王亞麗，李穎暢，馬春穎，李作偉，齊鳳元，劉珊

(渤海大學(xué)化學(xué)化工與食品安全學(xué)院，食品科學(xué)研究院，遼寧省食品安全重點實驗室，遼寧錦州，121013)

藍(lán)莓葉多酚是藍(lán)莓葉中的次生代謝產(chǎn)物，包括花色苷類、黃酮類、黃酮醇類、木質(zhì)素類和酚酸等［1］。Matsuo等［2］從兔眼藍(lán)莓葉中鑒定出咖啡?？崴?、黃酮苷、黃烷-3-醇、原花青素。Deng等［3］對藍(lán)莓葉多酚進(jìn)行分析，鑒定出五倍子酸、香草酸、阿魏酸、原兒茶素酸、綠原酸等。藍(lán)莓葉多酚是藍(lán)莓中重要的生物活性成分，具有多種生物活性，富含黃豆粉的藍(lán)莓葉多酚可以降低血糖、控制體重增加及降低小鼠血清中的膽固醇含量［4］。兔眼藍(lán)莓葉中低聚花青素可以抑制人類T細(xì)胞的病毒通過T細(xì)胞的凋亡和細(xì)胞周期停滯進(jìn)行擴(kuò)散［5］。關(guān)于多酚類物質(zhì)對腐敗菌和致病菌的抑菌效果及抑菌機(jī)制方面有一些報道，如王向陽等［6］認(rèn)為茶多酚對枯草芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌和克柔念球菌的蛋白質(zhì)合成有抑制作用并且破壞其細(xì)胞壁。Nakayama等［7］認(rèn)為，綠茶提取物可抑制金黃色葡萄球菌、大腸桿菌吸收基質(zhì)和分泌物質(zhì)，并且抑制酶的活性。藍(lán)莓葉多酚作為一種天然植物提取物，很早以前就用在蛋糕、米飯等防腐保鮮上［8］，其抑菌活性和抑菌機(jī)理目前尚不完全明確。

本文以常見的致病菌革蘭氏陽性金黃色葡萄球菌、革蘭氏陰性大腸埃希式桿菌和水產(chǎn)品中典型的革蘭氏陰性銅綠假單胞菌為試驗菌，探討藍(lán)莓葉多酚pH值對其抑菌性的影響，同時通過測定藍(lán)莓葉多酚處理后細(xì)菌的生長曲線、紫外吸收物質(zhì)、電導(dǎo)率值的變化以及細(xì)胞形態(tài)變化，明確藍(lán)莓葉多酚的抑菌作用，以期為藍(lán)莓葉多酚應(yīng)用于水產(chǎn)品等食品保鮮提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料與主要儀器

金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、大腸桿菌(E.coli)、銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa);藍(lán)莓葉多酚(純度＞80%)，渤海大學(xué)化學(xué)化工與食品安全重點實驗室提供;LB肉湯培養(yǎng)基、LB營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，青島高科園海博生物技術(shù)有限公司;氯化鈉(分析純)，天津市化學(xué)試劑批發(fā)公司;磷酸(分析純)，天津市天力化學(xué)試劑有限公司。

THZ-D臺式恒溫振蕩器，太倉市實驗設(shè)備廠;LRH系列生化培養(yǎng)箱，上海一恒科技有限公司;SWCJ-2FD型潔凈工作臺，蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司;UV-2550型紫外-可見光分光光度計，尤尼柯(上海)儀器有限公司;FE20型pH計，METTLER TOLEDO公司;高速冷凍離心機(jī)，Thermo公司;LDZX-40SC型立式可控電熱壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠;DHG-9123A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海申賢恒溫設(shè)備廠;S-4800型場發(fā)射掃描電鏡，日本日立。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌懸液的制備

取1環(huán)斜面保存的金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、銅綠假單胞菌，分別接種于5 mL LB肉湯培養(yǎng)基中過夜活化2次(30℃，160 r/min)，根據(jù)實驗需要用無菌生理鹽水稀釋至適當(dāng)濃度。

1.2.2 藍(lán)莓葉多酚的最低抑菌濃度

參考付慧等［9］方法，用二倍稀釋法將藍(lán)莓葉多酚配成2%、1%、0.5%、0.25%、0.125%、0.062 5%的溶液，在無菌平皿中分別加入1 mL不同濃度稀釋液，然后倒入約15 mL培養(yǎng)基，充分混勻，平放凝固后取0.5 mL供試菌懸液于平板上涂布均勻，置于30℃下培養(yǎng)24 h，觀察，確定藍(lán)莓葉多酚的最低抑菌濃度，并以此濃度進(jìn)行后續(xù)實驗。

