謝怡悅，石天晨，王璐瑩，徐曉偉，李陽輝，林克江

（中國藥科大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 南京 210009）

·前沿與進展·

抗腫瘤靶點PARP-1及其抑制劑的研究進展

謝怡悅，石天晨，王璐瑩，徐曉偉，李陽輝，林克江*

（中國藥科大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 南京 210009）

聚二磷酸腺苷核糖聚合酶-1（PARP-1）參與DNA損傷修復(fù)，是近年來腫瘤治療領(lǐng)域的熱門靶點。從PARP-1的結(jié)構(gòu)和作用機制出發(fā)，綜述PARP-1抑制劑的主要結(jié)構(gòu)類型及優(yōu)化思路，展望其應(yīng)用前景和亟需解決的問題。

PARP-1；抑制劑；腫瘤

在細(xì)胞的生長過程中，DNA不可避免地會受到外源或內(nèi)源因素的作用產(chǎn)生DNA損傷。因此，細(xì)胞必須建立多種DNA損傷發(fā)現(xiàn)和修復(fù)體系，使受損的DNA得到及時的修復(fù)，以維持細(xì)胞的正常生理功能。

2015年諾貝爾化學(xué)獎獲得者之一托馬斯·林達(dá)爾提出的“堿基切除修復(fù)（base excision repair， BER）”機制已成為共識。被稱為DNA修復(fù)酶的聚二磷酸腺苷核糖聚合酶 ［poly（ADP-ribose） polymerase， PARP］，密切參與DNA單鏈損傷的堿基切除修復(fù)，維持基因組穩(wěn)定，近年來已成為腫瘤治療領(lǐng)域的熱門靶點。

PARP存在于細(xì)胞核內(nèi)，是參與聚腺苷二磷酸核糖（poly（ADP-ribose）， PAR）合成的酶，即一種ADP-核糖通過核糖基化-核糖鍵相連的多聚體。該酶由Chambon等人于1963年首次報道［1］，但未引起重視。直至發(fā)現(xiàn)ADP-核糖基化參與蛋白的修飾才引起廣泛的關(guān)注。

PARP包括18種亞型，它們具有很高的同源性，結(jié)構(gòu)相似且能對許多核蛋白進行PAR修飾［2］。其中PARP-1在真核細(xì)胞內(nèi)含量最高，對其結(jié)構(gòu)和功能的研究也最為深入。

1 PARP-1的結(jié)構(gòu)

PARP-1蛋白由長度為1 014個氨基酸的單條肽鏈構(gòu)成（相對分子質(zhì)量為 113 084），可劃分為3個區(qū)域，分別為N端DNA結(jié)合域（DNA binding domain， DBD，2-372）、自身修飾域（automodification domain， AMD，373-524）和C端催化域（catalytic domain， CAT， 662-1 014）。DBD包含3個鋅指結(jié)構(gòu)域，其中ZnⅠ和ZnⅡ參與識別DNA損傷，ZnⅢ負(fù)責(zé)結(jié)構(gòu)域間的聯(lián)系，活化蛋白［3-4］；AMD包含自身修飾的主要位點，其中有BRCA1（breast cancer type 1）的C端結(jié)構(gòu)域 （385-476），參與結(jié)構(gòu)域間的聯(lián)系；CAT含有尼克酰二核苷酸（NAD+）的結(jié)合位點和合成PAR的催化位點，包括α螺旋結(jié)構(gòu)域（helical subdomain， HD， 662-779）和二磷酸腺苷核糖轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域（ADP-ribosyl transferase， ART， 788-1 014）（見圖1）。

圖1 PARP-1的結(jié)構(gòu)示意圖Figure 1 Schematic structure of PARP-1

2 PARP-1的功能及作用機制

2.1 參與DNA損傷修復(fù)

當(dāng)DNA損傷形成單鏈缺口（single strand break，SSB）時，PARP-1會直接參與BER過程。其作為感受器，DBD中的ZnⅠ和ZnⅡ結(jié)合到SSB上，進行DNA缺口的識別，并通過ZnⅢ活化形成同型二聚體?；罨蟮腜ARP-1催化NAD+降解為煙酸和ADP，再以ADP為底物在受體蛋白上合成PAR，調(diào)整其構(gòu)象、穩(wěn)定性和活性［5］。其中聚ADP核糖化的組蛋白和PARP-1自身帶有大量負(fù)電荷，一方面與DNA鏈排斥分離，使染色質(zhì)松弛，促進修復(fù)蛋白在DNA缺口處集結(jié)；另一方面又可招募并活化相關(guān)修復(fù)蛋白，如X線修復(fù)交叉互補組合-l（XRCC1）、DNA連接酶Ⅲ和DNA聚合酶β［2］。另外，PARP-1還可能與募集的蛋白中特異性PARP結(jié)合模序非共價結(jié)合，促進DNA損傷修復(fù)。

