席素雅 劉建強(qiáng) 陳樹珍 張玲 王少穎

（1.河北省胸科醫(yī)院呼吸科；2.河北省老年病醫(yī)院，河北 石家莊 050000）

支氣管哮喘（哮喘）是一種以氣道阻塞、氣道炎癥和氣道高反應(yīng)為特征的炎癥性疾病，呈家族聚集性，其發(fā)病涉及了遺傳、環(huán)境、免疫、神經(jīng)等因素［1］。多項(xiàng)研究［2－3］表明，白細(xì)胞介素13（IL－13）基因多態(tài)性與哮喘的發(fā)病密切相關(guān)。本研究以河北地區(qū)漢族人群為研究對(duì)象，采用聚合酶鏈反應(yīng)－限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（PCR－RFLP）方法，分析該地區(qū)正常人群和哮喘患者IL－13基因＋2044G／A 的基因型和等位基因頻率分布情況，以探討該基因多態(tài)性與河北地區(qū)漢族人群哮喘的相關(guān)性，為哮喘患者的早期預(yù)防、早期治療提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 哮喘組：選擇2011年7月至2013年7月河北省胸科醫(yī)院收治的哮喘患者100例，均符合中華醫(yī)學(xué)會(huì)呼吸病學(xué)分會(huì)哮喘學(xué)組2013年制定的《支氣管哮喘防治指南》標(biāo)準(zhǔn)［4］，其中男48例，女52例，年齡20～65歲。對(duì)照組：同期選擇我院體檢中心健康體檢者100例，男50例，女50例，年齡18～66歲，該組人群均無(wú)哮喘病史。兩組人群年齡、性別差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。研究對(duì)象均為無(wú)血緣關(guān)系的我國(guó)北方漢族人，除外罹患嚴(yán)重全身感染、腫瘤、心臟病及肝、腎疾病等系統(tǒng)性疾病。全部入選對(duì)象均提前征得患者同意并填寫知情同意書。

1.2 方法（1）基因組DNA 提?。喝⊥庵苎?mL，加入含1.5mg／mL乙二胺四乙酸二鈉（EDTA－Na2）的抗凝管中，搖勻，常規(guī)酚－氯仿法抽提基因組DNA，－20 ℃冰箱儲(chǔ)存?zhèn)溆?。PCR－RFLP檢測(cè)基因型：聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增基因組DNA。參照文獻(xiàn)［5］，IL－13基因＋2044G／A 位點(diǎn)引物序列如下：上游：5′－CTTCCGTGAGGACTGAATGAGACGGTC－3′，下 游：5′－GCAAATAATGATGCTTTCGAAGTTTCAGTGGA－3′。25μL PCR反應(yīng)體系中含：10×緩沖液2.5μL；4×脫氧三組磷組酸組核組苷（dNTP，10 mmol／L）2.0μL；MgCl2（25mmol／L）2.5組μL，10組μmol／L組引組物組各1.0μL，模板DNA（10μmol／L）3.0μL；rTaq DNA聚合酶（5U／L）0.25μL，去離子水加至25μL。擴(kuò)增反應(yīng)在熱循環(huán)儀上完成。循環(huán)參數(shù)為：95 ℃預(yù)變性10min；94℃變性30s，56 ℃退火30s，72 ℃延伸1min，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃最后延伸5min。PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶Pst I于37 ℃水浴消化8h，再在3%瓊脂糖凝膠上加溴化乙錠（終濃度為0.7μg／mL），取8μL酶切產(chǎn)物在凝膠上上樣電泳，紫外線燈照射下觀察拍照。（2）測(cè)序：PCR 產(chǎn)物純化并送上海生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件。研究資料的可靠性通過(guò)Hardy－Weinberg平衡檢驗(yàn)檢測(cè)，基因型和等位基因頻率通過(guò)基因計(jì)數(shù)法計(jì)算。單個(gè)基因型及組間等位基因頻率比較采用χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 IL－13基因型分析 IL－13基因＋2044G／A 多態(tài)性位點(diǎn)PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物大小為236bp，其上游引物設(shè)計(jì)的錯(cuò)配堿基G 使該位點(diǎn)擴(kuò)增產(chǎn)物均存在一個(gè)NIaIV 酶切位點(diǎn)，均會(huì)被切下一26bp產(chǎn)物。經(jīng)酶切后，電泳結(jié)果可見3種基因型：GG 型（含酶切位點(diǎn)的純合子，酶切產(chǎn)物為178bp、32bp及26bp）；AA 型（不含酶切位點(diǎn)的純合子，酶切產(chǎn)物為210bp和26bp）；GA 雜合子型（雜合子，酶切產(chǎn)物為210bp、178bp、32bp和26bp）。酶切結(jié)果見圖1，由于32bp和26bp分子量較小，電泳時(shí)均已出膠。隨機(jī)選取3 種基因型樣本的PCR 產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，其結(jié)果與PCR－RFLP結(jié)果完全一致。