1.2.3 pH值對藍(lán)莓葉多酚抑菌活性的影響

將0.125%的藍(lán)莓葉多酚用0.1mol/L NaOH和HCl調(diào)成 8 個 pH 值梯度:4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0，應(yīng)用牛津杯法觀察 pH值對藍(lán)莓葉多酚抑菌活性的影響。

1.2.4 細(xì)菌生長曲線的測定

取少量金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、銅綠假單胞菌培養(yǎng)至對數(shù)期，加入藍(lán)莓葉多酚，使其終濃度為最低抑菌濃度，于30℃，160 r/min搖床振蕩培養(yǎng)。每隔2 h分別取樣，在595 nm處測定其吸光值。以時間為橫坐標(biāo)，OD595nm值為縱坐標(biāo)，繪制生長曲線，另以不添加藍(lán)莓葉多酚的為對照組。

1.2.5 紫外吸收值的測定

取少量金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、銅綠假單胞菌培養(yǎng)至對數(shù)期，離心(4 000 r/min，10 min)，用0.1 mol/L磷酸緩沖液(pH=7.4)洗滌3次，用等量的最低抑菌濃度的藍(lán)莓葉多酚磷酸鹽溶液懸浮，于30℃，160 r/min搖床振蕩培養(yǎng)，每隔2 h取樣，離心(4 000 r/min，10 min)除去菌體，測上清液的OD260nm值。

1.2.6 菌液電導(dǎo)率值的測定

根據(jù)張新虎等［10］的方法，將生長到對數(shù)期的金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、銅綠假單胞菌用0.1 mol/L磷酸緩沖液(pH=7.4)洗滌3次，取5 mL菌液與0.125%藍(lán)莓葉多酚溶液等體積混合，每隔10 min測1次電導(dǎo)率;以無菌水替代藍(lán)莓葉多酚作為對照組。

1.2.7 掃描電鏡觀察

參照Yi等［11］的方法進(jìn)行操作。

2 結(jié)果與分析

2.1 藍(lán)莓葉多酚的最低抑菌濃度(MIC)

表1 最低抑菌濃度的確定Table 1 The determination of minimum inhibitory concentration

由表1可知，藍(lán)莓葉多酚對3種菌均有抑制作用，對大腸桿菌最低抑菌濃度為0.125%，對金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌的最低抑菌濃度為0.062 5%，由此確定采用0.125%的濃度進(jìn)行后續(xù)實驗。此結(jié)果還說明藍(lán)莓葉多酚提取物既可以抑制革蘭氏陽性菌，也可以抑制革蘭氏陰性菌，這和Deng等［3］的研究結(jié)果一致。

2.2 pH值對藍(lán)莓葉多酚抑菌活性的影響

表2 藍(lán)莓葉多酚pH值對供式菌抑菌圈直徑的影響 單位:mmTable 2 Effect of pH value of blueberry leaf polyphenol on inhibition zone

由表2可知，在pH值為4.5～5.5的范圍內(nèi)，抑菌活性隨著pH值增大略有降低，分析可能是由于酸性條件下，非極性酚類化合物質(zhì)的酚羥基電離度減小，疏水性增強(qiáng)，更容易溶于細(xì)胞膜的脂類和蛋白質(zhì)的疏水區(qū)域，從而破壞微生物細(xì)胞膜的完整性［9］。在pH值為7.0～8.0范圍內(nèi)，其抑菌活性較強(qiáng);當(dāng)pH7.5時，抑菌活性最強(qiáng)，這可能是由于多酚中的單體物質(zhì)在不同的pH值下，其含量和功能活性不同［12］。

2.3 細(xì)菌生長曲線

由圖1可以看出，各對照組大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌正常生長，培養(yǎng)一段時間后達(dá)到對數(shù)期，細(xì)菌數(shù)量迅速增加;與對照組相比，加入藍(lán)莓葉多酚處理組的細(xì)菌生長速度相對緩慢，菌含量始終處于低水平。結(jié)果說明，藍(lán)莓葉多酚可以抑制試驗菌的生長，且對3種試驗菌的生長均有抑制作用。此結(jié)果和 C^oté等［13］、Caillet等［14］研究蔓越橘水溶性多酚對菌體生長規(guī)律的影響一致。

圖1 藍(lán)莓葉多酚對試驗菌生長曲線的影響Fig.1 Effect of blueberry leaf polyphenol on growth curve of test organisms