若SSB未及時修復(fù)，DNA會通過復(fù)制過程介導(dǎo)雙鏈DNA斷裂產(chǎn)生雙鏈DNA缺口（double strand break，DSB）。在其下行通路中，p53蛋白作為決定細(xì)胞進一步修復(fù)或走向凋亡的分子開關(guān)，可能通過Sirtuin蛋白1（sirtuin type 1， SIRT1）的去乙酰化作用調(diào)節(jié)PARP-1活性［6］。在活化狀態(tài)下，PARP-1可通過在蛋白上合成PAR來修飾ATM、MRE11等同源重組（homologous recombination， HR）修復(fù)蛋白，DNA-PKcs、Ku70/80等非同源末端連接（non-homologous end joining， NHEJ）修復(fù)蛋白和拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ［2］，促進HR修復(fù)和DNA-PK、Ku70/80、XRCC4、DNA連接酶等介導(dǎo)的NHEJ修復(fù)［5］，并控制細(xì)胞周期、維持基因組完整性；反之，在抑制狀態(tài)下，p53蛋白可激活細(xì)胞周期素依賴性激酶（cyclindependent kinase， CDK）和p21、Bcl-2等凋亡相關(guān)蛋白，分別促進細(xì)胞周期阻滯和Caspase依賴的細(xì)胞凋亡（見圖2）。

當(dāng)DNA損傷過于嚴(yán)重時，PARP-1過度活化，在自身聚ADP核糖基化的過程中，耗竭細(xì)胞能量（NAD+、ATP），使凋亡誘導(dǎo)因子（AIF）向核移動，介導(dǎo)非Caspase依賴的細(xì)胞凋亡［7］。另外，PARP-1還參與促進核苷酸切除修復(fù)（nucleotide excision repair， NER）［8］。

2.2 作為細(xì)胞凋亡信號

在Caspase依賴的細(xì)胞凋亡早期，被激活的半胱天冬酶將PARP-1切割出相對分子質(zhì)量分別為24 000和89 000的2個片段。這在許多類型的細(xì)胞中被認(rèn)為是細(xì)胞凋亡的信號［3］?？赡艿臋C制是：包含DBD的相對分子質(zhì)量為24 000的片段與DNA缺口結(jié)合，阻礙修復(fù)蛋白向染色體募集；包含AMD和CAT的相對分子質(zhì)量為89 000的片段無法被DNA損傷活化，阻礙DNA損傷信號傳遞，促進細(xì)胞凋亡［7］。

2.3 參與基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控

PARP-1在多條通路中通過對組蛋白進行PAR修飾，使染色質(zhì)松弛，促進基因轉(zhuǎn)錄；或通過與轉(zhuǎn)錄因子相互作用，調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄。如PARP-1可作為NF-κB的轉(zhuǎn)錄輔激活因子，激活NF-κB相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄［9］。

3 PARP-1抑制劑的作用機制

PARP-1抑制劑針對PARP-1參與SSB/DSB修復(fù)的功能，通過抑制PARP-1催化活性和將PARP-1捕獲于損傷的DNA上這2種機制發(fā)揮作用。一方面，PARP-1抑制劑通過與PARP-1的CAT競爭性結(jié)合，抑制其催化活性，使SSB得不到及時修復(fù)，產(chǎn)生DSB；另一方面，PARP-1抑制劑通過抑制PARP-1的自身PAR修飾、與CAT結(jié)合導(dǎo)致PARP-1變構(gòu)，增強PARP-1與損傷DNA的結(jié)合強度，將PARP-1“捕獲”于損傷DNA上（見圖3［10］），使細(xì)胞核中其他PARP-1難以與損傷DNA結(jié)合，進一步阻斷DSB的可能修復(fù)途徑，促進細(xì)胞凋亡。有研究表明，PARP-1抑制劑捕獲PARP-1的能力與其抑制腫瘤細(xì)胞的活性正相關(guān)［10-11］。

圖2 PARP-1參與SSB/DSB修復(fù)的作用機制Figure 2 Mechanism of PARP-1 in SSB/DSB repair

圖3 PARP-1抑制劑于損傷DNA上捕獲PARP-1的分子機制Figure 3 Molecular mechanism of PARP-1 inhibitors in trapping PARP-DNA complexes

近年來的研究發(fā)現(xiàn)，PARP-1抑制劑單藥對BRCA1/2突變的乳腺癌及卵巢癌細(xì)胞有明顯抑制作用［12-13］。根據(jù)圖2所示機制，若腫瘤細(xì)胞存在HR修復(fù)缺陷（如BRCA1/2突變），DSB將無法修復(fù)，即導(dǎo)致所謂的PARP-1抑制劑和HR修復(fù)缺陷對腫瘤細(xì)胞的合成致死作用。HR修復(fù)是個復(fù)雜的過程，許多基因和蛋白成分參與其中，包括ATM、ATR、CHK1、EMSY、PTEN、RAD51及其同系物如FANC蛋白、MRE11、RAD50、NBS1等，BRCA1/2只是其中的重要成分之一。HR修復(fù)途徑中的任一基因突變或表達(dá)沉默，即會引起HR修復(fù)途徑缺陷，PARP-1抑制劑即可能通過合成致死作用發(fā)揮抗腫瘤活性。

