郭維民，劉舒云，高鉞，黃靖香，彭江，汪愛(ài)媛，王玉，盧世璧，郭全義

脫細(xì)胞半月板細(xì)胞外基質(zhì)對(duì)半月板細(xì)胞的影響

郭維民，劉舒云，高鉞，黃靖香，彭江，汪愛(ài)媛，王玉，盧世璧，郭全義

目的 探討脫細(xì)胞半月板細(xì)胞外基質(zhì)（dMECM）對(duì)傳代半月板細(xì)胞增殖、細(xì)胞活性以及細(xì)胞表型的影響。

方法 用 CCK-8 法檢測(cè) dMECM 對(duì)半月板細(xì)胞增殖的影響；將 P3代的內(nèi)側(cè)半月板纖維軟骨細(xì)胞種植在 dMECM修飾蓋玻片上，以未修飾蓋玻片為對(duì)照，體外培養(yǎng) 7、14 d后進(jìn)行細(xì)胞活性檢測(cè)，糖胺多糖、膠原分泌含量測(cè)定并用RT-PCR 檢測(cè)半月板細(xì)胞特異性基因 mRNA 表達(dá)變化。

結(jié)果 CCK-8 結(jié)果證實(shí)，與對(duì)照組比較，生長(zhǎng)在 dMECM修飾蓋玻片上的 P3代兔半月板纖維軟骨細(xì)胞具有更好的細(xì)胞增殖特性（P ＜ 0.05）；細(xì)胞死/活染色結(jié)果證實(shí) dMECM組可維持更好的細(xì)胞活性；糖胺多糖和膠原定量檢測(cè)結(jié)果證實(shí) dMECM 組在第 7、14 天時(shí)，比對(duì)照組分泌更多的糖胺多糖和膠原（P ＜ 0.05）。RT-PCR 的檢測(cè)結(jié)果證實(shí)體外培養(yǎng)7、14 d 時(shí)，dMECM 組 II 型膠原 mRNA 表達(dá)顯著上調(diào)（P ＜ 0.05）。

結(jié)論 dMECM 可以很好地促進(jìn)半月板纖維軟骨細(xì)胞的增殖、分化以及細(xì)胞活性的維持，可能是未來(lái)半月板組織工程領(lǐng)域非常有前景的支架材料之一。

細(xì)胞外基質(zhì)； 關(guān)節(jié)半月板； 組織工程； 生物相容性材料； 脫細(xì)胞； 纖維軟骨細(xì)胞

半月板損傷是膝關(guān)節(jié)的常見(jiàn)損傷之一。因半月板內(nèi)側(cè)區(qū)域無(wú)神經(jīng)、血管，若發(fā)生損傷，往往難以自愈，傾向于永久性的創(chuàng)傷后退變［1］。半月板組織工程技術(shù)給半月板損傷治療帶來(lái)了新的希望［2］。一般而言，半月板組織工程主要由種子細(xì)胞、支架、生物學(xué)或生物力學(xué)刺激三部分構(gòu)成［3］。在半月板支架材料領(lǐng)域，采用脫細(xì)胞技術(shù)制備的細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）生物材料，因其可以有效去除移植免疫源性物質(zhì)，保留 ECM 成分及其生物活性物質(zhì)而受到了廣泛關(guān)注［4］。ECM 支架材料類似于天然半月板的細(xì)胞外基質(zhì)成分，與其他傳統(tǒng)材料相比，具有為種子細(xì)胞提供生長(zhǎng)、分化的天然微環(huán)境的優(yōu)越性，有利于更好地構(gòu)建組織工程半月板。前期我們實(shí)驗(yàn)室嘗試通過(guò)純物理的方法（濕法粉碎、差速離心）制備新型的脫細(xì)胞半月板細(xì)胞外基質(zhì)（decellularized meniscal extracellular matrix，dMECM）材料。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，dMECM 可以很好地保留半月板天然的細(xì)胞外基質(zhì)成分，去除細(xì)胞核物質(zhì)，仿生細(xì)胞生長(zhǎng)的微環(huán)境［5］。為進(jìn)一步探索dMECM 作為半月板組織工程支架材料的可行性，本實(shí)驗(yàn)將考察傳代半月板纖維軟骨細(xì)胞在 dMECM上的細(xì)胞活性、細(xì)胞表型、膠原含量以及特異性基因 mRNA 表達(dá)變化。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 DMEM 培養(yǎng)基、0.2% 的 II 型膠原酶、0.25% 胰蛋白酶、死/活細(xì)胞染色試劑盒均購(gòu)自美國(guó) Sigma 公司；胎牛血清（FBS）購(gòu)自美國(guó)Gibco 公司；“三抗”（青霉素、鏈霉素、兩性霉素）和 DEPC 水購(gòu)自上海碧云天公司生物技術(shù)研究所；CCK-8 檢測(cè)試劑盒購(gòu)自日本 Dojindo 公司；細(xì)胞 GAG 含量 DMMB 法檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)GenMed Scientifics Inc 公司；羥脯氨酸測(cè)試試劑盒購(gòu)自南京建成科技公司；氯仿、異丙醇購(gòu)自北京化學(xué)試劑有限公司；TRIzol 購(gòu)自美國(guó) Life Technologies公司；ReverTra Ace? qPCR RT Master Mix、SYBR Green 購(gòu)自日本 Toyobo 公司；兔半月板細(xì)胞特異性引物購(gòu)自北京 Parkson 公司。

