陳 宇 石月萍 (遼寧醫(yī)學院，遼寧 錦州 121000)

心肌纖維化是心肌重構持續(xù)發(fā)展和難于逆轉的重要原因，具體表現(xiàn)為心肌成纖維細胞增殖，膠原合成異常，細胞外基質代謝失衡、堆積。心肌纖維化是心功能由代償期向失代償期轉變的關鍵，一旦心肌出現(xiàn)纖維化就會導致心室壁僵硬、心室舒張功能受損，使心肌電的各向異性增加，沖動傳導不均一、不連續(xù)，導致心律失常，最終可能出現(xiàn)心力衰竭。而心肌纖維化的消退可恢復心肌細胞和心肌間質之間的平衡，改善心肌僵硬度和心功能〔1〕。因此，如何減緩和逆轉纖維化對改善患者的預后，降低死亡率具有重要的意義〔2〕。

過氧化物酶體增殖物激活受體(PPAR)是一類由配體激活的核轉錄因子，在抑制心肌纖維化過程中起著重要作用，研究表明分布于心肌組織中的PPAR激動劑通過作用于膠原代謝、腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)、致纖維化相關調控因子以及炎癥反應等途徑預防和改善心肌纖維化〔3～5〕。四逆湯作為中醫(yī)名方，在抗心肌缺血、保護腦缺血后損傷、降低血壓、抗動脈粥樣硬化、免疫調節(jié)等方面的藥理研究已取得了很大進展，但對于其抗心肌纖維化的研究較少。本研究擬觀察四逆湯對大鼠心肌纖維化的抑制作用，并探討其作用機制。

1 材料和方法

1.1動物 Wistar大鼠36只，雌雄各半，體重180～220 g，SPF級，適應性喂養(yǎng)1 w后開始實驗。

1.2藥品、試劑和儀器 異丙腎上腺素為濟南科匯藥業(yè)有限公司生產，四逆湯(由附子、炙甘草、干姜組成)按2010年《中國藥典》方法制備〔6〕。細胞間黏附分子(ICAM)-1，轉化生長因子(TGF)-β1酶聯(lián)免疫吸附試劑盒(美國R＆D公司)，羥脯氨酸試劑盒(南京建成生物技術有限公司)，AG135分析天平(上海精密科學儀器有限公司)，全自動酶標儀(美國Metertech公司)，722型可見分光光度計(上海欣茂儀器有限公司)，組織勻漿機(德國IKA公司)。

1.3方法

1.3.1心肌纖維化模型的制備 參照文獻〔7〕方法制備心肌纖維化模型，大鼠背部皮下注射異丙腎上腺素5 mg·kg－1·d－1連續(xù)8 d，自由進食飲水，對照組皮下注射相同體積的生理鹽水。

1.3.2動物分組及給藥 將36只Wistar大鼠隨機分為模型組、四逆湯組和正常對照組，每組12只。第9天開始四逆湯組大鼠給予四逆湯灌胃6.06 g/kg，1次/d，連續(xù)4 w，正常對照組和模型組灌胃相同體積的生理鹽水。

1.4指標測定

1.4.1心臟重量指數 所有大鼠于末次給藥后禁食禁水12 h，稱取體重，然后10%水合氯醛(0.3 ml/kg)麻醉，腹主動脈取血，分離血清備用，然后開胸取出心臟，用冰生理鹽水反復沖洗，再用濾紙吸干水分，電子天平稱全心重量和左心室重量，心臟重量與體重的比值即為心臟重量指數，左心室重量與體重的比值即為左心室重量指數。

1.4.2膠原容積分數 取近心尖部左心室組織，常規(guī)10%中性甲醛固定、梯度乙醇脫水、石蠟包埋和切片，進行Masson染色，采用圖像分析軟件隨機選取5個視野，測定心肌間質膠原容積分數(膠原面積/心肌總面積)，取其均值。

1.4.3心肌組織羥脯氨酸含量 從左心室縱取100 mg心肌組織，按照試劑盒說明書操作(堿水解法)，在550 nm波長處用分光光度法測定心肌組織羥脯氨酸含量。

1.4.4血漿ICAM-1、TGF-β1水平 大鼠肌肉麻醉后腹主動脈取血，注射器用肝素潤管，2 000 r/min離心，分離血漿，采用ELISA試劑盒測量血漿ICAM-1，TGF-β1水平。