另外，PARP-1抑制劑還可作為放（化）療增敏劑發(fā)揮抗腫瘤作用。許多化療藥物（如烷化劑、鉑類、拓樸異構(gòu)酶Ⅰ/Ⅱ抑制劑等）和放療均通過直接或間接損傷DNA來發(fā)揮對腫瘤細(xì)胞的殺傷作用。由于PARP-1在DNA損傷修復(fù)中起關(guān)鍵作用，可將PARP-1抑制劑作為放（化）療增敏劑與放（化）療聯(lián)用，增強抗腫瘤療效［14］。同時，還可因此減少放（化）療用藥或放射劑量，降低毒副作用。

4 PARP-1抑制劑的主要結(jié)構(gòu)類型與優(yōu)化策略

上世紀(jì)70年代，PARP-1抑制劑的研究就已開始，主要針對腫瘤、卒中、心臟缺血、炎癥和糖尿病等疾病。目前研究的PARP-1抑制劑主要針對PARP-1的SSB修復(fù)功能，應(yīng)用于腫瘤治療，自2003年以來已有多個候選藥物進入臨床研究階段。許多公司在第1代PARP-1抑制劑（指各公司第1批啟動臨床前及臨床研究的PARP-1抑制劑）的基礎(chǔ)上，從選擇性、PARP-1捕獲能力、抗藥性等方面進行優(yōu)化，設(shè)計并合成了第2代PARP-1抑制劑（指各公司繼第1代抑制劑后新投入臨床前及臨床研究的PARP-1抑制劑），目前也有部分進入臨床研究［8］。

由于PARP-1的內(nèi)源性底物為NAD+，目前進入臨床的PARP-1抑制劑大多模擬NAD+中煙酰胺的結(jié)構(gòu)，與CAT中的煙酰胺結(jié)合位點（NI）或腺苷（AD）位點結(jié)合［8］，競爭性抑制PARP-1活性。雖然PARP-1抑制劑的結(jié)構(gòu)各異，可分為多類，但是它們的先導(dǎo)化合物種類有限，主要分為以下3類。

4.1 取代苯甲酰胺

上世紀(jì)70年代，研究發(fā)現(xiàn)煙酰胺（NA，1）有輕微的PARP抑制作用（IC50=210 μmol·L-1）（Clark J B等，Biochim Biophys Acta， 1971年），但也作用于細(xì)胞內(nèi)許多其他酶。于是人們以煙酰胺為先導(dǎo)化合物合成了一系列衍生物，包括苯甲酰胺（Shall S， Biochem J， 1975年）（2）及3-氨基苯甲酰胺（3-AB，3）、3-氨基苯甲酸（4）、3-氨基苯乙酮（5）、3-氨基-N-甲基苯甲酰胺（6）、2-氨基苯甲酰胺（7）、4-氨基苯甲酰胺（Purnell M R等，Biochem J， 1980年）（8）等，在50 μmol·L-1下對豬PARP的抑制率分別為96%、90%、10%、31%、0%、0%、0%，確證了芳酰胺基團和取代基位于酰胺間位對選擇性抑制PARP的必要性。因此，苯甲酰胺和間位取代苯甲酰胺被作為模板進行進一步優(yōu)化。

4.2 多環(huán)內(nèi)酰胺

上世紀(jì)90年代初，Parke-Davis公司的一個研究團隊以苯甲酰胺和間位取代苯甲酰胺為模板，通過比較5位和7位取代的二氫異喹啉酮活性來確定其優(yōu)化構(gòu)型，從而引入了二環(huán)內(nèi)酰胺結(jié)構(gòu)（Suto M J等，Anticancer Drug Des， 1991年）。實驗結(jié)果確證了引入環(huán)結(jié)構(gòu)來固定酰胺構(gòu)象及5位引入雜原子取代的必要性（見圖4）。隨后，Banasik和Ueda領(lǐng)導(dǎo)的團隊用牛PARP篩選了100多個二環(huán)及三環(huán)內(nèi)酰胺化合物（Banasik M等，J Biol Chem， 1992年），發(fā)現(xiàn)了一些多環(huán)內(nèi)酰胺骨架（9a～ 9d， 10a ～ 10c， 11 ～ 16， IC50分別為1.5、0.41、0.10、0.42、8.0、9.5、120、0.39、7、0.30、5.6、8.1、12 μmol·L-1），除骨架10外，二氫異喹啉酮（9）、異喹啉酮（11，12）、菲啶酮（13）、喹唑啉酮（14）、喹唑啉二酮（15）和2，3-雜氮萘酮（16）等日后均用于優(yōu)化。其中，2，3-雜氮萘酮是最重要的骨架，經(jīng)優(yōu)化合成了3個進入臨床研究的PARP-1抑制劑［15］。

圖4 二環(huán)內(nèi)酰胺結(jié)構(gòu)及優(yōu)勢取代位置的發(fā)現(xiàn)Figure 4 Discovery of bicyclic aryl amides and the optimal orientation of the amide with respect to substituents on the aryl ring