1.1.2 儀器 Allegra X-22R 型低溫高速離心機(jī)和 DU640 型紫外分光光度計(jì)購(gòu)自美國(guó) Beckman公司；85-2 型恒溫磁力攪拌器購(gòu)自江蘇常州國(guó)華儀器公司；BB5060 型 CO2培養(yǎng)箱購(gòu)自德國(guó) Heraeus公司；IX 70 型熒光顯微鏡購(gòu)自日本 Olympus 公司；Epoch Take 3 酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó) Bio Tek公司；RT-PCR 儀購(gòu)自美國(guó) Applied Biosystems 公司。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 新鮮豬關(guān)節(jié)購(gòu)自北京市屠宰場(chǎng)，共購(gòu)取 10 月豬齡的 20 個(gè)膝關(guān)節(jié)；2.5 月齡的健康新西蘭白兔 8 只，雌雄不限，體重 2.5 kg，購(gòu)自解放軍總醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方案均經(jīng)解放軍總醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 脫細(xì)胞半月板細(xì)胞外基質(zhì)及其修飾蓋玻片的制備 脫細(xì)胞半月板細(xì)胞外基質(zhì)及其修飾蓋玻片的制備參照文獻(xiàn)［5］，所有操作均在超凈臺(tái)內(nèi)進(jìn)行。

1.2.2 內(nèi)側(cè)半月板細(xì)胞分離培養(yǎng)及傳代 取新西蘭大白兔，分離內(nèi)側(cè)半月板細(xì)胞，消化、培養(yǎng)、傳代方法參見(jiàn)文獻(xiàn)［5］，取 P3代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 細(xì)胞增殖試驗(yàn) 用 CCK-8 法測(cè)定 dMECM對(duì)半月板細(xì)胞增殖特性的影響。首先包被 96 孔板，實(shí)驗(yàn)組每孔加入 62 μl 1 mg/ml 的 dMECM，對(duì)照組每孔加入 62 μl 無(wú)菌三蒸水，在室溫下風(fēng)干。所有步驟均在超凈臺(tái)下操作。將 200 μl P3代的兔半月板纖維軟骨細(xì)胞懸液（2.5 × 103個(gè)）加入96 孔板內(nèi)，置于 37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)生長(zhǎng)。第 1、3、6 天時(shí)，在需測(cè)量的實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組（每組 6 孔）分別加入 20 μl CCK-8 試劑，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育 2.5 h 后用酶標(biāo)儀測(cè)量 450 nm處的 OD 值。

1.2.4 死/活細(xì)胞染色 將 P3代的兔半月板纖維軟骨細(xì)胞胰酶消化，Hanks 平衡液充分洗滌，制備成 3 × 104/ml 的細(xì)胞懸液，接種于含 dMECM 修飾蓋玻片的六孔板內(nèi)，每孔 1 ml。將六孔板置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱孵育 30 min，確保細(xì)胞黏附。然后每孔添加 2 ml 含 10% FBS 的 DMEM 培養(yǎng)液，繼續(xù) 37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每周更換兩次細(xì)胞培養(yǎng)液。

將體外培養(yǎng) 7、14 d 的半月板細(xì)胞/dMECM修飾蓋玻片復(fù)合物取材（每組隨機(jī)選取 5 個(gè)樣本），無(wú)菌 PBS 溶液清洗 2 次；將復(fù)合物用濃度為 5 × 10-3mg/ml 的二乙酸熒光素（FDA）室溫、黑暗條件下孵育 5 min；去除 FDA，無(wú)菌 PBS溶液清洗 2 次；使用濃度為 5 × 10-3mg/ml 的 PI 室溫、黑暗條件下孵育 5 min；去除 PI，無(wú)菌 PBS 溶液清洗 2 次，熒光顯微鏡觀察。