1.4.5心肌組織PPAR蛋白表達 取液氮保存的左心室心肌組織100 mg，取出后研磨成粉末狀，放入EP管中，加入10倍體積的RIPA裂解液，置于冰上超聲3～5次，4℃15 000 r/min離心15 min，收集上清，按BCA試劑盒操作方法測定總蛋白濃度。等量總蛋白經SDS-PAGE電泳分離后轉移至PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，加入兔抗鼠PPARα、PPARγ一抗(1∶1 000)，4℃搖床孵育過夜。TBST緩沖液充分漂洗后加入HRP標記的羊抗兔二抗，室溫孵育2 h，TBST清洗3次，最后于暗室進行化學發(fā)光反應，應用軟件Quantity One分析目的條帶光密度值。

1.5統(tǒng)計學分析 采用SPSS17.0軟件行方差分析。

2結果

2.1各組大鼠心臟重量指數比較 模型組心臟重量指數、左心室重量指數大于正常對照組(P＜0.01);治療后四逆湯組心臟重量指數、左心室重量指數小于模型組(P＜0.05)，見表1。

2.2各組大鼠心肌膠原容積分數 Masson染色可見正常對照組大鼠心肌細胞排列緊密、整齊，心肌間質中基本沒有成纖維細胞增生;模型組大鼠心肌間質膠原沉積明顯，心肌纖維化嚴重;四逆湯組心肌纖維細胞增生明顯少于模型組，心肌間質纖維化程度明顯改善，見圖1。圖像分析軟件測定模型組大鼠心肌膠原容積分數顯著高于正常對照組(P＜0.01)，與模型組比較，四逆湯組心肌膠原容積分數顯著減小(P＜0.05)，見表1。

圖1 各組心肌組織Masson染色

2.3各組大鼠心肌組織羥脯氨酸含量 模型組大鼠心肌組織中羥脯氨酸含量顯著高于正常對照組(P＜0.01)，四逆湯組心肌組織中羥脯氨酸含量明顯低于模型組(P＜0.05)，見表1。

表1 各組大鼠心臟重量指數、心肌膠原容積分數、心肌組織羥脯氨酸含量比較(s，n=12)

表1 各組大鼠心臟重量指數、心肌膠原容積分數、心肌組織羥脯氨酸含量比較(s，n=12)

與正常對照組比較:1)P＜0.01，與模型組比較:2)P＜0.05;下表同

組別 心臟重量指數(mg/g)左心室重量指數(mg/g)膠原容積分數(%)羥脯氨酸含量(μg/g)正常對照組3.32±0.15 2.30±0.11 2.79±0.43 396.2±16.7模型組 4.56±0.111)3.39±0.141)10.78±1.241)584.4±28.62)四逆湯組 3.78±0.142)2.98±0.122)6.75±0.722)508.4±15.92)

2.4各組大鼠血漿ICAM-1，TGF-β1水平 與正常對照組比較，模型組大鼠血漿ICAM-1、TGF-β1水平顯著增高;四逆湯組與模型組相比，ICAM-1、TGF-β1 水平降低(P＜0.05)，見表2。

表2 各組大鼠血漿ICAM-1，TGF-β1水平及心肌組織中PPARα、PPARγ蛋白表達量比較(s，n=12)

表2 各組大鼠血漿ICAM-1，TGF-β1水平及心肌組織中PPARα、PPARγ蛋白表達量比較(s，n=12)

組別 ICAM-1(μg/L)TGF-β1(μg/L)PPARα PPARγ正常對照組372.46±11.45 7.31±2.24 1.18±0.19 1.02±0.21模型組 545.10±24.711)15.67±6.091)0.22±0.071)0.13±0.041)四逆湯組 417.48±19.272)8.25±3.462)0.74±0.132)0.56±0.152)

2.5心肌組織PPAR蛋白表達 模型組大鼠心肌組織中PPARα、PPARγ蛋白表達量較正常對照組有所下降(P＜0.01);與模型組比較，四逆湯組心肌組織中PPARα、PPARγ蛋白表達量增高(P＜0.05)。見表2。

3討論

心肌纖維化是多種心血管疾病的發(fā)病因素，也是決定心血管疾病預后的重要因素，其病理改變表現(xiàn)為心肌成纖維細胞增殖和心肌細胞外間質膠原過量積聚，多由缺血缺氧和炎癥等原因導致。已有研究表明，異丙腎上腺素是β受體激動劑，可增加心肌收縮力和耗氧量〔8〕，本實驗連續(xù)給予大鼠異丙腎上腺素8 d，建立大鼠心肌纖維化模型成功。