隨著上世紀(jì)90年代中期多環(huán)內(nèi)酰胺骨架的發(fā)現(xiàn)，PARP-1抑制劑的構(gòu)效關(guān)系初步建立。數(shù)年后，一些第1代PARP-1抑制劑與雞PARP-1的復(fù)合晶體結(jié)構(gòu)被測定（Ruf A等，Biochemistry， 1998年），PARP-1抑制劑的構(gòu)效關(guān)系得到進一步完善：1）與PARP-1催化活性位點上Ser904和Gly863結(jié)合的部位具備合適的氫鍵受體和供體（如酰胺中的羰基和N端活潑H），成環(huán)或“假環(huán)”可提高結(jié)合能力；2）具備可與PARP-1中Tyr896和 Tyr907形成π-π相互作用的富電子芳香環(huán)或雜環(huán)平面結(jié)構(gòu)，故芳酰胺更適宜；3）A環(huán)上酰胺間位有能與Glu988形成氫鍵的氫鍵供體和受體（如雜原子取代基）；4）A環(huán)上酰胺臨近位置處有Ala898和Lys903組成的小疏水口袋，可有小疏水基團取代（如 CH3、 F、 Cl等）；5）抑制劑分子右下部分應(yīng)設(shè)計大疏水基團，與PARP-1上NAD+結(jié)合部位的大疏水口袋（AD位點）結(jié)合，以提高抑制劑活性、水溶性和其他理化性質(zhì)（見圖5）。

圖5 PARP-1抑制劑的構(gòu)效關(guān)系Figure 5 SAR of PARP-1 inhibitors

4.3 苯并咪唑甲酰胺

上世紀(jì)90年代中期，Golding和Griffin領(lǐng)導(dǎo)的團隊設(shè)計并合成了苯并咪唑-4-甲酰胺（見圖6）這一由分子內(nèi)氫鍵構(gòu)成的“假環(huán)”結(jié)構(gòu)骨架，既保證了酰胺間位的雜原子取代基（圖6中金色部分），又限制了酰胺的構(gòu)象，如化合物17a和17b（IC50分別為1.1和0.1 μmol·L-1）（Griffin R J等， Anticancer Drug Des， 1995年）。這一重要骨架后經(jīng)優(yōu)化合成了3個PARP-1抑制劑且均已進入臨床研究。

圖6 苯并咪唑甲酰胺骨架Figure 6 Benzimidazole carboxamides as potent PARP inhibitor scaffolds

5 PARP-1抑制劑的研究現(xiàn)狀

現(xiàn)有的以上述骨架為先導(dǎo)化合物，根據(jù)已知構(gòu)效關(guān)系合成的許多第1代抑制劑在選擇性、耐藥性等方面存在問題，而第2代抑制劑開始研發(fā)時間不長，故目前尚無第2代PARP-1抑制劑成功上市。目前，處于臨床研究階段的具有抗腫瘤療效的PARP-1抑制劑及有望進入臨床的活性化合物舉例如下。

5.1 奧拉帕尼和第2代PARP抑制劑AZD2461

21世紀(jì)初，Maybridge和Kudos公司合作，在化合物16的4位引入芐基，得到苗頭化合物4-芐基-2，3-雜氮萘酮（18，IC50=770 nmol·L-1）［16］，不僅使活性增強了10倍，而且合成方便。為進一步提高抑制劑酶水平上的活性（IC50＜10 nmol·L-1）和細(xì)胞活性（如透膜性），提高水溶性和口服生物利用度，須對化合物18進一步優(yōu)化。在側(cè)鏈苯環(huán)3位引入丁二酰亞胺提高了酶水平上的活性和細(xì)胞活性［17］、增強了代謝穩(wěn)定性；4位氟取代顯著提高了化合物的透膜性（PF50=5.6），得到先導(dǎo)化合物19（KU58684，IC50=5 nmol·L-1）。再將3位的丁二酰亞胺替換成二酰基取代的哌嗪基團，使化合物的水溶性和口服生物利用度顯著提高，得到臨床候選藥物奧拉帕尼（olaparib，KU59436，AZD2281，20，IC50=5 nmol·L-1，PF50=25.8）。奧拉帕尼與甲基磺酸甲酯（MMS）、替莫唑胺（TMZ）聯(lián)用可抑制腫瘤組織的增殖，在BRCA缺陷的癌細(xì)胞系中單獨使用也有明顯活性［16］。2013年，阿斯利康（AstraZeneca）公司對奧拉帕尼展開了3項Ⅲ期臨床研究，分別研究其用于治療BRCA突變的轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者、BRCA突變的卵巢癌患者和鉑敏感復(fù)發(fā)性卵巢癌患者的療效。2014年5月，該公司以在鉑敏感復(fù)發(fā)性卵巢癌患者組中進行的隨機Ⅱ期臨床研究（19號研究）結(jié)果為主要依據(jù)，向美國FDA遞交了奧拉帕尼的新藥申請，并獲得優(yōu)先審評資格。但由于相關(guān)專家質(zhì)疑19號研究過程中招募BRCA基因突變患者的群體過小，所提供數(shù)據(jù)無法充分說明其藥效，且考慮到其潛在不良反應(yīng)，暫緩批準(zhǔn)奧拉帕尼的上市，要求公司提供進一步詳細(xì)說明數(shù)據(jù)。2014年12月19日，F(xiàn)DA通過加速審批通道批準(zhǔn)了奧拉帕尼膠囊（商品名：Lynparza）上市（EMA于2014年12月16日批準(zhǔn)），準(zhǔn)其作為單藥治療之前至少經(jīng)過3次化療的BRCA基因突變的晚期卵巢癌婦女，并伴隨批準(zhǔn)一款名為BRACAnalysis CDx的基因檢測試劑，用于檢測卵巢癌患者的血樣中是否存在BRCA基因突變。目前，奧拉帕尼聯(lián)合紫杉醇治療胃癌患者的臨床研究已進入Ⅲ期，針對前列腺癌和肺癌患者的臨床研究已進入Ⅱ期。阿斯利康公司仍在準(zhǔn)備公布卵巢癌Ⅲ期臨床研究的最新研究數(shù)據(jù)，以獲得FDA的完全批準(zhǔn)。

