郭宏雄，還錫萍，周 瑩，盧 靜，胡海洋，傅更鋒

（江蘇省疾病預(yù)防控制中心性病艾滋病防制所，江蘇南京210009）

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測(cè)HIV-1 DNA

郭宏雄，還錫萍，周 瑩，盧 靜，胡海洋，傅更鋒

（江蘇省疾病預(yù)防控制中心性病艾滋病防制所，江蘇南京210009）

目的：建立環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（1oop-mediated isotherma1 amp1ification，LAMP）方法檢測(cè)HIV-1 DNA。方法：首先從HIV-1數(shù)據(jù)庫和基因庫中下載不同亞型的HIV-1的LTR區(qū)序列，輸入到MEGA 6.0軟件中，用C1uster W程序進(jìn)行比對(duì)與編輯，選擇相對(duì)保守的區(qū)域并以FASTA格式輸出。將FASTA格式文件上傳至在線引物設(shè)計(jì)軟件Lamp primer designing software primer exp1orer中，獲得引物后再次與比對(duì)后的HIV序列進(jìn)行比較，對(duì)保守性較差的位點(diǎn)使用簡并堿基。用LAMP擴(kuò)增試劑盒擴(kuò)增時(shí)加入熒光目測(cè)試劑，觀察反應(yīng)管顏色變化，判斷陰陽性結(jié)果。結(jié)果：本研究中設(shè)計(jì)的引物可用于LAMP技術(shù)檢測(cè)HIV-1 DNA，具有較好的靈敏度和特異性。結(jié)論：成功地建立了LAMP技術(shù)檢測(cè)HIV-1 DNA的方法，可用于HIV-1的早期診斷。

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增；人類免疫缺陷病毒Ⅰ型；核酸檢測(cè)

人類免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）自1981年發(fā)現(xiàn)以來，已造成近8 000萬人感染，3 300萬人死亡。目前檢測(cè)HIV的主要方法是用酶聯(lián)免疫分析法（ELISA）進(jìn)行初篩，用蛋白質(zhì)印跡進(jìn)行確認(rèn)［1-2］。這兩種方法都是檢測(cè)感染者體內(nèi)病毒蛋白的抗體。從病毒感染到抗體產(chǎn)生需要一段時(shí)間，即檢測(cè)的窗口期。一般情況下，目前的HIV-1第3代檢測(cè)試劑的窗口期平均26 d左右［3］。第4代檢測(cè)試劑與第3代檢測(cè)試劑的不同在于加入P24抗原的檢測(cè)。但是由于P24抗原在體內(nèi)存在的時(shí)間短，并且比第3代試劑檢測(cè)煩瑣，因此在臨床檢測(cè)中目前還是普遍使用第3代檢測(cè)試劑［4-6］。在HIV-1感染的窗口期，由于機(jī)體產(chǎn)生的抗體滴度太低且抗體的產(chǎn)生過程中需要一個(gè)成熟時(shí)間，因此ELISA方法并不能檢測(cè)到抗體。在艾滋病晚期，患者免疫功能缺陷或低下，機(jī)體不能夠產(chǎn)生足夠的抗體。因此用ELISA檢測(cè)這個(gè)階段的艾滋患者往往出假陰性［7-8］。

核酸檢測(cè)能夠檢測(cè)血液、體液及組織中的HIV。目前商品化的HIV核酸診斷試劑分為兩類，一類用于血漿HIV-1的定量檢測(cè)，一類用于血漿HIV-1的定性檢測(cè)。前者主要用于評(píng)估抗病毒治療的效果，后者主要用于血液中心采血時(shí)對(duì)處于抗體檢測(cè)窗口期的感染者進(jìn)行篩查。無論是定量還是定性試劑，除羅氏（ROCHE）公司開發(fā)的HIV-1 DNA試劑外，目前市場上銷售的HIV核酸檢測(cè)試劑均未用于HIV-1感染的臨床診斷。盡管如此，由于羅氏公司開發(fā)的HIV-1 DNA診斷試劑價(jià)格太高，并需要昂貴的儀器，因此國內(nèi)HIV核酸檢測(cè)中很少使用［9］。

