金香順 王東旭 尤 濤 (吉化集團(tuán)公司總醫(yī)院，吉林 吉林 132022)

喉癌早期易于診斷，其死亡率相對(duì)較低〔1〕。資料表明吸煙和飲酒均可以增加發(fā)生喉癌的風(fēng)險(xiǎn)〔2〕。哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)是一種絲/蘇氨酸蛋白激酶，屬于PI3K相關(guān)激酶(PIKKs)家族成員，它有兩種存在形式，即 mTOR復(fù)合體(mTORC)1 和 mTORC2，其中 mTORC1 對(duì)雷帕霉素敏感〔3〕。mTOR參與蛋白質(zhì)、核糖體生物合成和細(xì)胞凋亡等多項(xiàng)生理功能，而且研究表明 mTOR過度表達(dá)可以誘導(dǎo)多數(shù)腫瘤的發(fā)生〔4〕。體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)mTOR抑制劑在少數(shù)腫瘤細(xì)胞類型中具有誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用〔5〕，但是mTOR抑制劑對(duì)喉癌細(xì)胞的作用鮮有報(bào)道。增加癌癥細(xì)胞對(duì)凋亡的敏感性是癌癥研究的重要的策略〔6〕。然而，某些癌癥細(xì)胞對(duì)化療藥物產(chǎn)生抵抗一方面是由于不能啟動(dòng)凋亡通路，還有另一方面是細(xì)胞自噬在凋亡中發(fā)揮的保護(hù)作用〔7〕。自噬抑制劑本身表現(xiàn)出抗腫瘤活性，而且它還能增加其他抗腫瘤藥物殺傷癌癥細(xì)胞的效應(yīng)〔8〕。本研究擬考察mTOR抑制劑(AZD8055)是否能引起喉癌細(xì)胞株Hep-2凋亡以及抑制自噬是否能增AZD8055的作用。

1 材料與方法

1.1主要試劑與儀器 自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-MA)，AZD8055，四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，RPMI 1640，胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司。

1.2細(xì)胞株與細(xì)胞培養(yǎng) 人喉癌細(xì)胞株(Hep-2)細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)，培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和40 U/ml慶大霉素的RPMI1640培養(yǎng)基中，在5%CO2，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3MTT法檢測(cè)細(xì)胞活性 將Hep-2細(xì)胞以5×103/ml密度接種于96孔板(每孔加200 μl)，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期(24 h)，加入不同濃度藥物處理24 h后，小心吸去上清，加入90 μl新鮮培養(yǎng)液，再加入10 μl MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄上清，每孔加入100 μl二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。用酶標(biāo)儀于490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度(A)值。細(xì)胞存活率(%)=〔A實(shí)驗(yàn)孔－A空白孔/(A對(duì)照孔－A空白孔)〕×100%，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4Western檢測(cè)蛋白表達(dá) 將經(jīng)藥物處理后的Hep-2細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液RIPA裂解，進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯凝膠(SDS-PAGE)電泳。分離膠濃度12%，濃縮膠濃度5%，電轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，5%脫脂奶粉封閉2 h，Cleaved多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶(PARP)、Cleaved Caspase-3、細(xì)胞色素C抗體(Cell Signaling公司，1∶800)4℃孵育過夜，Tris鹽酸緩沖液(TBST)洗3次膜，15 min/次，辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠二抗(Cell Signaling公司1∶5 000)室溫孵育2 h，TBST洗3次膜，15 min/次，增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法(ECL)顯影。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS16.0軟件進(jìn)行單因素方差分析、最小顯著差數(shù)(LSD)法檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1AZD對(duì)Hep-2細(xì)胞生存率的影響 Hep-2細(xì)胞經(jīng)過20、40、80 μmol/L AZD處理24 h后，細(xì)胞生存率均顯著下降，并呈濃度依賴性。

2.2AZD對(duì)Hep-2細(xì)胞凋亡通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響線粒體功能障礙在凋亡中起著突出的作用，線粒體功能障礙導(dǎo)致細(xì)胞色素C，從線粒體膜間隙釋放則是多種細(xì)胞凋亡的普遍現(xiàn)象。PARP是細(xì)胞凋亡核心成員胱天蛋白酶(Caspase)的切割底物。Western印跡檢測(cè)凋亡通路執(zhí)行蛋白caspase-3及其底物PARP，結(jié)果如圖1所示，經(jīng)不同濃度AZD處理24 h后，與對(duì)照組相比Cleaved Caspase-3和Cleaved PARP呈劑量依賴性的表達(dá)增加。另外，如圖2所示細(xì)胞色素C的表達(dá)量明顯增加，與空白對(duì)照相比較差異顯著。以上結(jié)果表明AZD可以激活凋亡通路，誘導(dǎo)Hep-2細(xì)胞發(fā)生凋亡。

圖1 不同濃度AZD對(duì)Hep-2細(xì)胞Cleaved Caspase-3和Cleaved PARP的影響

圖2 不同濃度AZD對(duì)Hep-2細(xì)胞細(xì)胞色素C的影響

2.3AZD聯(lián)合應(yīng)用3-MA對(duì)Hep-2細(xì)胞生存率的影響5 mmol/L 3-MA作用Hep-2細(xì)胞24 h后，對(duì)細(xì)胞活性無(wú)顯著影響。然而，當(dāng)5 mmol/L 3-MA與20 mmol/L AZD共同作用24 h后，與單用AZD組比較，細(xì)胞活性顯著降低。結(jié)果提示，3-MA和AZD聯(lián)合應(yīng)用具有協(xié)同作用，可更進(jìn)一步降低細(xì)胞生存率。見圖3。