由于在臨床研究中觀察到患者對奧拉帕尼易產(chǎn)生抗藥性，阿斯利康公司推出了與其結(jié)構(gòu)相似的第2代抑制劑AZD2461（21）。該藥與奧拉帕尼性質(zhì)相似，但在抗藥性、耐受性方面有明顯改善，且可減少復(fù)發(fā)［18］。不過，2014年完成的Ⅰ期臨床研究宣告失敗。奧拉帕尼和AZD2461的優(yōu)化過程見圖7。

圖7 奧拉帕尼和AZD2461的優(yōu)化過程Figure 7 Evolution of olaparib and AZD2461

5.2 瑞卡帕尼

瑞卡帕尼是在苯并咪唑-4-甲酰胺（17c）的基礎(chǔ)上以共價鍵形成內(nèi)酰胺的結(jié)構(gòu)，屬于三環(huán)吲哚內(nèi)酰胺類，是首個進入臨床的PARP-1抑制劑。其優(yōu)化過程基于PARP-1與抑制劑的復(fù)合晶體結(jié)構(gòu)：先在2位引入芳環(huán)得到化合物22（NU1085，Ki=6 nmol·L-1），其與PARP-1中Tyr896和Tyr907形成π-π相互作用，體外活性顯著增強，但水溶性較差。為提高水溶性和結(jié)構(gòu)新穎性，在化合物22的芳環(huán)4位引入叔胺基團，并將酰胺基團用七元環(huán)固定成內(nèi)酰胺結(jié)構(gòu)，所得化合物23（AG014344，Ki=5.6 nmol·L-1，PF50=7.8）的水溶性、抑制活性和透膜性均有所提高［19］。在此基礎(chǔ)上進一步優(yōu)化得瑞卡帕尼（24，rucaparib，AG014699，PF-0137338，CO-338），酶水平上的活性（PARP-1，Ki=1.4 nmol·L-1）和細(xì)胞活性（PF50=8.1）均有所提高，其優(yōu)化過程見圖8。瑞卡帕尼與TMZ聯(lián)用有很好的抗腫瘤活性，與其他活性相近的先導(dǎo)化合物相比具有顯著優(yōu)越性，于2003年作為化療增敏劑率先進入臨床研究階段。但由于觀察到較嚴(yán)重的骨髓抑制作用，與TMZ聯(lián)用的Ⅲ期臨床研究仍未啟動。另外，瑞卡帕尼對PARP-1的選擇性較差［20］，甚至可作用于Akt /蛋白激酶B和Stat3等其他抗腫瘤靶點［21］。然而，分子分型技術(shù)的發(fā)展為瑞卡帕尼的研究提供了新的思路［22］。于2014年完成的一個Ⅱ期臨床研究找出了瑞卡帕尼響應(yīng)患者的生物標(biāo)記物。從中選擇幾個特定的分子分型進行Ⅲ期臨床研究，找出卵巢癌、輸卵管癌和原發(fā)性腹膜癌患者中對瑞卡帕尼產(chǎn)生響應(yīng)的特定基因型［23］。2015年4月，F(xiàn)DA授予瑞卡帕尼突破性治療藥物資格，使其可用于一些使用一線、二線藥物療法失敗的BRCA基因突變的卵巢癌患者。瑞卡帕尼是PARP抑制劑中首個獲此資格的藥物。同時，瑞卡帕尼與順鉑聯(lián)用治療BRCA突變的三陰性乳腺癌的研究正處于Ⅱ期臨床階段。

