李水秀，宋延君，石建萍，2，郭 慧，張玲玲，張 宏

2.廣州醫(yī)學(xué)院附屬深圳沙井醫(yī)院皮膚科，深圳 518000

近年來，侵襲性曲霉病仍然是免疫功能低下者發(fā)病和死亡的一個重要的原因，其主要由煙曲霉引起[1]。三唑類藥物是治療曲霉病的首選藥物[2]，但隨著其廣泛、長期使用，煙曲霉對其的耐藥率逐年上升[3－5]。因此，新型治療方案的提出已成為迫切需要解決的問題。不同作用機制的抗真菌藥物聯(lián)合應(yīng)用已成為新型治療方案[6]。漢防己甲素（tetrandrine，TET）是從天然藥用植物中提取的一種雙芐基異喹啉類生物堿，我們已證明其對氟康唑等 唑類抗真菌藥物在體內(nèi)外抗作為酵母菌代表的白念珠菌 有顯著增效活性，其增效機制與抑制藥物外排泵以及下調(diào)外排泵相關(guān)基因的表達有關(guān)[7－9]。本實驗以煙曲霉作為深部感染的絲狀真菌代表，進一步研究最大非細胞 毒性劑量的TET在體外對 伊曲康唑（itraconazole，ITR）、伏立康唑（voriconazole，VRC）和泊沙康唑（posaconazole，PCZ）抗煙曲霉的增效活性，為臨床上以TET作為三唑類藥物增效劑治療煙曲霉病提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株和主要試劑

1.1.1 菌株 23株煙曲霉（AF5，AF7，AF8，AF9，AF10，AF13，AF17、AF18，AF19，AF20，AF21，AF23，AF24，AF26，AF27，AF29，AF30，AF31，AF38，AF46，0193，CBS，CMCC），前20株和來自廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院臨床株，后3株由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院皮膚病研究所惠贈。質(zhì)控菌株選用美國臨床和試驗標準協(xié)會（CLSI）推薦的近平滑念珠菌 ATCC 22019。

1.1.2 主要試劑 ITR（梯希愛化成工業(yè)發(fā)展有限公司，批號I0732，純度＞98.0%）。VRC（山東華禧藥業(yè)有限公司，批號20110510，純度＞98.5%）。PCZ（大連美侖生物技術(shù)有限公司，批號20130210，純度＞99.0%）。TET（陜西慧科植物有限公司，批號20041226，純度＞98.0% ）。RPMI 1640液體培養(yǎng)基（Gibco，USA，pH7.0）。

1.2 方法

1.2.1 菌懸液制備 將受試菌株于PDA中37。C活化5～7天，用含有1%Tween 80的無菌生理鹽水將煙曲霉孢子洗脫，并用RPMI 1640將其調(diào)整至工作濃度，菌液新鮮制備[10]。

1.2.2 TET對23株煙曲霉孢子相的最大非細胞毒性劑量測定 參照 M38－A方案的微量稀釋法[11]。96孔板的第1～10孔內(nèi)分別加入100μL倍比稀釋的TET（終濃度為終濃度為0.625μg／mL～320μg／mL）和100μL受試菌液（終濃度為5×103CFU／mL）。陰性對照孔加入200μL的 RPMI 1640，正常生長對照孔加入100μL RPMI 1640和100μL受試菌液，混勻，37。C培養(yǎng)48h，以視覺法和OD值測定法判讀結(jié)果。用RPMI 1640稀釋后臺盼藍染色，利用細胞計數(shù)板計數(shù)，觀察細胞形態(tài)并計算存活率。與正常生長對照孔比較，菌的存活率≥95%時認為該濃度為TET的最大非細胞毒性劑量。實驗重復(fù)3次。

1.2.3 ITR、VRC和PCZ單獨及聯(lián)合TET抗煙曲霉活性測定 參照 M38－A方案的微量稀釋法[11]。分 組：ITR／VRC／PCZ 組、ITR／VRC／PCZ 聯(lián) 合TET組。ITR／VRC／PCZ組分別加入100μL倍比稀釋的ITR／VRC／PCZ（終濃度為0.0625μg／mL～64μg／mL）和100μL受試菌液（終濃度為5×103CFU／mL）。ITR／VRC／PCZ聯(lián)合 TET 組分別加入50μL的ITR／VRC／PCZ（終濃度為0.0625μg／mL～64μg／mL）、50μL的TET（終濃度為80μg／mL）和100μL受試菌液（終濃度為5×103CFU／mL）。陰性對照孔加入200μL的RPMI 1640。正常生長對照孔加入100μL RPMI 1640和100μL受試菌液，混勻，37。C培養(yǎng)48h，以視覺法和OD值測定法判讀結(jié)果。實驗重復(fù)3次。

