楊君 楊龍 鄭亞西 牛晨光 田龍海 夏桂玲 田水 張羽坤 唐倩

（1.貴陽醫(yī)學院，貴州 貴陽 550004；2.貴州省人民醫(yī)院心內科，貴州 貴陽 550002；3.河南大學第一附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450000；4.貴州航天醫(yī)院心內科，貴州 遵義 563003；5.貴州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院，貴州 貴陽 550004）

心力衰竭（心衰）發(fā)病率及死亡率目前仍居高不下，是心源性死亡的主要病因之一，心衰時，受損心肌通過改變心肌收縮力、導致心肌肥大及電生理的重構起到代償作用［1－2］。心肌肥大是心臟長期承受過重負荷，靠質量增加、收縮力加強產生的一種緩慢而有效的代償方式［3］。這種代償在維持充足心搏量的同時會增加耗氧量，導致組織結構重構、細胞膜電位改變等，從而導致和促進心力衰竭，誘導心律失常［4］。肥大心肌細胞會引起大量第二信使相關通路的激活，其中血管緊張素Ⅱ1型受體（AT1R）信號的激活與心肌肥大之間存在密切相互作用［5］。腎素－血管緊張素－醛固酮系統(tǒng)（RAS）激活增強血管收縮、促進機體水鈉潴留，使回心血量和有效血容量增加；心臟前、后負荷的顯著增加進一步惡化心力衰竭。因此，血管緊張素轉換酶抑制劑（ACEI）或AT1R 拮抗劑（ARB）能在有效降低血壓的同時起到保護心肌肥大的作用［6］。研究［7］表明，AT1R 拮 抗劑氯沙坦不僅可降低收縮壓，并且阻止心肌肥大。因而本研究擬通過靜態(tài)牽張刺激體外培養(yǎng)的心室肌細胞，用血管緊張素受體阻斷劑氯沙坦干預，探討氯沙坦在靜態(tài)牽張刺激導致的心室肌細胞L－型鈣離子通道改變中的作用［8］。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 胎牛血清（FBS）和DMEM 高糖培養(yǎng)基由Gbico 公司生產，胰酶和Ⅱ型膠原酶購自Sigma公司，免疫組化試劑盒購自碧云天公司，蛋白－DNA－mRNA 共提取試劑盒購自Omega生物技術公組司，Cav1.2組抗組體組購組自Abcam組公組司，SYBR Premix Ex Taq購自Takara公司，α－橫紋肌動蛋白（α－SCA）單克隆抗體購自博士德生物工程有限公司，其他試劑均為國產分析純以上級別。

1.2 心室肌細胞培養(yǎng)與鑒定 出生1d的清潔級SD 大鼠用乙醚氣霧麻醉。取近心尖中下2／3的心室組織，洗去血液，剪至約1mm×1mm 的組織塊。用含0.05%胰酶和80mol／LⅡ型膠原酶的消化液消化，結合差速貼壁法獲得心室肌細胞，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中，用含10%FBS的DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)。通過細胞形態(tài)和α－SCA 陽性染色情況鑒定心室肌細胞。

1.3 實驗分組與處理 細胞于靜態(tài)牽張裝置硅膠模上貼壁培養(yǎng)24h，更換含5%FBS的DMEM 培養(yǎng)基，分為4組。（1）對照組：不予干預；（2）牽張組：較基礎培養(yǎng)狀態(tài)增加20%硅膠模面積；（3）氯沙坦組：在培養(yǎng)液中加入氯沙坦10μmol／L；（4）靜態(tài)牽張＋氯沙坦組：在培養(yǎng)液中加入氯沙坦10μmol／L 干預2h后，增加20%硅膠膜面積。各組細胞分組培養(yǎng)后進行檢測。

1.4 牽張有效性鑒定 按試劑盒說明檢測細胞培養(yǎng)上清中BNP 水平；測定細胞DNA 和蛋白含量，計算蛋白／DNA 比值。結晶紫染色細胞并用軟件統(tǒng)計細胞面積大小。

1.5 基因mRNA 水平的檢測 采用Oligo 6.0軟件設計引物（序列見表1）。Trizol法提取細胞總mRNA，按SYBR Premix Ex Taq試劑盒說明檢測基因mRNA 相對表達量。