四逆湯是東漢張仲景《傷寒雜病論》回陽救逆的名方，已被中國藥典收載，組方由附子、甘草、干姜3味中藥組成，主要治療少陰虛寒癥〔6〕。《素問生氣通天論》:“陽氣者，精則養(yǎng)神，柔則養(yǎng)筋。”今心陽衰微，神失所養(yǎng)，則神衰欲寐;腎陽衰微，不能暖脾，升降失調，則腹部吐利。方中生附子大辛大熱，溫壯元陽，破散陰寒，回陽救逆，為君藥。干姜，入心、脾、肺經，溫中散寒，助陽通脈，為臣藥。炙甘草之用有三:一則益氣補中，以治虛寒之本;二則緩和干姜、附子峻烈之性;三則調和藥性，使藥力持久，故甘草為佐使藥。本實結果表明四逆湯具有減輕心肌纖維化的作用。

近年來，大量的動物實驗表明四逆湯具有清除氧自由基、減輕脂質過氧化反應、減少心肌酶釋放、改善缺血心肌灌流的作用，對大鼠心臟具有積極保護作用〔9〕。目前對于其抗心肌纖維化發(fā)生、發(fā)展機制的認識還處于探索階段。研究表明炎癥反應是引起心肌纖維化的重要原因，炎性細胞因子可通過旁分泌或自分泌方式，導致心肌基質金屬蛋白酶及其抑制劑比例失調，從而造成心肌細胞外基質合成增多，引起心肌纖維化、左室重構和心肌肥厚。ICAM-1是屬于免疫球蛋白超家族的一種重要細胞黏附分子，正常情況下表達很少，只有受到炎癥細胞因子等作用可表達于多種細胞表面，包括中性粒細胞、巨噬細胞、淋巴細胞、血管內皮細胞以及心肌細胞等，主要作用為參與白細胞向炎癥部位移行過程，參與免疫細胞的特異性識別，是炎癥反應的可靠標志物〔10〕。研究表明ICAM-1與眾多心臟病密切相關，在心肌炎、心力衰竭、慢性缺血性心肌病大鼠心肌組織中ICAM-1含量明顯高于正常對照組〔11～13〕，本研究結果顯示炎癥因子的過度表達參與了心肌纖維化的發(fā)生發(fā)展，而四逆湯能夠抑制心肌纖維化模型大鼠血漿ICAM-1水平而發(fā)揮療效。

TGF-β1是膠原纖維和其他細胞外基質成分合成和沉積的強有力的始動因子，作為心血管系統(tǒng)是最重要的異構體，參與了對基質金屬蛋白酶系統(tǒng)、腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)以及炎癥和免疫系統(tǒng)的調節(jié)，能增加Ⅰ型前膠原的合成增加，抑制細胞外基質的降解，使細胞外基質沉積，促進心肌纖維化〔14，15〕。游敏生等〔16〕研究發(fā)現(xiàn)通心絡超微粉能顯著抑制急性心肌梗死大鼠TGF-β1表達增加，從而保護心肌梗死后的心室重塑。本實驗推測四逆湯改善心肌纖維化與抑制TGF-β1的表達有關，此結論與廖火城等〔17〕研究一致。

PPAR的激活在體內多種代謝活動中起重要的生理學作用，如調節(jié)脂肪和糖代謝，抑制腫瘤發(fā)生發(fā)展，抑制炎癥反應及炎癥因子生成等〔18〕，PPAR 有 3種亞型，其中 PPARα、PPARγ研究較多，Loichot等〔19〕研究顯示PPARα基因敲除小鼠出現(xiàn)明顯的心肌纖維化，導致小鼠心功能、心肌收縮能力下降。Ricote等〔20〕發(fā)現(xiàn)PPARγ通過抑制活化蛋白1或腫瘤壞死因子α從而調節(jié)基質金屬蛋白酶的活性。趙樹梅等〔21〕研究發(fā)現(xiàn)，PPARγ配體激活劑吡格列酮可干預并減輕糖尿病大鼠心肌纖維化程度，并可影響糖尿病早期心室重塑及改善心功能。本實驗顯示四逆湯能顯著抑制心肌纖維化大鼠PPARα、PPARγ蛋白表達的下降，可能具有PPAR配體作用。

綜上所述，四逆湯能夠降低心肌纖維化大鼠心臟重量指數、減少心肌間質膠原容積分數和心肌羥脯氨酸含量，改善心肌纖維化，其機制可能與其抑制大鼠心肌組織內 PPARα、PPARγ蛋白表達下降、降低炎癥因子ICAM-1水平和細胞因子TGF-β1水平有關，但有關四逆湯抗心肌纖維化的具體細胞信號調控機制還需要進一步探討。

1 錢善鳳，沈思鈺，蔡 輝.中醫(yī)藥抗心肌纖維化實驗研究進展〔J〕.中國中醫(yī)急癥，2006;15(5):525-7.