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（1oop-mediated isotherma1 amp1ification，LAMP）方法可以在恒溫下1 h內(nèi)將核酸擴(kuò)增到109拷貝，操作簡單、特異性強(qiáng)、反應(yīng)結(jié)果可肉眼觀察，因此具有在現(xiàn)場進(jìn)行檢驗(yàn)的潛力［10-14］。為了能夠在一般實(shí)驗(yàn)室開展HIV-1核酸檢測(cè)，我們擬建立檢測(cè)HIV-1 DNA的LAMP技術(shù)方法。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器

環(huán)介導(dǎo)的等溫?cái)U(kuò)增試劑盒和熒光目視檢測(cè)試劑盒均購自榮研生物科技有限公司（北京）。DNA提取試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒（QIAGEN公司，德國）。反轉(zhuǎn)錄酶Ⅲ（Invitrogen公司，美國）。核酸擴(kuò)增儀：美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司Veriti 96孔熱循環(huán)儀。

1.2 引物設(shè)計(jì)

從HIV數(shù)據(jù)庫（http：//www.hiv.1an1.gov/content/index）和基因庫（http：//www.ncbi.n1m.nih. gov/genbank/）中下載我國流行的主要HIV-1亞型和重組型的全基因組序列（包括B亞型、C亞型、CRF01_AE、CRF07_BC、CRF08_BC），以FASTA格式保存后導(dǎo)入MEGA 6.0軟件。用C1uster W程序進(jìn)行序列比對(duì)。修剪兩側(cè)序列后選擇比較保守的區(qū)域。以保守區(qū)域?yàn)槟０逶O(shè)計(jì)引物。用Lamp primer designing software primer exp1orer（http：//primerexp1orer.jp/e/v4_manua1/）在線引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)引物。引物設(shè)計(jì)時(shí)按Mu1tip1e a1ignment fi1e format要求輸入序列文件。選擇軟件設(shè)計(jì)的引物，再次與上述亞型的參考序列進(jìn)行比對(duì)，選擇能夠覆蓋多種亞型序列的引物，對(duì)個(gè)別堿基，由于病毒序列在該處變異較大，則采用簡并堿基。在本試驗(yàn)中共選擇了2套引物，序列見表1。

表1 環(huán)介導(dǎo)的等溫?cái)U(kuò)增引物序列

1.3 外周血淋巴細(xì)胞樣品的制備和保存

全血樣品3 000 r/min離心15 min，將血漿分別保存至2個(gè)2 mL的樣品保存管中，然后吸取白色的淋巴細(xì)胞層，保存于-80℃冰箱中備用。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)品的配制

將pNL432質(zhì)粒轉(zhuǎn)染感受態(tài)的DH5α細(xì)胞，待長出克隆后挑取一個(gè)單菌落接種于5 mL的氨芐西林抗性的LB培養(yǎng)基中。培養(yǎng)16 h后按試劑盒說明書提取質(zhì)粒。

將稀釋100倍的質(zhì)粒樣品20 μL加至GeneQuant pro紫外/可見光分光光度計(jì)的比色杯中，測(cè)定DNA濃度，然后計(jì)算提取的質(zhì)粒DNA原液的濃度。將樣品分別稀釋至106，105，104，103，100，10拷貝/μL。

1.5 核酸的提取

質(zhì)粒DNA的提取，采用質(zhì)粒提取試劑盒按照廠家提供的說明書提取。血液中HIV-1 DNA提取用DNA提取試劑盒，按照廠家提供的說明書提取。

1.6 HCV基因組的反轉(zhuǎn)錄

從臨床樣品中提取HCV RNA基因組后用反轉(zhuǎn)錄酶Ⅲ反轉(zhuǎn)錄RNA，制備cDNA樣品，作為特異性試驗(yàn)時(shí)的HCV模板。

1.7 反應(yīng)體系

引物貯存液的配制：每微升引物貯存液中C2FIP和C2BIP均為400 pmo1，C2F3和C2B3均為50 pmo1。在25 μL體系中加入引物貯存液2.5 μL，2倍的反應(yīng)緩沖液12.5 μL［含Tris-HCL（pH 8.8）40 mmo1/L，KC1 20 mmo1/L，MgSO416 mmo1/L，（NH4）2SO420 mo1/L，Tween20 0.2％，三甲銨乙內(nèi)酯1.6 mo1/L，dNTPs各2.8 mmo1/L］，Bst DNA聚合酶1.0 μL（10 U），無菌去離子水3.0 μL，熒光目視檢測(cè)液1.0 μL，DNA模板5 μL。陽性對(duì)照樣品反應(yīng)體系同上，加入試劑盒中提供的陰性和陽性對(duì)照模板5 μL。

