳保護效果，因此在選擇保護劑時要綜合考慮多種因素，盡量節(jié)約成本和減少工作量。相信隨著研究的不斷深入，益生菌保護劑的研究將具有更加廣闊的應(yīng)用前景，勢必會對促進微生態(tài)制劑的健康發(fā)展起到積極的推動作用。

［1］ CarvalhoAS，Silva J，HoP，et a1.Survival offreeze-dried Lactobacillus Plantarum and Lactobacillus Ramnosus during storage in the presence ofprotectants［J］.BiotechnologyLetter，2002，24：1587-1591.

［2］ 袁亞宏，岳田利，高振鵬，等.凍干高活力乳酸菌粉保護劑的研究［J］.西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版，2003，31（10）：82-84.

［3］ Timasheff S N.Control of protein ptabilityand reactions byweaklyinteractingcosolvents：the simplicityofthe complicated［J］.Protein Chem，1998，51：355-432.

［4］ 任艷，陳明，邵玉宇，等.真空冷凍干燥過程中保護劑對乳酸菌的保護機理［J］.中國乳品工業(yè)，2013，41（9）：41-45.

［5］ 孫東坡，胡一橋.蛋白質(zhì)冷凍干燥制品中的保護劑及其保護機制［J］.藥學(xué)進展，2003，27（4）：201-205.

［6］ Depaz R A，Dale D A，Barnett C C，et al.Effects of drying dethods and additives on the structure，function and storage stability of subtilisin：role of protein conformation and molecular mobility［J］.Enzyme and Microbial Technology，2002，31（6）：765-774.

［7］ Santivarangkna C，WenningM，F(xiàn)oerst P，et al.Damage of cell envelope oflactobacillus helveticus duringvacuumdrying［J］.Journal ofApplied Microbiology,2007，102（3）：748-756.

［8］Izutsu Ken-ichi，Aoyagi Nobuo，Kojima Shigeo.Protection of protein secondarystructure bysaccharides ofdifferent molecular weights duringfreeze-drying［J］.Chemical&Pharmaceutical Bulletin（Tokyo）,2004，52：199-203.

［9］ 張建國，張春暉，李鳳彩，等.乳酸菌凍干傷害與保護［J］.食品工業(yè)科技，2003，24（1）：103-105.

［10］熊濤，黃錦卿，宋蘇華，等.植物乳桿菌真空冷凍干燥保護劑配方優(yōu)化［J］.南昌大學(xué)學(xué)報：理科版，2010，34（6）：561-565.

［11］Tadanori S，Takehiko G，Yoshiyasu A.Growth rate and morphology of ice crystals growing in a solution of trehalose and water［J］.Crystal Growth，2002，240（1-2）：218-229.

［12］胥振國，蔡玉華，向敏，等.凍干高活力納豆芽胞桿菌菌粉保護劑的篩選和優(yōu)化［J］.微生物學(xué)通報，2013，40（5）：822-828.

［13］劉松玲，蔣薔莉，劉愛萍，等.長雙歧桿菌冷凍保護劑篩選與優(yōu)化［J］.農(nóng)業(yè)機械學(xué)報，2010，41（4）：140-144.

［14］王世寬，洪玉程，袁先鈴.響應(yīng)面法優(yōu)化植物乳桿菌和凝結(jié)芽孢桿菌凍干保護劑的研究［J］.四川理工學(xué)院學(xué)報：自然科學(xué)版，2013，26（5）：23-26.

［15］陳賀佳，牟光慶.混合乳酸菌復(fù)合凍干保護劑的研究［J］.食品研究與開發(fā)，2013，34（18）：133-136.

［16］杜磊，喬發(fā)東.乳酸菌冷凍保護劑選擇的研究［J］.乳業(yè)科學(xué)與技術(shù)，2010，142（3）：119-121.

Application of Protector in the Preservation of Probiotics

WangYan，F(xiàn)engWanyu，Liu Yu，et al
（HeilongjiangVeterinaryScience Institutes，Qiqihar 161006，China）

Protector was the capital outside factor which possessed specialty of an-immunogenicity，toxic and side-effect，easy deliquescence and kept thoroughly biological activity.It had satisfactory conservancy effectiveness in probiotic preservation.This text introduced the basic concept，systematic status and mechanism of action，utilization state of protecting agent.At the same time，the application perspective was analyzed and looked intothe future.

protector；probiotic；preserve；freezing；dessication

S816.7

A

2095-3887（2015）03-0052-04

10.3969/j.issn.2095-3887.2015.03.017

2015-03-16

王巖（1976-），女，高級獸醫(yī)師，大學(xué)本科，主要從事動物微生態(tài)制劑的研究工作。