圖1 IL－13基因＋2044G／A 多態(tài)性PCR 產(chǎn)物NIaIV 酶切電泳結(jié)果

2.2 兩組IL－13基因＋2044G／A 基因型和等位基因分布頻率比較（1）經(jīng)Hardy－Weinberg 平衡檢驗(yàn)，兩組基因型符合遺傳平衡，具有群體代表性。見表1。（2）IL－13＋2044G／A 位點(diǎn)基因多態(tài)性分布特點(diǎn)：IL－13基因＋2044G／A組多態(tài)性有3組種基因型，GG組型、AA組型、GA組型，兩組組人組群組中組均組以GG組型組為主，GA 型次之，AA 型最少。分析顯示：哮喘組IL－13＋2044G／A 位點(diǎn)基因型分布與正常對(duì)照組有差異（χ2=7.71，P＜0.05）。A 等位基因攜帶者（GA＋AA 基因型）在哮喘組（49例，49.0%）明顯高于對(duì)照組（30例，30.0%）（χ2=7.55，P＜0.01），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表2。

表1 IL－13基因＋2044G／A 位點(diǎn)基因型分布的Hardy－Weinberg平衡檢驗(yàn)（%）

表2 IL－13基因外顯子＋2044G／A 多態(tài)性基因型和等位基因頻率分布比較［n（%）］

3 討論

支氣管哮喘是由免疫球蛋白E（IgE）介導(dǎo)的Ⅰ型變態(tài)反應(yīng)性疾病，其發(fā)生過(guò)程中有多種細(xì)胞因子參與。IL－13是一種主要由活化的CD4＋Th2細(xì)胞分泌的多效能細(xì)胞因子，具有多種生物學(xué)功能，通過(guò)提高B細(xì)胞的活性、刺激B 細(xì)胞的增殖和誘導(dǎo)IgE的合成，從而導(dǎo)致氣道反應(yīng)性增高以及小氣道結(jié)構(gòu)重建，參與哮喘炎癥的發(fā)生與維持［6］。

人IL－13（hIL－13）基因序列長(zhǎng)度為4.6kb，含有4個(gè)外顯子和3 個(gè)內(nèi)含子。編碼hIL－13的基因定位于5q31，分子量約12KD，是由132個(gè)氨基酸組成的非糖基化蛋白。近年國(guó)內(nèi)外多項(xiàng)研究［7－11］及Meta分組析［12－14］顯組示，IL－13基組因A2044G組單核組苷組酸多態(tài)性與哮喘發(fā)病密切相關(guān)，是哮喘發(fā)病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。文獻(xiàn)［7－11］研究發(fā)現(xiàn)，＋2044G／AA 等位基因與哮喘的發(fā)病密切相關(guān)。而華麗等［15］研究發(fā)現(xiàn)，G 等位基因可能是哮喘的易感基因。

本研究以河北地區(qū)漢族人群為研究對(duì)象，分析了100例哮喘患者和100例健康人群的IL－13 ＋2044G／A 基因型和等位基因分布頻率。結(jié)果顯示，中國(guó)北方漢族人群IL－13 基因＋2044G／A 位點(diǎn)存在G→A 突變，且該基因型已達(dá)到遺傳平衡，具有群體代表性。哮喘組AA 型和A 等位基因頻率明顯高于對(duì)照組，A 等位基因頻率在哮喘組（29.5%）明顯高于對(duì)照組（17.5%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明A等位基因可能是河北地區(qū)哮喘發(fā)病的易感基因。

研究發(fā)現(xiàn)，IL－13基因第4外顯子的2044位堿基存在G→A 突變，從而導(dǎo)致編碼的相應(yīng)蛋白質(zhì)的多態(tài)鏈第130位氨基酸由精氨酸（Arg）轉(zhuǎn)變?yōu)楣劝滨０罚℅ln），Gln 可能促進(jìn)受體與IL－13 結(jié)合，由于空間結(jié)構(gòu)的改變使IL－13 信號(hào)傳導(dǎo)途徑JAKSTAT6異常，從而影響IL－13的生物學(xué)活性。因此在堿基改變的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上，進(jìn)一步從蛋白功能角度研究這一改變對(duì)IL－13 轉(zhuǎn)錄及表達(dá)的影響，將對(duì)哮喘疾病的診斷和治療有重要意義。

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