連孟洋，王 昕，彭 博，武偉華，劉 慧，董方圓，丁小滿，房師松，鄭 青

2.深圳市疾病預(yù)防控制中心，深圳 518055；

3.中山大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，廣州 510080

當(dāng)今世界處于后流感大流行期，甲型流感病毒在大范圍內(nèi)季節(jié)性傳播，并感染包括人、禽類等多個(gè)物種，故世界各地都積極致力對(duì)此病毒的研究。甲型流感病毒是單股負(fù)鏈分節(jié)段的RNA病毒，病毒基因組約13.6kb，分為8個(gè)大小不等的獨(dú)立片段，攜帶至少13種病毒蛋白[1]。流感病毒基因組RNA含多個(gè)開放閱讀框，并與3′和5′端非編碼區(qū)相連[2]。近年來，負(fù)鏈RNA病毒的基因操作基于反向遺傳學(xué)技術(shù)獲得突破性進(jìn)展，同時(shí)流感病毒反向遺傳學(xué)研究也在其生命周期等方面取得很大進(jìn)展[3]。就甲型流感病毒而言，Luytjes和 Enami等[4－5]建立基于體外重組核糖核蛋白復(fù)合體（vRNPs）轉(zhuǎn)染輔助病毒感染性細(xì)胞的反向遺傳學(xué)系統(tǒng)，vRNPs是由體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的RNA及純化的病毒核蛋白（NP）和聚合酶蛋白（PB1，PB2和PA）孵育而成。輔助病毒則可作為病毒核蛋白和聚合酶蛋白的來源以幫助vRNPs在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制。隨后，Zobel等[6]和 Neumann等[7]提出依賴 RNA 聚合酶I的體內(nèi)合成vRNA的反向遺傳學(xué)系統(tǒng)，成功獲得流感病毒cDNA 的精確復(fù)制[7]。1996年，Pleschka等[8]提出不依賴輔助病毒的反向遺傳學(xué)系統(tǒng)—利用人RNA聚合酶I啟動(dòng)子及丁型肝炎病毒基因組核糖酶來完成反向遺傳操作。同年，Lutz等[9]得出甲型流感病毒表達(dá)報(bào)告基因可作為檢測(cè)和定量病毒復(fù)制的工具。隨后，Neumann等[10]同樣不依賴輔助病毒，利用12個(gè)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，在人RNA聚合酶Ⅰ啟動(dòng)子、小鼠RNA聚合酶Ⅰ終止子以及RNA聚合酶Ⅱ的調(diào)控下，成功包裝 A／WSN／33（H1N1）病 毒 粒 子。Hoffmann 等[11]在 Neumann[10]，F(xiàn)odor[12]等研究成果的基礎(chǔ)上于2000年建立了基于8質(zhì)粒的雙向RNA聚合酶Ⅰ／聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)，此系統(tǒng)允許甲型流感病毒基于8個(gè)質(zhì)粒拯救其子代病毒，使所需質(zhì)粒數(shù)量由12／17降低到8，減少其所需時(shí)間及成本，促進(jìn)雙向的反向遺傳學(xué)系統(tǒng)的發(fā)展。

本研究基于甲型流感病毒H1N1分離株A／Puerto Rico／8／34的基因組，分別構(gòu)建依賴輔助病毒和宿主細(xì)胞內(nèi)合成vRNPs的反向遺傳學(xué)操作系統(tǒng)，并嘗試?yán)蒙鲜鰞上到y(tǒng)表達(dá)EGFP，為本課題后期反向遺傳學(xué)系統(tǒng)的建立提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒毒株 人源流感病毒 A／Puerto Rico／8／34（H1N1），由深圳市疾病預(yù)防與控制中心提供。

1.1.2 載體 克隆載體 pBluescript II sk（＋）（Takara公司），pcDNA3.1（＋）（Invitrogen公司）。

1.1.3 大腸桿菌菌種和細(xì)胞系 大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞 （Takara公司）；MDCK細(xì)胞，293T細(xì)胞，由深圳市疾病預(yù)防與控制中心提供。

1.1.4 引物

1.1.4.1 構(gòu)建POL I系統(tǒng)（pBluescript II sk（＋）－tI－EGFP－PIh），設(shè)計(jì)引物見表1。

1.1.4.2 構(gòu)建表達(dá)載體 pcDNA3.1－PB2 、pcDNA3.1－PB1、pcDNA3.1－PA、pcDNA3.1－NP 設(shè) 計(jì)引物見表2。