1.2.5 糖胺多糖的測(cè)定 用細(xì)胞刮勺將體外培養(yǎng)7、14 d 的半月板細(xì)胞/dMECM 修飾蓋玻片復(fù)合物收集取材（每組隨機(jī)選取 5 個(gè)樣本）。糖胺多糖（glycosaminoglycan，GAG）的測(cè)定采用 DMMB法，所有的實(shí)驗(yàn)步驟依照細(xì)胞 GAG 含量 DMMB法檢測(cè)試劑盒的實(shí)驗(yàn)說(shuō)明進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.6 膠原含量的測(cè)定 用細(xì)胞刮勺將體外培養(yǎng)7、14 d 的半月板細(xì)胞/dMECM 修飾蓋玻片復(fù)合物收集取材（每組隨機(jī)選取 5 個(gè)樣本）。膠原含量的測(cè)定采用羥脯氨酸法，所有的實(shí)驗(yàn)步驟依照羥脯氨酸測(cè)試試劑盒的實(shí)驗(yàn)說(shuō)明進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.7 特異性基因 mRNA 表達(dá)變化的 RT-PCR檢測(cè) 收集 P3代半月板細(xì)胞，體外培養(yǎng) 7、14 d的半月板細(xì)胞/dMECM 修飾蓋玻片復(fù)合物（每組隨機(jī)選取 5 個(gè)樣本）。然后使用 TRIzol 提取 RNA，反轉(zhuǎn)錄獲取 cDNA。構(gòu)建含有 1 μl cDNA 的 20 μl RT-PCR 的反應(yīng)體系，其中還包括 SYBR Green Realtime PCR Master Mix-Plus 和特異性的引物（表 1）。將 20 μl PCR 反應(yīng)體系首先 95 ℃ 預(yù)變性 2 min；95 ℃ 變性 15 s，55 ℃ 退火 30 s，72 ℃延伸 30 s，共循環(huán) 40 次。

實(shí)驗(yàn)所需兔半月板細(xì)胞特異性引物根據(jù) NCBI 和 PubMed 發(fā)表的基因序列設(shè)計(jì)。并選擇 GAPDH作為內(nèi)標(biāo)。樣本的 mRNA 基因表達(dá)量根據(jù)相應(yīng)的GAPDH 使用 2-△△CT的方法進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化計(jì)算。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

表1 RT-PCR 實(shí)驗(yàn)所使用的主要目的基因序列Table 1 Primer sequences of target genes used for RT-PCR

2 結(jié)果

2.1 dMECM 對(duì)半月板細(xì)胞增殖的影響

CCK-8 測(cè)試細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，dMECM組和對(duì)照組隨著時(shí)間的推移，細(xì)胞數(shù)量都呈現(xiàn)不斷增加的趨勢(shì)（圖 1）。結(jié)果表明，第 1 天 dMECM組和對(duì)照組細(xì)胞增殖沒(méi)有差異（P ＞ 0.05）；第 3 天和第 6 天 dMECM 組的細(xì)胞增殖率要高于對(duì)照組，且存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P ＜ 0.05）。

2.2 半月板細(xì)胞/dMECM 修飾蓋玻片復(fù)合物細(xì)胞活性觀察

傳代的纖維軟骨細(xì)胞在不同的修飾蓋玻片組呈現(xiàn)不同的細(xì)胞活性。體外培養(yǎng) 7 d 時(shí)，與空白對(duì)照組（圖 2A）比較，可見(jiàn) dMECM 組（圖 2B）存在更多的活細(xì)胞（綠色熒光點(diǎn)），未見(jiàn)明顯死細(xì)胞。體外培養(yǎng) 14 d 時(shí)，可見(jiàn)空白對(duì)照組（圖 2C）和 dMECM 組（圖 2D）活細(xì)胞數(shù)無(wú)明顯差異。

2.3 GAG 含量測(cè)定結(jié)果

DMMB 法測(cè)定細(xì)胞 GAG 含量的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，dMECM 組和對(duì)照組隨著時(shí)間的推移，細(xì)胞分泌的 GAG 含量都呈現(xiàn)不斷增加的趨勢(shì)（圖 3）。培養(yǎng) 7、14 d 的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明 dMECM 組所分泌的 GAG 含量均要高于對(duì)照組，且存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P ＜ 0.05）。