圖8 瑞卡帕尼的優(yōu)化過程Figure 8 Evolution of rucaparib

5.3 維利帕尼

維利帕尼也是在苯并咪唑-4-甲酰胺（17c）的基礎(chǔ)上優(yōu)化而來。2001年，雅培（Abbott）公司收購BASF公司，基于其研究基礎(chǔ)，合成了數(shù)百個2位烷基胺取代的化合物［24-25］，以對PARP-1和細(xì)胞（過氧化物損傷的C41細(xì)胞）的IC50低于10 nmol·L-1為條件進行篩選，選出臨床前候選藥物A-620223（25，Ki=8 nmol·L-1，EC50= 3 nmol·L-1）。其中叔胺基團保證了足夠的水溶性（大于5 g·L-1）、哌啶N上的烷基側(cè)鏈取代則顯著增強了細(xì)胞活性。在構(gòu)效關(guān)系研究過程中，雅培公司發(fā)現(xiàn)2位取代的碳原子若為季碳原子，則化合物的細(xì)胞活性將比叔碳原子取代的化合物高2～13倍［25］。于是，對A-620223進一步優(yōu)化，得到臨床候選藥物維利帕尼（26，veliparib，ABT-888，Ki=5 nmol·L-1，EC50=2 nmol·L-1），其優(yōu)化過程見圖9。雖然維利帕尼（R構(gòu)型）與其對映異構(gòu)體（S構(gòu)型）在酶水平上的活性相同（Ki=5 nmol·L-1），但由于R構(gòu)型在不同物種中的口服生物利用度好于S構(gòu)型（56%～92% vs 39% ～ 66%），故選用R構(gòu)型。其中側(cè)鏈二級胺的存在使維利帕尼能夠透過血腦屏障，可用于腦瘤的治療。由于可以顯著增強TMZ和卡鉑的抗腫瘤活性［25］，維利帕尼于2006年進入臨床試驗階段。目前，維利帕尼在與TMZ聯(lián)用治療腦瘤的臨床研究中采用Ⅰ+Ⅱ期聯(lián)合設(shè)計，與全腦放療聯(lián)用治療轉(zhuǎn)移性腦瘤已進入Ⅰ期臨床，與卡鉑聯(lián)用治療三陰性乳腺癌已進入Ⅲ期臨床研究。

圖9 維利帕尼的優(yōu)化過程Figure 9 Evolution of veliparib

5.4 尼拉帕尼

尼拉帕尼是由默克（Merck）公司研發(fā)的臨床候選PARP-1抑制劑（2012年后由Tesaro公司接手）。其優(yōu)化過程同樣以苯并咪唑-4-甲酰胺（17c）為起點，將咪唑環(huán)用多種五元氮雜環(huán)替換，分別測定在酶水平上的活性和細(xì)胞（過氧化物損傷的HeLa細(xì)胞）活性，最終選出藥動學(xué)性質(zhì)、在酶水平上的活性和細(xì)胞活性最佳的吲唑作為骨架［26］。其中，2位苯基取代的化合物27（IC50=24 nmol·L-1，EC50=3.7 μmol·L-1）活性較強，在大鼠和人微粒體內(nèi)顯示出較強的穩(wěn)定性，在大鼠體內(nèi)的口服生物利用度（41%）和半衰期（5.1 h）均較好，被選為先導(dǎo)化合物。為增強水溶性，在苯基對位引入仲胺基團，并以化合物在BRCA1敲除的HeLa細(xì)胞中的致半數(shù)細(xì)胞毒性的藥物濃度（CC50）和在野生型HeLa細(xì)胞中的CC50的比值為參數(shù)，篩選出具有最佳細(xì)胞活性和BRCA選擇性的化合物。臨床候選藥物尼拉帕尼（28，niraparib，MK-4827，IC50=3.8 nmol·L-1，EC50=4 nmol·L-1其優(yōu)化過程見圖10）在大鼠體內(nèi)的口服生物利用度極佳（65%）、半衰期較長（3.4 h），與其對映異構(gòu)體相比，BRCA選擇性更好（CC50比值28 vs 11）。且尼拉帕尼除競爭性抑制PARP-1的催化活性中心外，其在DNA上捕獲PARP-1的能力是臨床候選藥物中最強的［10］，與維利帕尼等藥物相比具有優(yōu)勢。2008年，尼拉帕尼進入臨床研究，在復(fù)發(fā)性種系BRCA突變的卵巢癌和散發(fā)性非BRCA缺失的卵巢癌中進行了Ⅰ期臨床研究，每日口服300 mg耐受性良好，主要不良反應(yīng)為1/2級的貧血、疲勞和惡心［27-28］。目前，Tesaro公司分別在HER2缺陷的非種系BRCA缺陷乳腺癌患者和鉑敏感的卵巢癌患者中開展尼拉帕尼單藥維持治療的Ⅲ期臨床研究。