表1 構(gòu)建pBluescript II sk（＋）－tI－EGFP－PIh載體的引物Tab.1 Primers for pBluescript II sk（＋）－tI－EGFP－PIh

上述引物均合成于Takara公司。

1.1.5 主要試劑 PCR擴(kuò)增試劑盒（Takara公司），質(zhì)粒DNA抽提純化試劑盒（Takara公司），T4 DNA連接酶（Takara公司），PCR產(chǎn)物回收試劑盒（QIAGEN公司），膠回收試劑盒（QIAGEN公司），無內(nèi)毒素的質(zhì)粒DNA抽提純化試劑盒（QIAGEN公司），限制性內(nèi)切酶 HindIII、XhoI、BamhI、NotI、XbaI（NEB 公 司 ），轉(zhuǎn) 染 試 劑 盒 Lipofectamine2000（Invitrogen 公 司 ），細(xì) 胞 培 養(yǎng) 基DMEM（Gibco公司）、Opti－MEM（Gibco公司），胎牛血清FBS（Gibco公司），雙抗青霉素、鏈霉素（Invitrogen公司），EDTA 胰酶（Gibco公司），TPCK處理胰酶（Gibco公司）。

表2 構(gòu)建pcDNA3.1－PB2、pcDNA3.1－PB1、pcDNA3.1－PA、pcDNA3.1－NP載體的引物Tab.2 Primers for pcDNA3.1－PB2 、pcDNA3.1－PB1、pcDNA3.1－PA、pcDNA3.1－NP

1.2 方法

1.2.1 載體的構(gòu)建

1.2.1.1 POL I系統(tǒng)（pBluescript II sk（＋）－tI－EGFP－PIh）的構(gòu)建 經(jīng)文獻(xiàn)所述，因鼠源聚合酶I終止子序列末端6個(gè)腺嘌呤（A）堿基的差異[13]，在此設(shè)計(jì)兩個(gè)POL I系統(tǒng)（POL I系統(tǒng)1和POL I系統(tǒng)2）。

為了構(gòu)建POL I系統(tǒng)，首先利用聚合酶I元件引物擴(kuò)增聚合酶I元件1和2序列，然后分別使用相應(yīng)的引物將人POL I啟動(dòng)子PIh、鼠的終止子tI及EGFP基因克隆出，隨后基于嵌合引物合成tI－EGFP－PIh基因片段，最后經(jīng)限制性內(nèi)切酶Hind III和Xho I酶切，T4DNA連接酶連接，將其克隆至pBluescript II sk（＋）載體。

1.2.1.2 表達(dá)載體pcDNA3.1－PB2 、pcDNA3.1－PB1、pcDNA3.1－PA、pcDNA3.1－NP的構(gòu)建 PB2、PB1、PA、NP基因的cDNA和載體pcDNA3.1經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切，連接獲得重組質(zhì)粒pcDNA3.1－PA 、pcDNA3.1－PB1、pcDNA3.1－PB2、pcDNA3.1－NP。

上述所有重組質(zhì)粒均經(jīng)過菌液PCR、雙酶切鑒定和測(cè)序分析以保證載體的正確。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

1.2.2.1 MDCK細(xì)胞轉(zhuǎn)染 MDCK細(xì)胞在25m2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中長(zhǎng)至90%左右，用預(yù)溫的PBS液洗3次，EDTA胰酶消化細(xì)胞并按照1∶10的比例鋪6孔細(xì)胞培養(yǎng)板。待細(xì)胞密度為80%～90%時(shí)，用PBS液洗3次，將培養(yǎng)基換為病毒接種液，隨后用10μL流感病毒H1N1毒株（血凝價(jià)為1∶4）感染細(xì)胞。感染2h后，用PBS液洗3次，按照Lipofectamine 2000說明書進(jìn)行操作，將純化質(zhì)粒pBluescript II sk（＋）－tI－EGFP－PIh－1和 pBluescript II sk（＋）－tI－EGFP－PIh－2分別轉(zhuǎn)染至 MDCK細(xì)胞中。