1.2.4 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件的配對t檢驗進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié) 果

2.1 質(zhì)控標準 每次實驗所測得的質(zhì)控菌株ATCC 22019對ITR、VRC和PCZ的MIC值分別為0.125μg／mL～0.5μg／mL、0.0625μg／mL～0.125μg／mL和0.0625μg／mL～0.125μg／mL，均在CLSI M38－A規(guī)定的范圍內(nèi)，說明每次實驗操作準確可靠。

2.2 TET對煙曲霉的非細胞毒性劑量 TET＞80μg／mL時，對煙曲霉有抑制作用，且菌的存活率隨TET濃度的增高而降低。TET≤80μg／mL時，菌的存活率＞95%，視覺法觀察其濁度與正常生長對照孔無差異。故選80μg／mL為TET在體外對ITR、VRC和PCZ抗煙曲霉增效活性的最大非細胞毒性劑量。

2.3 ITR、VRC和PCZ單獨及聯(lián)合TET抗煙曲霉活性 ITR、VRC和PCZ單獨及聯(lián)合TET對23株煙曲霉的MIC值見表1。ITR單獨及聯(lián)合TET的MIC值范圍分別為 0.5μg／mL～32μg／mL 和0.0 625μg／mL～4μg／mL，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；VRC單獨及聯(lián)合TET的MIC值范圍分別為0.25μg／mL～2μg／mL和0.03125μg／mL～0.25μg／mL，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；PCZ單獨及聯(lián)合TET的MIC值范圍分別為0.125μg／mL～1μg／mL 和0.03125μg／mL～0.25μg／mL，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。ITR、VRC和PCZ聯(lián)合TET時，其MIC終點清晰，“拖尾現(xiàn)象”消失。說明最大非細胞毒性劑量的TET在體外對ITR、VRC和PCZ抗煙曲霉有增效活性。

表1 ITR、VRC和PCZ單獨及聯(lián)合TET對23株煙曲霉的MICsTab.1 MICs of ITR，VRC and PCZ alone and in combination with TET

3 討 論

我們前期實驗已證明TET對氟康唑等唑類抗真菌藥物在體外及動物體內(nèi)抗作為酵母菌代表的白念珠菌 有顯著增效活性，其增效機制與其通過影響ATP的產(chǎn)生和轉(zhuǎn)換過程而抑制藥物外排泵對藥物的外排功能和下調(diào)外排泵相關(guān)基因MDR1、FLU1、CDR1、CDR2的表達有關(guān)[7－9，12]。但 TET 對唑類藥物抗深部感染的絲狀真菌 是否有增效活性尚未知。所以，本研究以煙曲霉臨床株作為深部感染的絲狀真菌代表，研究最大非細胞毒性劑量的TET對ITR、VRC和PCZ的體外增效活性。

本實驗發(fā)現(xiàn)：在體外，聯(lián)合TET 80μg／mL后，ITR對煙曲霉MIC值可降低2～5個稀釋度；VTC對煙曲霉MIC值可降低1～4個稀釋度；PCZ對煙曲霉MIC值可降低1～4個稀釋度。可見在體外TET對ITR、VRC和PCZ抗煙曲霉有增效活性。

TET對ITR、VRC和PCZ抗煙曲霉的增效機制尚未知。但我們前期實驗證明的TET對唑類藥物抗白色念珠菌的增效機制與其抑制藥物外排泵和下調(diào)外排泵相關(guān)基因表達有關(guān)[9]。Morschhauser[13]報道，外排泵功能以及其編碼基因的高表達在導(dǎo)致煙曲霉對唑類抗真菌藥物耐藥過程中起了重要作用。由此推測TET對ITR、VRC和PCZ抗煙曲霉的增效機制也可能是通過影響外排泵功能及下調(diào)外排泵相關(guān)基因的表達而起作用。下一步將從基因表達、蛋白表達等方面進行研究。

目前，測定兩種或以上藥物體外聯(lián)合作用的藥敏實驗多采用美國臨床和實驗室標準協(xié)會（CLSI）推薦的棋盤式微量液基稀釋法，其具有客觀、準確地測定和評價兩種或以上藥物聯(lián)合作用是否表現(xiàn)為協(xié)同作用的優(yōu)點。但是，棋盤法不能測定非細胞毒性劑量的藥物A對藥物B抗真菌是否有增效活性，而微量液基稀釋法卻可以測定藥物A對藥物B抗真菌的增效活性。于是，本研究采用CLSI推薦的微量液基稀釋法證明了最大非細胞毒性劑量的TET對ITR、VRC和PCZ在體外 抗煙曲霉有顯著增效活性。