表1 Cav1.2和GAPDH RT－PCR引物序列

1.6 蛋白質印跡法 提取細胞總蛋白，測定蛋白濃度。取50μg總蛋白上樣，電泳后轉移蛋白至硝酸纖維素膜上，5%脫脂牛奶封閉1h，加入相應一抗4 ℃孵育過夜。充分漂洗后加入辣根過氧化酶標記的二抗室溫孵育1h。充分漂洗后顯影、攝片并進行條帶灰度定量測定。

1.7 統(tǒng)計學處理 實驗數(shù)據(jù)采用Epidata 3.1軟件建立數(shù)據(jù)庫，使用SPSS 19.0進行數(shù)據(jù)分析。計數(shù)資料以（±s）表示。組間總體差異性比較用方差分析，多處理組與對照組比較用t檢驗，未計劃兩組間比較用q檢驗。檢驗水準α=0.05，如無特殊說明，P值表示雙側概率，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 心室肌細胞培養(yǎng)與鑒定 倒置顯微鏡下可見心室肌細胞呈長梭形。心室肌細胞免疫組化染色呈陽性反應，胞漿內清晰可見棕褐色顆粒物，成纖維細胞呈現(xiàn)陰性，可見大量細胞核。見圖1。

圖1 心室肌細胞、成纖維細胞α－SCA 抗體免疫組化染色（×200）

2.2 牽張有效性 心室肌細胞受靜態(tài)牽張后結果顯示刺激24h的細胞蛋白／DNA 比值明顯增加（P＜0.001，n=3），而Losar干預可有效抑制此效應（P＜0.001，n=3，圖2）。靜態(tài)牽張心肌細胞使得其ANP基因表達（P＜0.01，n=3，圖3）均明顯增加。

圖2 4組心室肌細胞蛋白／DNA 比值（＊P＜0.001）

圖3 對照組與牽張組ANP基因表達比（＊P＜0.01）

2.3 L－型鈣離子通道基因表達情況 RT－PCR 技術加熒光定量法檢測樣本中初始目標mRNA 含量，結果顯示靜態(tài)牽張刺激顯著下調心室肌細胞Cav 1.2的mRNA 表達（P＜0.01，n=3）；Losar可有效抑制該效應（P＜0.05，n=3，圖4）。

圖4 牽張刺激心室肌細胞降低Cav1.2的

2.4 L－型鈣離子通道蛋白表達情況 WB 技術檢測蛋白表達，結果顯示靜態(tài)牽張刺激顯著下調心室肌細胞Cav1.2的蛋白表達（P＜0.01，n=3）；Losar可有效抑制該效應（P＜0.05，n=3，圖5，6）。

圖5 Cav1.2蛋白表達半定量分析結果（＊P＜0.05；＊＊P＜0.01）

圖6 免疫印跡檢測Cav1.2蛋白表達

3 討論

3.1 靜態(tài)牽張刺激致肥大心室肌細胞模型評價本實驗采用體外培養(yǎng)原代心室肌細胞，結合靜態(tài)牽張模仿過負荷導致的心室肌肥大，有效避免體內神經－體液因素的影響。若排除了機體復雜因素的干擾，即可較為單一的研究目標通路。試驗中牽張組心室肌細胞蛋白／DNA 比值、ANP基因表達和細胞面積明顯高于對照組，證明靜態(tài)牽張刺激導致心室肌細胞肥大模型建立成功，可用于后續(xù)實驗。

3.2 肥大心室肌細胞L－型鈣離子通道Cav1.2mRNA 和蛋白表達情況及AT1R信號調控作用 心力衰竭時部分離子通道表達發(fā)生改變，證明心衰是心律失常發(fā)生的重要獨立因素。有研究［9－10］指出心衰時心房細胞ICa－L降低，基因表達水平降低，但較少涉及蛋白水平及AT1R 信號調控。本研究發(fā)現(xiàn)與正常組比較，靜態(tài)牽張組心室肌細胞Cav1.2基因及蛋白表達均明顯受到抑制，這種現(xiàn)象能被AT1R阻滯劑Losar所抑制。證明牽張刺激可能通過激活AT1R信號通路導致心室肌細胞肥大，同時還通過該通路下調Cav1.2的表達。Losar可抑制牽張刺激所致的心室肌細胞肥大，這也提示了RAS參與心室肌細胞的重構過程。心衰導致RAS系統(tǒng)激活，可使心律加快進而鈣離子內流增加，超載的鈣離子可以反饋抑制L－型鈣離子通道［11］。進一步影響細胞內外鈣、鉀分布，心肌細胞電位不穩(wěn)定，誘發(fā)心律失常。

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