1.2.2.2 293T細(xì)胞轉(zhuǎn)染 293T細(xì)胞在25m2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中長(zhǎng)至90%左右，用PBS液洗3次，按照1∶6的比例鋪6孔細(xì)胞培養(yǎng)板。待細(xì)胞密度為80－85%時(shí)，用 PBS液 洗3次，按 照 Lipofectamine2000說明書進(jìn)行操作，將純化質(zhì)粒pcDNA3.1－PB2 、pcDNA3.1－PB1、pcDNA3.1－PA、pcDNA3.1－NP 與 pBluescript II sk（＋）－tI－EGFPPIh－1／2分別共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞。

2 結(jié) 果

2.1 POL I系統(tǒng)（pBluescript II sk（＋）－tI－EGFPPIh）的構(gòu)建 研究構(gòu)建的 pBluescript II sk（＋）－tI－EGFP－PIh載體的示意圖，見圖1。

圖1 pBluescript II sk（＋）－tI－EGFP－PIh載體的示意圖Fig.1 Schematic diagram of pBluescript II sk（＋）－tI－EGFPPIh.

2.2 表達(dá)載體pcDNA3.1－PB2 、pcDNA3.1－PB1、pcDNA3.1－PA、pcDNA3.1－NP的構(gòu)建，見圖2。

2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

2.3.1 依賴于輔助病毒的轉(zhuǎn)染，見圖3。

轉(zhuǎn)染時(shí)，需先用流感病毒 H1N1（血凝價(jià)為1∶4）感染MDCK細(xì)胞2h，隨后將含有POL I系統(tǒng)的 pBluescript II sk（＋）－tI－EGFP－PIh－1／2 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染MDCK細(xì)胞，同時(shí)，分別將pEGFP－N1和pBluescript II sk（＋）質(zhì)粒轉(zhuǎn)染MDCK細(xì)胞作為陽(yáng)性和陰性對(duì)照。轉(zhuǎn)染后12h，用熒光顯微鏡觀察到細(xì)胞開始出現(xiàn)熒光，在轉(zhuǎn)染48h時(shí)，熒光最強(qiáng)。同時(shí)，分別經(jīng) pBluescript II sk（＋）－tI－EGFP－PIh－1和pBluescript II sk（＋）－tI－EGFP－PIh－2轉(zhuǎn)染的兩組細(xì)胞，其熒光強(qiáng)度沒有明顯差別，見圖4。

圖2 pcDNA3.1－PB2 、pcDNA3.1－PB1、pcDNA3.1－PA、pcDNA3.1－NP表達(dá)載體的示意圖Fig.2 Schematic diagram of expression vectors－－－ pcDNA3.1－PB2、pcDNA3.1－PB1、pcDNA3.1－PA、pcDNA3.1－NP.

圖3 依賴于輔助病毒的POL I系統(tǒng)轉(zhuǎn)染示意圖Fig.3 Schematic diagram of transfection that POLI system relying on helper virus.

2.3.2 依賴宿主細(xì)胞內(nèi)合成RNPs的轉(zhuǎn)染，見圖5。

將表達(dá)載體pcDNA3.1－PB2、pcDNA3.1－PB1、pcDNA3.1－PA、pcDNA3.1－NP與 POL I系統(tǒng)質(zhì)粒pBluescript II sk（＋ ）－tI－EGFP－PIh－1／2 共 轉(zhuǎn) 染293T細(xì)胞，同時(shí)，分別設(shè)pEGFP－N1轉(zhuǎn)染陽(yáng)性對(duì)照組和pBluescript II sk（＋）轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照組。轉(zhuǎn)染12h后，在熒光顯微鏡下可觀察到熒光現(xiàn)象，細(xì)胞培養(yǎng)至48h時(shí)，熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)。與上組依賴輔助病毒的轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)相同，分別經(jīng)POL I系統(tǒng)pBluescript II sk（＋）－tI－EGFP－PIh－1和 pBluescript II sk（＋）－tI－EGFP－PIh－2 轉(zhuǎn) 染 的 兩 組 細(xì) 胞，其 熒 光 強(qiáng) 度均較低，見圖6。

上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：依賴輔助病毒和依賴宿主細(xì)胞內(nèi)合成RNPs的轉(zhuǎn)染系統(tǒng)均可使外源基因EGFP在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)。

圖4 依賴輔助病毒的POL I系統(tǒng)轉(zhuǎn)染MDCK細(xì)胞48h的綠色熒光蛋白表達(dá)Fig.4 The expression of Green Fluorescent protein at 48h post－transfection that POLI system based upon helper virus－infection.