2 Cohn JN，F(xiàn)errari R，Sharpe N.Cardiac remodeling-concepts and clinical implications:a consensus paper from an international forum on cardiac remodeling.Behalf of an International Forum on Cardiac Remodeling〔J〕.J Am Coll Cardiol，2000;35(3):569-82.

3 Zhang ZZ，Shang QH，Jin HY，et al.Cardiac protective effects of irbesartan via the PPAR-gamma signaling pathway in angiotensin-converting enzyme 2-deficient mice〔J〕.J Transl Med，2013;11(1):229.

4 Nagashima A，Watanabe R，Ogawa M.Different roles of PPAR-γ activity on physiological and pathological alteration after myocardial ischemia〔J〕.J Cardiovasc Pharmacol，2012;60(2):158-64.

5 Hou X，Zhang Y，Shen YH，et al.PPAR-γ activation by rosiglitazone suppresses angiotensinⅡ-mediated proliferation and phenotypictransition in cardiac fibroblasts via inhibition of activation of activator protein 1〔J〕.Eur J Pharmacol，2013;715(1-3):196-203.

6 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部)〔M〕.北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010:650.

7 Zhang YG，Li YG，Liu BG，et al.Urotensin Ⅱ accelerates cardiac fibrosis and hypertrophy of rats induced by isoproterenol〔J〕.Acta Pharmacol Sin，2007;28(1):36-43.

8 張依娜，馮微微，陳桂英，等.ISO誘導心力衰竭大鼠模型的建立及評價〔J〕.哈爾濱醫(yī)科大學學報，2013;47(5):410-3.

9 馮秋榮，李必堅，楊西曉.四逆湯的現(xiàn)代藥理及作用機制研究進展〔J〕.中西醫(yī)結合心腦血管病雜志，2014;12(2):239-40.

10 Yeh TM，Liu SH，Lin KC，et al.Dengue virus enhances thrombomodulin and ICAM-1 expression through the macrophage migration inhibitory factor induction of the MAPK and PI3K signaling pathways〔J〕.PLoS One，2013;8(1):e55018.

11 焦華琛，張?zhí)N慧，李運倫，等.青蒿提取物對房顫大鼠心肌炎癥相關因子TNF-α及ICAM-1表達的影響〔J〕.中西醫(yī)結合心腦血管病雜志，2012;10(4):449-50.

12 范建民，張 穩(wěn)，唐 瑩，等.元安顆粒對慢性心力衰竭大鼠心肌組織黏附分子表達的影響〔J〕.中國中醫(yī)急癥，2013;22(4):563-5.

13 姚麗梅，劉唐威，曾志羽，等.辛伐他汀對大鼠腎血管性高血壓左心室肥厚和細胞黏附分子-1的影響〔J〕.中國現(xiàn)代醫(yī)學雜志，2013;23(5):21-5.

14 Gong KZ，Chen YF，Li P，et al.Transforming growth factor-β inhibits myocardial PPARγ expression in pressure overload-induced cardiac fibrosis and remodeling in mice〔J〕.J Hyperten，2011;29(9):1810-9.

15 王選琦，燕醒獅，吳曉明，等.AKF-PD在轉化生長因子-β1誘導新生大鼠心肌成纖維化中抵抗作用的實驗研究〔J〕.海南醫(yī)學院學報，2014;20(1):8-11.

16 游敏生，趙增毅，楊志勇.通心絡超微粉抑制大鼠心肌梗死后轉化生長因子-β1的表達〔J〕.中國老年醫(yī)學雜志，2010;30(8):2149-52.

17 廖火城，劉 勇，周 彬，等.四逆湯對異丙腎上腺素引起的大鼠心肌纖維化和TGF-β1表達的影響〔J〕.中國病理生理雜志，2010;26(7):1316-20.

18 Satyam Sarma，Hossein Ardehali，Mihai Gheorghiade.Enhancing the metabolic substrate:PPAR-alpha agonists in heart failure〔J〕.Heart Fail Rev，2012;17(1):35-43.

19 Loichot C，Jesel L，Tesse A，et al.Deletion of peroxisome proliferator-activated receptor-alpha induces an alteration of cardiac functions〔J〕.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2006;291(1):H161-6.

20 Ricote M，Li AC，Willson TM，et al.The peroxisome proliferator-activated receptor-gamma is a negative regulator of macrophage activation〔J〕.Nature，1998;391(6662):79-82.

21 趙樹梅，李虹偉，沈潞華.過氧化物酶體增殖物激活受體γ通路激活對糖尿病大鼠心肌纖維化的影響〔J〕.中華老年多器官疾病雜志，2010;9(6):525-8.