圖1 dMECM 對(duì)半月板細(xì)胞增殖影響的 CCK-8 實(shí)驗(yàn)結(jié)果（*P ＜ 0.05）Figure 1 The cell proliferation characteristics of dMECM was assessed using CCK-8 assay （*P ＜ 0.05）

2.4 膠原含量測(cè)定結(jié)果

羥脯氨酸法測(cè)定細(xì)胞膠原含量的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，dMECM 組和對(duì)照組隨著時(shí)間的推移，細(xì)胞分泌的膠原含量都呈現(xiàn)不斷增加的趨勢(shì)（圖 4）。7、14 d dMECM 組所分泌的膠原含量均顯著高于對(duì)照組（P ＜ 0.05）。

圖2 半月板細(xì)胞/dMECM 修飾蓋玻片復(fù)合物 7、14 d 時(shí)死/活細(xì)胞染色觀察（A：對(duì)照組 7 d；B：dMECM 組 7 d；C：對(duì)照組 14 d；D：dMECM 組 14 d）Figure 2 Live/dead cell staining of the meniscal fibrochondrocytes/growth surfaces constructs culturing in vitro 7 and 14 d （A：Control group in 7 d； B： dMECM group in 7 d； C： Control group in 14 d；D： dMECM group in 14 d）

圖3 GAG 含量的測(cè)定結(jié)果（*P ＜ 0.05）Figure 3 The cell GAG content examination results （*P ＜0.05）

圖4 膠原含量的測(cè)定結(jié)果（*P ＜ 0.05）Figure 4 The cell collagen content examination results （*P ＜0.05）

2.5 特異性基因表達(dá)變化的 RT-PCR 檢測(cè)

RT-PCR 檢測(cè)了 dMECM 組和對(duì)照組 I、II 型膠原 mRNA 表達(dá)水平相對(duì)于 P3代半月板細(xì)胞表達(dá)水平的變化結(jié)果。結(jié)果顯示在體外培養(yǎng) 7、14 d 后，dMECM 組和對(duì)照組 I 型膠原 mRNA的表達(dá)未見(jiàn)顯著性差異（圖 5）。體外培養(yǎng) 7、14 d后，dMECM 組 II 型膠原 mRNA 表達(dá)顯著上調(diào)（圖 6）。體外培養(yǎng) 7 d 時(shí)，dMECM 組 II 型膠原 mRNA 表達(dá)上調(diào)了 5.6 倍（P ＜ 0.05）。體外培養(yǎng) 14 d 時(shí)，dMECM 組 II 型膠原 mRNA 表達(dá)繼續(xù)上調(diào)，增加了 10.8 倍（P ＜ 0.05）。

圖5 I 型膠原 mRNA 表達(dá)變化的 RT-PCR 測(cè)定結(jié)果Figure 5 The type I collagen mRNA expression results

圖6 II 型膠原 mRNA 表達(dá)變化的 RT-PCR 測(cè)定結(jié)果（*P ＜ 0.05）Figure 6 The type II collagen mRNA expression results （*P ＜0.05）

3 討論

半月板內(nèi)側(cè)無(wú)血供區(qū)域再生困難，組織工程技術(shù)給內(nèi)側(cè)損傷的修復(fù)帶來(lái)了新的希望。為成功構(gòu)建組織工程半月板，選擇合適的支架材料至關(guān)重要。近年來(lái)采用脫細(xì)胞技術(shù)制備的 ECM 支架材料受到了廣泛的關(guān)注。ECM 材料相比于可吸收的多聚合成材料，具有更好的細(xì)胞相容性及生物活性特征。半月板纖維軟骨細(xì)胞是半月板組織工程領(lǐng)域中重要的種子細(xì)胞之一。但是和軟骨細(xì)胞類似，半月板纖維軟骨細(xì)胞在體外擴(kuò)增過(guò)程中增殖較慢，且容易出現(xiàn)去分化的現(xiàn)象［6-9］。