圖5 依賴宿主細(xì)胞內(nèi)合成vRNPs的轉(zhuǎn)染Fig.5 The transfection of virus ribonucleoprotein complex（vRNPs）that synthetised in the host cell.

3 討 論

流感病毒等負(fù)鏈RNA病毒因其RNA為負(fù)極性，故其vRNA對(duì)細(xì)胞不具感染性。對(duì)流感病毒而光強(qiáng)度較弱，其原因可能與轉(zhuǎn)染效率有關(guān)，因五個(gè)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞需要五個(gè)質(zhì)粒進(jìn)入同一個(gè)細(xì)胞，此項(xiàng)工作較為困難；并且五質(zhì)粒轉(zhuǎn)染時(shí)所加的轉(zhuǎn)染試劑對(duì)細(xì)胞有很大傷害；同時(shí)與宿主細(xì)胞內(nèi)vRNPs表達(dá)效率有關(guān)。綜上所述，依賴輔助病毒或vRNPs的反向遺傳學(xué)操作系統(tǒng)均可驅(qū)動(dòng)外源蛋白的表達(dá)，促進(jìn)我們更進(jìn)一步來研究流感病毒的反向遺傳學(xué)。言，最小病毒復(fù)制單位為vRNPs，它由聚合酶蛋白（PB2，PB1，PA）、核蛋白（NP）及vRNA 組成。此vRNPs既可以在細(xì)胞外[4]，亦可在細(xì)胞內(nèi)合成[7]，但最終都進(jìn)入細(xì)胞核，使得流感病毒RNA經(jīng)復(fù)制、轉(zhuǎn)錄為 mRNA、cRNA 及負(fù)鏈vRNA。因此，vRNPs可作為病毒復(fù)制的前提，使得病毒蛋白在其基礎(chǔ)上表達(dá)。

圖6 vRNPs系統(tǒng)轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞48小時(shí)的綠色熒光蛋白表達(dá)Fig.6 The expression of Green Fluorescent protein at 48h post－transfection that vRNPs system.

本研究構(gòu)建了依賴輔助病毒和宿主細(xì)胞內(nèi)合成核糖核蛋白復(fù)合體兩個(gè)反向遺傳學(xué)操作系統(tǒng)，并在其基礎(chǔ)上表達(dá)外源綠色熒光蛋白。在實(shí)驗(yàn)中，兩個(gè)反向遺傳學(xué)操作系統(tǒng)均可使綠色熒光蛋白表達(dá)，在熒光顯微鏡下均可觀察到熒光的發(fā)生，由此說明：本實(shí)驗(yàn)所構(gòu)建的聚合酶I系統(tǒng)在驅(qū)動(dòng)外源蛋白在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)上是有效的。從圖片顯示，兩個(gè)轉(zhuǎn)染系統(tǒng)的熒光強(qiáng)度不高。由于POLI系統(tǒng)中的啟動(dòng)子為人RNA聚合酶I啟動(dòng)子，且RNA聚合酶I轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)具有種屬特異性，但基于高等哺乳動(dòng)物RNA POLI啟動(dòng)子亦可推動(dòng)低等哺乳動(dòng)物RNA轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)的理論[14]，本研究中兩個(gè)反向遺傳學(xué)系統(tǒng)均可驅(qū)動(dòng)EGFP轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)。同時(shí)，本實(shí)驗(yàn)所構(gòu)建的POLI系統(tǒng)中的啟動(dòng)子序列前加有增強(qiáng)子，因此在宿主細(xì)胞中POLI系統(tǒng)的轉(zhuǎn)錄效率應(yīng)較高，對(duì)熒光強(qiáng)度的影響較小。在依賴輔助病毒的轉(zhuǎn)染系統(tǒng)中，熒光強(qiáng)度不高的原因主要有：脂質(zhì)體2000對(duì)MDCK細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率本就不高，轉(zhuǎn)染試劑亦對(duì)細(xì)胞有損傷；此外，因輔助病毒滴度較低，其對(duì)MDCK的感染效率也是一個(gè)因素。在細(xì)胞內(nèi)合成vRNPs的轉(zhuǎn)染體系中，熒

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