TET來源于天然藥用植物，有著作用溫和、來源廣泛、不良反應(yīng)少、良好的抗真菌藥物增效機制等特點。我們發(fā)現(xiàn)，治療劑量的TET在體外和動物體內(nèi)單獨應(yīng)用時無抗白色念珠菌等真菌活性，但聯(lián)合唑類藥物應(yīng)用時能顯著提高唑類藥物抗白色念珠菌等真菌活性。由于該藥安全、有效且主要作用機制明確，結(jié)合本研究和課題組前期研究，因此，完全可能成為一種有臨床價值的抗真菌藥物增效劑。

（衷心感謝中國科學(xué)院皮膚病研究所劉維達教授和沈永年老師惠贈煙曲霉0193、CBS、CMCC和近平滑念珠菌ATCC 22019，廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院王露霞醫(yī)生惠贈煙曲霉臨床菌株。）

[1]Tashiro M，Izumikawa K，Minematsu A，et al.Antifungal susceptibilities ofAspergillusfumigatusclinical isolates obtained in Nagasaki，Japan[J].Antimicrob Agents Chemother，2012，56（1）：584－587.DOI：10.1128／AAC.05394－11

[2]Denning DW，Hope WW.Therapy for fungal diseases：opportunities and priorities[J].Trends Microbiol，2010，18（5）：195－204.DOI：10.1016／j.tim.2010.02.004

[3]Snelders E，van der Lee HA，Kuijpers J，et al.Emergence of azole resistance inAspergillusfumigatusand spread of a single resistance mechanism[J].PLoS Med，2008，5（11）：e219.DOI：10.1371／journal.pmed.0050219

[4]Howard SJ，Cerar D，Anderson MJ，et al.Frequency and evolution of Azole resistance inAspergillusfumigatusassociated with treatment failure[J].Emerg Infect Dis，2009，15（7）：1068－1076.DOI：10.3201／eid1507.090043

[5]Bueid A，Howard SJ，Moore CB，et al.Azole antifungal resistance inAspergillusfumigatus：2008and 2009[J].J Antimicrob Chemother，2010，65（10）：2116－2118.DOI：10.1093／jac／dkq279

[6]Steinbach WJ，Stevens DA，Denning DW.Combination and sequential antifungal therapy for invasive aspergillosis：review of publishedinvitroandinvivointeractions and 6281clinical cases from 1966to 2001[J].Clin Infect Discc，2003，37Suppl 3：S188－S224.

[7]Li FX，Zhang H，Shan KR，et al.Invitrostudy of the synergistic effect of tetrandrineand fluconazole againstCandidaalbicans[J].Chin Dermatol，2006，39（8）：454－456.DOI：10.3760／j.issn：0412－0430.2006.08.008（in Chinese）李豐霞，張宏.漢防己甲素對氟康唑抗白念珠菌活性的增效作用[J].中華皮膚科雜志，2006，39（8）：454－456.DOI：10.3760／j.issn：0412－0430.2006.08.008.

[8]Wang KL，Zhang H，Jiang HH，et al.Invitrostudy on tetrandrine as a synergist to fluconazole in murine model of vaginal candidiasis[J].Chin J Zoonoses，2007，23（5）：474－478，483.（in Chinese）王凱麗，張宏，姜紅浩，等.漢防己甲素對氟康唑抗白念珠菌活性的增效作用的體內(nèi)實驗研究[J].中國人獸共患病學(xué)報，2007，23（5）：474－478，483.

[9]Zhang H，Gao AL，Li FX，et al.Mechanism of action of tetrandrine，a natural inhibitor ofCandidaalbicansdrug efflux pumps[J].Yakugaku Zasshi，2009，129（5）：623－630.DOI：10.1248／yakushi.129.623

[10]Olson JA，George A，Constable D，et al.Liposomal amphotericin B and echinocandins as monotherapyor sequential or concomitant therapy in murine disseminated and pulmonaryAspergillus fumigatusinfections[J].Antimicrob Agents Chemother，2010，54（9）：3884－3894.DOI：10.1128／AAC.01554－09

[11]Espinel－Ingroff A，Diekema DJ，F(xiàn)othergill A，et al.Wild－type MIC distributions and epidemiological cutoff values for the triazoles and sixAspergillusspp.for the CLSI broth microdilution method（M38－A2document）[J].J Clin Microbiol，2010，48（9）：3251－3257.

[12]Guo H，Xie SM，Li SX，et al.Synergistic mechanism for tetrandrine on fluconazole againstCandidaalbicansthrough the mitochondrial aerobic respiratory metabolism pathway[J].J Med Microbiol，2014，63（Pt 7）：988－996.DOI：10.1099／jmm.0.073890－0

[13]Morschhauser J.Regulation of multidrug resistance in pathogenic fungi[J].Fungal Genet Biol，2010，47（2）：94－106.DOI：10.1016／j.fgb.2009.08.002