2 結(jié)果

2.1 LAMP檢測(cè)HIV的靈敏度

為了分析本研究中使用的LAMP方法檢測(cè)HIV樣品的靈敏度，我們以梯度稀釋配制的標(biāo)準(zhǔn)品為模板。每個(gè)反應(yīng)管中分別加入的起始模板濃度分別為106，105，104，1 000，100，10拷貝/μL的DNA樣品1 μL，總反應(yīng)體系25 μL。檢測(cè)結(jié)果如圖1所示，本方法能夠檢測(cè)10拷貝的病毒樣品。

P：陽性對(duì)照，N：陰性對(duì)照。每管的起始濃度：1-2為106拷貝，3-4為105拷貝，5-6為104拷貝，7-8為103拷貝，9-10為100拷貝，11-12為10拷貝圖1 LAMP檢測(cè)HIV的靈敏度

2.2 檢測(cè)的特異性分析

為了評(píng)價(jià)本方法檢測(cè)的特異性，我們同時(shí)以HIV-1核酸、HBV核酸、HCV核酸為模板，用本方法進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果如圖2所示，該方法只能夠擴(kuò)增HIV-1樣品。在檢測(cè)HCV和HBV樣品時(shí)不會(huì)出現(xiàn)假陽性。

1：陰性對(duì)照，2：陽性對(duì)照，3-4：HIV-1核酸樣品，5-6：HBV核酸樣品，7-8：HCV核酸樣品圖2 LAMP檢測(cè)的特異性

2.3 臨床樣品的檢測(cè)

為了評(píng)價(jià)本方法對(duì)我國主要流行株的檢測(cè)情況，我們從70例HIV-1感染者的血液中提取HIV-1核酸，各亞型所占比例分別為CRF01_AE 30份、CRF07_BC 15份、CRF08_BC 10份和B亞型15份。所有樣品均經(jīng)蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)確證為HIV-1陽性。檢測(cè)結(jié)果表明，本研究中建立的LAMP方法對(duì)我國流行的主要亞型CRF0_AE、CRF07_BC、CRF08_BC和B亞型HIV-1病毒的檢出率分別為83.3％（25/ 30）、80.0％（12/15）、80.0％（8/10）、93.3％（14/ 15）。應(yīng)用本方法能夠?qū)?4.3％以上的樣品進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)我國流行的主要亞型均有較好的檢測(cè)效果。

3 討論

根據(jù)中華人民共和國衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)WS293-2008艾滋病和艾滋病毒感染診斷標(biāo)準(zhǔn)和全國艾滋病檢測(cè)技術(shù)規(guī)范（2009年修訂版）的規(guī)定，在不同時(shí)間點(diǎn)采樣，兩次核酸檢測(cè)陽性即可確證為HIV-1陽性［1-2］。雖然用于HIV核酸定性的進(jìn)口診斷試劑有許多，但通過美國FDA認(rèn)證可用于臨床診斷的HIV-1核酸定性試劑只有羅氏公司生產(chǎn)HIV-1 DNA檢測(cè)試劑，該試劑必須在羅氏公司的TMP-CMP平臺(tái)上才可使用。該檢測(cè)平臺(tái)價(jià)格昂貴，試劑價(jià)格也不菲。因此大大限制了該試劑在臨床診斷中的應(yīng)用。我國還沒有自由研發(fā)的HIV核酸定性診斷試劑可以在開放平臺(tái)上使用。因此核酸定性檢測(cè)在我國HIV-1的診斷中很少使用。HIV核酸診斷的窗口期不到7天，在HIV感染的早期和艾滋病晚期，感染者體內(nèi)病毒載量很高，因此傳染性也最強(qiáng)。但在這個(gè)階段是以檢測(cè)抗體為基礎(chǔ)的ELISA試驗(yàn)和蛋白質(zhì)印跡試驗(yàn)的劣勢(shì)。因此建立具有臨床診斷前景的核酸定性診斷試劑在我國HIV預(yù)防控制中具有十分重要的意義。