圖10 尼拉帕尼的優(yōu)化過程Figure 10 Evolution of niraparib

5.5 BMN-673

BMN-673是較晚進入臨床的一種口服PARP-1抑制劑，其優(yōu)化過程非常有趣。最初，Lead公司融合2，3-雜氮萘酮（16）和苯并咪唑-4-甲酰胺（17c）2種骨架，設(shè)計出一新的骨架——吡咯并二氮雜萘酮（29，見圖11）。在設(shè)計合成路線時，以化合物30為起始原料，預(yù)想在堿性條件下第1步可得化合物31，加入肼后經(jīng)3步反應(yīng)即可得目標(biāo)產(chǎn)物。但實際合成過程中第1步卻得到化合物32，加入肼后得化合物33（見圖12）。實驗表明，此偶然發(fā)現(xiàn)的化合物33有很強的PARP-1抑制活性（IC50=6.1 nmol·L-1），于是Biomarin公司便以化合物33為先導(dǎo)化合物進行優(yōu)化（見圖13）。將一個取代苯環(huán)用咪唑環(huán)代替，得到新的先導(dǎo)化合物34（IC50=2.3 nmol·L-1，EC50=16.9 nmol·L-1），其酶水平上的活性和細(xì)胞（過氧化物損傷的LoVo細(xì)胞）活性均優(yōu)于化合物33，且由于咪唑環(huán)的引入，水溶性更好。但與TMZ聯(lián)用和單獨作用于BRCA2缺陷型細(xì)胞株（Capan-1細(xì)胞）時，化合物34的活性并不盡如人意（IC50分別為89 和2 μmol·L-1）。于是，對化合物34進一步優(yōu)化，在其結(jié)構(gòu)的圖示位置（金色圈出部分）增加2個氟原子和1個氮原子，得到臨床候選藥物BMN-673（35）。該化合物在酶水平上的活性（IC50=0.57 nmol·L-1）和細(xì)胞活性（EC50=2.51 nmol·L-1）與化合物34相比均有顯著提高，對Capan-1細(xì)胞也有很強的抑制活性（IC50=5 nmol·L-1），且各項抑制活性均明顯優(yōu)于其對映異構(gòu)體（36，BMN-674）。作為晚進入臨床的第1代PARP-1抑制劑，BMN-673在酶水平上的活性是其他臨床在研抑制劑的3 ～ 8倍，細(xì)胞活性可達(dá)20 ～ 200倍［11］。另外，它捕獲PARP-1的能力很強，細(xì)胞毒性卻并無顯著提高［10］，Ⅰ期臨床推薦劑量為每天口服1 mg，是其他PARP抑制劑的幾百分之一。它不僅可作為化療增敏劑與TMZ和鉑類藥物聯(lián)用，且可單藥抑制BRCA缺陷的乳腺癌和卵巢癌細(xì)胞［29］。目前，BMN-673用于BRCA缺陷的轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者的試驗正處于Ⅲ期臨床階段。

圖11 吡咯并二氮雜萘酮骨架的初步設(shè)計Figure 11 Preliminary design of pyrrolophthalazinones

圖12 先導(dǎo)化合物33的偶然發(fā)現(xiàn)Figure 12 Serendipity of compound 33

圖13 BMN-673的優(yōu)化過程Figure 13 Evolution of BMN-673

5.6 E7016和第2代PARP抑制劑E7449

2005年，Guilford/MGI的一個小組以2，3-雜氮萘酮（16）和四環(huán)異喹啉酮（37，GPI 6150，IC50=60 nmol·L-1）2種骨架為基礎(chǔ)［30］，設(shè)計出早期先導(dǎo)化合物38（GPI 15427，IC50=31 nmol·L-1），其苯環(huán)上的哌嗪取代改善了分子的水溶性和透膜性。將哌嗪基團替換成羥基哌啶，即得到臨床候選藥物E7016（39，GPI 21016，Ki=50 nmol·L-1），其優(yōu)化過程見圖14。在白血病鼠模型中，E7016與順鉑聯(lián)用顯示出顯著的化療增敏效果，聯(lián)用組（E7016，40 mg·kg-1，ip）較順鉑組的鼠平均壽命延長了160%。在惡性膠質(zhì)瘤異種移植模型中，E7016與TMZ合并放療聯(lián)用，顯示出放（化）療增敏活性。聯(lián)用組（E7016，40 mg·kg-1，po，X射線4 J·kg-1，TMZ 3 mg·kg-1）與TMZ合并放療的對照組相比，平均壽命延長了32%。Ⅱ期臨床研究于2012年展開，研究E7016與TMZ聯(lián)用治療黑色素瘤的療效。另外，第2代PARP抑制劑E7449（結(jié)構(gòu)未公開）的Ⅰ期臨床研究也已展開。

圖14 E7016的優(yōu)化過程Figure 14 Evolution of E7016

5.7 1位長鏈取代的苯并［1，7］八氫萘啶類化合物

2013年3月，Ye等［31］在對抗帕金森病藥阿撲嗎啡（40）的兒茶酚部分進行電子等排優(yōu)化的過程中，偶然發(fā)現(xiàn)將兒茶酚替換成內(nèi)酰胺后得到的化合物完全失去了多巴胺受體的激動活性。結(jié)合Torrisi等的報道，Ye等設(shè)計并合成了3個系列的1位長鏈取代的苯并［1，7］八氫萘啶類化合物（見圖15），長鏈分為連接基團和末端效應(yīng)基團兩部分。第2系列以苯甲?；鶠檫B接基團，其中使用2，3-雜氮萘酮作為末端效應(yīng)基團的化合物41，表現(xiàn)出極強的PARP-1抑制活性（IC50=0.31 nmol·L-1），但在細(xì)胞內(nèi)效力溫和（BRCA2缺陷型細(xì)胞：CC50=96.0 nmol·L-1；BRCA1缺陷型細(xì)胞：CC50=23.3 nmol·L-1）。以該化合物為先導(dǎo)進行優(yōu)化，得到化合物42（IC50=3.46 nmol·L-1，其優(yōu)化過程見圖16），其不但對PARP-1酶有效，而且在BRCA缺陷型細(xì)胞中有很好的效力（BRCA2缺陷型細(xì)胞：CC50=4.53 nmol·L-1；BRCA1缺陷型細(xì)胞：CC50=0.26 nmol·L-1）。