CCK-8 結(jié)果證實(shí)，與對(duì)照組相比較，dMECM組更能促進(jìn)細(xì)胞的增殖。我們考慮 dMECM 內(nèi)可能含有某些潛在的有利于細(xì)胞增殖的細(xì)胞因子或多肽物質(zhì)。另外，細(xì)胞活性檢測(cè)也發(fā)現(xiàn)，dMECM 修飾蓋玻片可以很好地維持細(xì)胞生長(zhǎng)的活性，無(wú)細(xì)胞毒性作用。GAG 的定量測(cè)定結(jié)果也證實(shí)在第 7、14 天時(shí)，dMECM 組比對(duì)照組可以分泌更多的GAG 成分，說(shuō)明 dMECM 可以很好地促進(jìn)半月板細(xì)胞的分化，進(jìn)而使細(xì)胞分泌更多的 GAG。

生長(zhǎng)在 dMECM 組的半月板細(xì)胞可見(jiàn) II 型膠原 mRNA 表達(dá)的上調(diào)，說(shuō)明半月板細(xì)胞在dMECM 修飾蓋玻片上發(fā)生了再分化，因?yàn)?II 型膠原是半月板 ECM 的重要組成成分，對(duì)維持半月板正常結(jié)構(gòu)起了巨大的作用，而且它還和骨關(guān)節(jié)的預(yù)防密切相關(guān)［10-12］。dMECM 組的半月板細(xì)胞 II型膠原 mRNA 表達(dá)的上調(diào)支持其相應(yīng)的 7、14 d膠原含量明顯增加的結(jié)果。

dMECM 對(duì)傳代半月板細(xì)胞有促增殖、維持其細(xì)胞活性及再分化的作用。不可否認(rèn)，這與dMECM 能夠很好的仿生天然半月板生長(zhǎng)的微環(huán)境密切相關(guān)。潛在的作用機(jī)制可能與細(xì)胞-基質(zhì)之間的相互作用有關(guān)，需要我們進(jìn)一步探索。總之，dMECM 具有促進(jìn)半月板細(xì)胞的增殖、分化以及細(xì)胞活性維持的潛能，是未來(lái)半月板組織工程領(lǐng)域理想的支架材料之一。

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Methods The novel dMECM biomaterial was prepared using waterproof pulverization and differential centrifugation approach. CCK-8 was used to quantitatively evaluate the cell proliferation of dMECM. The rabbit inner meniscus fibrochondrocytes （P3） were seeded in the dMECM modified growth surface in order to compare with the untreated growth surface （control group）. The cell activity was observed by live/dead staining after 7， 14 d culture， the GAG and collagen content werer determined according to kits，and RT-PCR analysis was used to evaluate mRNA expression level of collagens.

Results CCK-8 results demonstrated cells proliferation capacity in dMECM group was significantly more potent than that in the control group at 3， 6 d （P ＜ 0.05）. In comparison with the control group， the live/dead staining results confirmed dMECM surface maintained favorable cell activity. GAG and collagen content assessment results revealed that the fibrochondrocytes in the dMECM group secreted significantly more GAG and collagen than that in the control group at 7， 14 d （P ＜ 0.05）. RT-PCR results showed that the expression of type II collagen mRNA was significantly up-regulated than the dMECM group at 7， 14 d （P ＜ 0.05）.

Conclusion dMECM enhances the cellular proliferation， viability and redifferentiation of the rabbit passaged meniscal fibrochondrocytes， which shows that dMECM may be one of the ideal candidate biomaterial for meniscal tissue engineering applications in future.

The effect of decellularized meniscal extracellular matrix on meniscal fibrochondrocytes

GUO Wei-min， LIU Shu-yun， GAO Yue， HUANG Jing-xiang， PENG Jiang， WANG Ai-yuan， WANG Yu， LU Shi-bi， GUO Quan-yi

Objective We explore the effect of porcine decellularized meniscal extracellular matrix （dMECM） on the proliferation， cell activity and redifferentiation of the rabbit passaged meniscal fibrochondrocytes.

Extracellular matrix； Semilunar cartilages； Tissue engineering； Biocompatible materials； Decellularization；Fibrochondrocytes

GUO Quan-yi， Email： doctorguo@163.com

10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2015.03.005

國(guó)家自然科學(xué)基金（81472092）；國(guó)家高技術(shù)發(fā)展研究計(jì)劃（863 計(jì)劃）（2012AA020502）

100853 北京，解放軍總醫(yī)院骨科研究所

郭全義，Email：doctorguo@163.com

2015-03-12

www.cmbp.net.cn 中國(guó)醫(yī)藥生物技術(shù)， 2015， 10（3）：218-222

Author Affiliation： Institute of Orthopaedics， Chinese PLA General Hospital， Beijing 100853， China

www.cmbp.net.cn Chin Med Biotechnol， 2015， 10（3）：218-222