HIV-1病毒分為M、N、O、P四個(gè)組，M組病毒占95％以上。在M組中，分為9個(gè)亞型和72個(gè)重組型［15］，國內(nèi)目前主要的流行株為CRF01_AE、CRF07 _BC、CRF08_BC和B亞型，占到我國HIV-1病毒的98％以上［16］。在本研究中，我們建立的LAMP方法的檢測(cè)靈敏度達(dá)10拷貝/μL，能夠檢測(cè)國內(nèi)4種主要的亞型和重組型，檢出率達(dá)84.3％。當(dāng)用HCV和HBV病毒核酸作為模板時(shí)，不會(huì)出現(xiàn)非特異性的擴(kuò)增，說明LAMP技術(shù)具有較好的特異性。盡管該方法能夠檢測(cè)84.3％的樣品，但對(duì)15.7％的樣品未能檢出，這可能與臨床樣品的制備和保存有關(guān)。如在分離外周淋巴細(xì)胞時(shí)，并未使用淋巴細(xì)胞分離液，而是離心后直接吸取白細(xì)胞層，由于不同人員操作的熟練程度不同，可能會(huì)導(dǎo)致部分樣品中淋巴細(xì)胞數(shù)量很少，這樣提取的HIV DNA將很少，大大降低了HIV-1的檢出率。因此為了提高通過擴(kuò)增檢測(cè)的成功率，必須優(yōu)化外周淋巴細(xì)胞的制備和保存過程。

在嬰幼兒體內(nèi)母體抗體消失及自身抗HIV-1抗體的形成需要18個(gè)月時(shí)間，因此如果通過檢測(cè)HIV-1抗體的方法診斷HIV-1的感染需要在18月之后才能進(jìn)行。已有的研究表明，早期治療能夠大大提高HIV感染嬰幼兒的生活質(zhì)量和壽命。目前一些單位雖然開展HIV-1的核酸檢測(cè)，但使用的方法是自建的方法，實(shí)驗(yàn)室自己設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR，然后電泳檢測(cè)。這些方法并未經(jīng)過中國FDA的認(rèn)證，在臨床檢測(cè)中由于不同檢測(cè)單位實(shí)驗(yàn)條件的差異等多種原因很難標(biāo)準(zhǔn)化。本研究建立的等溫?cái)U(kuò)增方法程序簡單，易于標(biāo)準(zhǔn)化，在HIV感染嬰幼兒的早期診斷方面具有很大的應(yīng)用前景。

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Development of detecting HIV-1 DNA using loop-mediated isothermal amplification

GU0 Hong-xiong，HUAN Xi-ping，ZH0U Ying，LU Jing，HU Hai-yang，F(xiàn)U Geng-feng
（Department of STD and AIDS Contro1 and Prevention，Jiangsu Provincia1 Center for Disease Contro1 and Prevention，Nanjing Jiangsu 210009，China）

Objective：To deve1op method of detecting HIV-1 DNA using 1oop-mediated isotherma1 amp1ification.Methods：First1y，the LTR sequences of various subtypes and circu1ating recombinant forms（CRFs）were down1oaded from HIV-1 database and GeneBank on1ine，these sequences were imported into MEGA 6.0 software and the a1ignment of sequences were conducted with C1uster W program.The re1ative conservative region were se1ected and exported as a FASTA fi1e.FASTA fi1e were submitted into Lamp primer designing software primer exp1orer on1ine.The a1ignment of the primers with HIV-1 sequences were performed to seek the 1ess conservative sites，if so，the mixed bases were used.When conducting LAMP，visib1e f1uorescence reagent was used to observe the resu1t of amp1ification.Results：The primers designed in this study was suitab1e in detecting HIV-1 DNA using LAMP，and showed better sensitivity and specificity.Conclusion：we successfu11y deve1oped a LAMP to test HIV-1 DNA，this method may be used to ear1y diagnose HIV-1 infection.

1oop-mediated isotherma1 amp1ification；HIV-1；nuc1eic acid

R512.91

A

1671-7783（2015）06-0528-04

10.13312/j.issn.1671-7783.y150196

2015-09-09 ［編輯］ 何承志

江蘇省衛(wèi)生廳科教興衛(wèi)工程重點(diǎn)人才課題（RC2011083）

郭宏雄（1972—），男，甘肅秦安人，副研究員，博士，主要從事傳染病分子流行病學(xué)與核酸診斷研究。