2.4 藍(lán)莓葉多酚對菌液紫外吸收值的影響

細(xì)胞膜是細(xì)菌的天然保護(hù)屏障，如果遭到破環(huán)，K+，PO3－等離子首先泄露出來，隨后是大分子物質(zhì)如DNA、RNA等，通過測定在260 nm處吸光值的變化可以間接了解細(xì)胞膜的完整性［15］。圖2中A、B、C分別顯示了藍(lán)莓葉多酚對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌膜完整性的影響。由圖2可知，藍(lán)莓葉多酚處理組在260 nm波長處的吸光值均顯著(P＜0.05)大于對照組，并隨著作用時間的延長，吸光值顯著上升，而對照組吸光值基本不變。說明藍(lán)莓葉多酚可以破壞大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌細(xì)胞膜的完整性而顯示其抑菌活性。Serajus Salaheen等［16］研究也表明藍(lán)莓果中的多酚能夠破壞空腸彎曲桿菌細(xì)胞膜。

圖2 藍(lán)莓葉多酚對菌液紫外吸收值的影響Fig.2 Effect of blueberry leaf polyphenol on ultraviolet absorption value

2.5 藍(lán)莓葉多酚對菌液電導(dǎo)率值的影響

微生物的質(zhì)膜為菌體提供最基本的屏障，由帶有嵌入型蛋白質(zhì)的磷脂雙分子層構(gòu)成，抵抗外界的破壞。當(dāng)細(xì)菌遇到強(qiáng)抑菌劑時，其細(xì)胞膜遭到破壞，菌體的保護(hù)屏障被打破，細(xì)胞內(nèi)電解質(zhì)泄露到培養(yǎng)液中，從而使培養(yǎng)液的電導(dǎo)率值升高。因此，菌液電導(dǎo)率值的變化反映了細(xì)菌細(xì)胞膜通透性的變化［17－18］。從圖3可以看出，與對照組相比，0.125%藍(lán)莓葉多酚組的電導(dǎo)率值始終處于較高水平，且隨著作用時間的延長，電導(dǎo)率值逐漸升高，而對照組電導(dǎo)率值基本上不變，兩者之間差異顯著(P＜0.05)。這可能是由于多酚固有的解偶聯(lián)活性，使得膜兩側(cè)的電化學(xué)質(zhì)子梯度減小，干擾了細(xì)胞ATP的合成，并對細(xì)胞的主動運(yùn)輸產(chǎn)生影響，從而使得細(xì)胞膜的通透性變大［19］。說明藍(lán)莓葉多酚能增強(qiáng)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌細(xì)胞膜的通透性，從而表現(xiàn)出抑菌性。

圖3 藍(lán)莓葉多酚對菌液電導(dǎo)率值的影響Fig.3 Effect of blueberry leaf polyphenols on conductivity value

2.6 掃描電鏡觀察

圖4 試驗菌細(xì)胞形態(tài)Fig.4 Morphology of test bacteria cell

正常的典型革蘭氏陰性大腸桿菌、銅綠假單胞菌和革蘭氏陽性金黃色葡萄球菌如圖4中 A1、B1、C1，具有規(guī)則的細(xì)胞形態(tài)和完整的細(xì)胞膜。經(jīng)藍(lán)莓葉多酚處理過的大腸桿菌、銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌如圖4中A2、B2、C2?？梢钥闯觯?xì)胞形態(tài)發(fā)生了明顯變化，細(xì)胞表面有明顯的斷層，細(xì)胞壁出現(xiàn)凹陷。分析原因可能是由于多酚類物質(zhì)的局部疏水性和螯合金屬離子的能力，能夠結(jié)合到細(xì)胞外膜和在細(xì)胞外膜上發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，從而導(dǎo)致細(xì)胞膜流動性消失和細(xì)胞的不規(guī)則性［20］。電鏡結(jié)果與電導(dǎo)率值、紫外吸收物質(zhì)的變化，證實了藍(lán)莓葉多酚具有破壞菌體細(xì)胞膜的作用。

3 結(jié)論

(1)藍(lán)莓葉多酚有較強(qiáng)的抑菌效果，顯示出一定的抗菌廣譜性。

(2)藍(lán)莓葉多酚對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、銅綠假單胞菌的最低抑菌濃度分別為0.062 5%、0.125%、0.062 5%。

(3)藍(lán)莓葉多酚在pH值7.0～8.0范圍內(nèi)抑菌活性較強(qiáng)。

(4)3種試驗菌培養(yǎng)液的電導(dǎo)率值、紫外吸收物質(zhì)值的變化和細(xì)胞的掃描電鏡觀察結(jié)果說明藍(lán)莓葉多酚能增大細(xì)胞通透性，破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的完整性從而達(dá)到抑菌作用。

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