這一新型PARP-1抑制劑損傷了BRCA缺陷型細(xì)胞中的細(xì)胞周期進程，同時增強了TMZ等烷化劑類抗腫瘤藥物的細(xì)胞毒性，具有成為臨床候選藥物的光明前景。

5.8 NMS-P118

2015年8月，Papeo等［32］報道了一種高選擇性、可口服的PARP-1抑制劑NMS-P118。由于目前的臨床候選PARP-1抑制劑多為PARP-1/2非選擇型，意大利納維亞諾醫(yī)學(xué)研究院（NMS）在其化合物庫中進行了高通量篩選，以發(fā)現(xiàn)高選擇性的新型PARP-1抑制劑。研究人員將高通量篩選得到的化合物43進行優(yōu)化，以酶水平上的活性（PARP-1 KD ≤0.1 μmol·L-1）和選擇性（PARP-2 KD / PARP-1 KD約為100）為條件進行篩選，得先導(dǎo)化合物44（PARP-1 KD = 0.050 μmol·L-1，PARP-2 KD/PARP-1 KD ＞200）。為提高PARP-1酶活性，對化合物44進一步優(yōu)化得NMS-P118（45，PARP-1 KD = 8 nmol·L-1，PARP-2 KD/PARP-1 KD ＞ 83），其優(yōu)化過程見圖17。

圖15 1位長鏈取代的苯并［1，7］八氫萘啶類化合物Figure 15 Benzo［de］［1，7］naphthyridin-7（8H）-ones bearing a functionalized long chain appendage

圖16 以阿撲嗎啡為起點的新型化合物優(yōu)化過程Figure 16 Evolution of the novel PARP-1 inhibitor from apomorphine

圖17 NMS-P118的優(yōu)化過程Figure 17 Evolution of NMS-P118

在臨床前實驗中，NMS-P118顯示出很好的PARP-1選擇性和較好的藥動學(xué)性質(zhì)，在小鼠和大鼠體內(nèi)的口服生物利用度都很高，在BRCA1突變的MDA-MB-436細(xì)胞和BRCA2突變的Capan-1細(xì)胞中均顯示出高單藥活性和TMZ聯(lián)用活性。作為第1個PARP-1特異性抑制劑，NMS-P118具有很強的臨床開發(fā)潛力。

6 展望

隨著分子醫(yī)學(xué)的發(fā)展，腫瘤治療已進入個體化治療時代，PARP-1 抑制劑的顯著抗腫瘤活性使其有著廣闊的潛在應(yīng)用研究空間。但同時大量實驗證明，目前的大部分PARP-1抑制劑對PARP-1缺乏一定的特異性，且非所有BRCA突變的腫瘤細(xì)胞都對PARP-1抑制劑敏感［33］，即易產(chǎn)生耐藥性。耐藥性產(chǎn)生機制可能有3種：1）BRCA功能的修復(fù)［34］；2）Mdr1基因過度表達(dá)造成的P-糖蛋白對PARP抑制劑的消除（如奧拉帕尼即為P-糖蛋白的典型消除底物）；3）HR功能的修復(fù)［18］。同時，PARP-1抑制劑對腫瘤具有選擇性，對非BRCA突變腫瘤細(xì)胞的敏感缺乏特異性，導(dǎo)致目前進入臨床的PARP-1抑制劑均未在試驗中顯示出可靠的化療增敏效果，所有的Ⅲ期臨床研究均以DNA修復(fù)缺陷的患者為對象。另外，由于其抑制了細(xì)胞中的DNA損傷修復(fù)，可能使正常細(xì)胞更易發(fā)生癌變，具有不可忽視的細(xì)胞毒性。就目前的臨床候選藥物來看，較晚進入臨床的尼拉帕尼和BMN-673等具有較強的PARP-1捕獲能力，與早期進入臨床的化合物相比具有一定優(yōu)勢。因此，未來對PARP-1抑制劑的研究，應(yīng)著力增強其特異性、改善細(xì)胞對其耐藥性，重點挖掘其單藥治療DNA修復(fù)缺陷患者的潛力。同時，需要對PARP-1 抑制劑的作用特點和機制進行更深入的探索，對PARP-1參與DNA損傷修復(fù)的信號通路進行更全面的研究，以設(shè)計出更多新的PARP-1抑制劑，拓展其在腫瘤治療中的應(yīng)用。

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Progress in Research of Inhibitors Targeting PARP-1 for Cancer Therapy

XIE Yiyue， SHI Tianchen， WANG Luying， XU Xiaowei， LI Yanghui， LIN Kejiang
（School of Pharmacy， China Pharmaceutical University， Nanjing 210009，China）

Poly（ADP-ribose） polymerase-1（PARP-1） plays an important role in repairing DNA damage and represents a currently important target in cancer therapy. Based on the structure and mechanism of PARP-1， the major structure types of PARP-1 inhibitors and optimization strategies were reviewed， along with an outlook on their future applications and urgent problems to be solved.

PARP-1； inhibitor； cancer

R918

A

1001-5094（2015）10-0761-14

接受日期：2015-10-08

項目資助：國家自然科學(xué)基金（No.81573348）

*通訊作者：林克江，副教授；

研究方向：新藥設(shè)計與研發(fā)；

Tel：025-83271455；E-mail：link@cpu.edu.cn