圖3 AZD聯(lián)合應(yīng)用3-MA對(duì)Hep-2細(xì)胞Cleaved Caspase-3和Cleaved PARP的影響

2.4AZD聯(lián)合應(yīng)用3-MA對(duì)Hep-2細(xì)胞凋亡通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響 當(dāng)Hep-2細(xì)胞經(jīng)不同藥物組處理24 h后，3-MA組與對(duì)照組相比，Cleaved Caspase-3和Cleaved PARP表達(dá)水平?jīng)]有明顯改變。而3-MA與AZD聯(lián)用組與單用AZD組比較，Cleaved Caspase-3和Cleaved PARP表達(dá)水平明顯增加。同樣，3-MA組的細(xì)胞色素C表達(dá)水平與對(duì)照組相比無(wú)明顯改變，而3-MA與AZD聯(lián)用組與單用AZD組比較，細(xì)胞色素C表達(dá)水平顯著增加。結(jié)果表明，聯(lián)合應(yīng)用3-MA可以明顯增加AZD引起的人喉癌細(xì)胞Hep-2細(xì)胞凋亡。見圖4。

圖4 AZD聯(lián)合應(yīng)用3-MA對(duì)Hep-2細(xì)胞色素C的影響

3討論

mTOR蛋白激酶發(fā)揮調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)，增殖，代謝和血管生成作用主要涉及PI3K/Akt信號(hào)通路〔9〕，而且普遍認(rèn)為PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路在癌癥發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用。諸多研究顯示該信號(hào)通路在多種類型的癌癥異常激活，它也因此在惡性腫瘤的治療方面成為了一個(gè)潛在的治療靶點(diǎn)〔10，11〕。本研究發(fā)現(xiàn)mTOR抑制劑AZD8055能增加Hep-2細(xì)胞色素C釋放增加，激活Caspase-3，誘導(dǎo)Hep-2細(xì)胞凋亡。該結(jié)果提示mTOR抑制劑具有明顯的腫瘤治療作用。細(xì)胞自噬可為腫瘤細(xì)胞提供能量，也促進(jìn)腫瘤細(xì)胞死亡。激活mTOR及其上游信號(hào)分子能誘導(dǎo)細(xì)胞自噬的產(chǎn)生。ADZ8055為三磷酸腺苷(ATP)競(jìng)爭(zhēng)性mTOR激酶抑制劑，能同時(shí)抑制mTORC1和mTORC2，Chresta等〔12〕發(fā)現(xiàn)聯(lián)合應(yīng)用細(xì)胞自噬抑制劑E64d和亮肽素，可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，且抑制細(xì)胞增殖的效果更顯著。同樣發(fā)現(xiàn)自噬抑制劑3-MA與AZD8055聯(lián)合應(yīng)用對(duì)Hep-2細(xì)胞系的誘導(dǎo)凋亡作用更加顯著。因此本研究為自噬抑制劑和mTOR抑制劑聯(lián)合應(yīng)用治療喉癌提供了理論基礎(chǔ)，同時(shí)也對(duì)尋找與研發(fā)新型靶向抗腫瘤藥物提供了新的思路。

1 吳躍煌，王曉云.喉癌的流行病學(xué)及發(fā)病機(jī)制〔J〕.國(guó)外醫(yī)學(xué)·衛(wèi)生學(xué)分冊(cè)，1999;26(3):143-6.

2 Cattaruzza MS，Maisonneuve P，Boyle P.Epidemiology of laryngeal cancer〔J〕.Eur J Cancer Oral Oncol，1996;32(5):293-305.

3 Wullschleger S，Loewith R，Hall MN.Tor signaling in growth and metabolism〔J〕.Cell，2006;124(3):471-84.

4 Liu Q，Thoreen C，Wang J，et al.Mtor mediated anti-cancer drug discovery〔J〕.Drug Disco Today Ther Strateg，2009;6(2):47-55.

5 Faivre S，Kroemer G，Raymond E.Current development of mtor inhibitors as anticancer agents〔J〕.Nat Rev Drug Discov，2006;5(8):671-88.

6 Stoffel A.Targeted therapies for solid tumors〔J〕.Biodrugs，2010;24(5):303-16.

7 Roy S，Debnath J.Autophagy and tumorigenesis〔J〕.Semin Immunopathol，2010;32(4):383-96.

8 Moreau K，Luo S，Rubinsztein DC，et al.Roles for autophagy〔J〕.Curr Opin Cell Biol，2010;22(2):206-11.

9 Fasolo A，Sessa C.Targeting MTOR pathways in human malignancies〔J〕.Curr Pharm Des，2012;18(19):2766-77.

10 Grzybowska-izydorczyk O，Smolewski P.MTOR kinase inhibitors as a treatment strategy in hematological malignancies〔J〕.Future Med Chem，2012;4(4):487-504.

11 Diaz-padilla I，Duran I，Clarke BA，et al.Biologic rationale and clinical activity of MTOR inhibitors in gynecological cancer〔J〕.Cancer Trea Rev，2012;38(6):767-75.

12 Chresta CM，Davies BR，Hickson I，et al.Azd8055 is a potent，selective，and orally bioavailable Atp-competitive mammalian target of rapamycin kinase inhibitor with in vitro and in vivo antitumor activity〔J〕.Cancer Res，2010;70(1):288-98.