陳 雄，韋祎旸，李輝信，梁明祥，徐 莉（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，江蘇 南京 210095）

附著劍菌對三氯聯(lián)苯的吸附及降解機(jī)制研究

陳 雄，韋祎旸，李輝信，梁明祥，徐 莉*（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，江蘇 南京 210095）

實驗研究附著劍菌（Ensifer adhaerens.R2）對持久性有機(jī)污染物三氯聯(lián)苯（2，4，4′-TCB，PCB28）的去除機(jī)制，探究菌株對2，4，4′-TCB的生物吸附和生物降解作用，以及其隨時間、pH值、溫度、菌體密度、金屬離子（Ca2+、Mg2+）的變化.滅活菌體對PCBs的去除機(jī)制為生物吸附，吸附率在2h基本達(dá)到平衡，為85.97%；活體菌株可以通過生物吸附及生物降解作用去除2，4，4′-TCB，在本次實驗周期內(nèi)主要以吸附作用為主，2h吸附率為60.59%，明顯高于降解率的12.90%.單因素條件下，pH值為6.0、35℃、OD為0.8、添加1mol/L的Ca2+、Mg2+處理可使活菌對2，4，4′-TCB的吸附達(dá)到最優(yōu)；pH值為7.5，30℃，添加0.05mol/L的Ca2+、Mg2+處理可使活菌對2，4，4′-TCB的降解達(dá)到最優(yōu).

附著劍菌；三氯聯(lián)苯；生物吸附；生物降解

多氯聯(lián)苯（PCBs）是存在于環(huán)境中的一類具有“三致”效應(yīng)的持久性有機(jī)污染物，由于廣泛存在，且威脅著人類健康，引起各國政府、學(xué)術(shù)界、工業(yè)界和公眾的關(guān)注.

我國大部分水體的PCBs污染水平較低，然而也有部分地區(qū)的水環(huán)境中存在嚴(yán)重的PCBs污染，如珠江、大連灣、松花江等均有較高的PCBs污染存在［1］.常規(guī)凈水工藝在應(yīng)對水源中有機(jī)污染時，顯得處理能力不足.生物修復(fù)以其環(huán)境破壞小、經(jīng)濟(jì)效益高、技術(shù)簡便可行等優(yōu)點，成為最具有潛力的污染修復(fù)方法之一［2］.

目前已有許多利用微生物去除有機(jī)污染的研究，許多高效PCBs修復(fù)菌株被發(fā)現(xiàn)，真菌如白腐真菌（ligninolytic fungi）；細(xì)菌如伯克霍爾德式菌（Burkholderia）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、紅球菌屬（Rhodococcus）［3-5］.在劍菌（或稱中華根瘤菌）方面，Bae等［6］報道了根瘤菌有耐受并轉(zhuǎn)化廣譜芳香烴化合物的能力，并且根瘤菌可與植物聯(lián)合修復(fù)PCBs污染土壤［7-9］，徐莉等［10］也發(fā)現(xiàn)苜蓿根瘤菌對低氯代多氯聯(lián)苯及混合PCBs有較好的修復(fù)效果.但對于微生物去除PCBs的機(jī)制研究還不多［4］，有對海洋青霉真菌去除PCBs的機(jī)制研究，得到菌體可通過吸附作用、共代謝降解作用，實現(xiàn)對PCBs的去除，其中吸附作用是有效去除的主導(dǎo)因素［11］.而在微生物去除有機(jī)污染物機(jī)制中，除了吸附作用外，也有生物降解作用，有研究表明白腐真菌對多環(huán)芳烴的去除，在短期內(nèi)主要為生物吸附作用，隨著培養(yǎng)時間的延長，菌體的對多環(huán)芳烴的生物降解作用日益加強(qiáng)［12］.

基于本實驗室獲得的具有2，4，4′-TCB單體去除能力的附著劍菌（Ensifer adhaerens. R2）作為主體，探究其去除機(jī)制，為進(jìn)一步研發(fā)PCBs污染水體的修復(fù)技術(shù)提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料與培養(yǎng)基

供試菌株:劍菌為本實驗室所有，經(jīng)鑒定為附著劍菌（Ensifer adhaerens），命名為R2，2h活菌和滅菌處理對20mg/L的2，4，4′-TCB去除率分別可達(dá)73.28%、91.47%.標(biāo)準(zhǔn)品2，4，4′-TCB購于北京百靈威化學(xué)技術(shù)有限公司.丙酮與正己烷為色譜純，其他試劑均為分析純.

甘露醇酵母汁瓊脂培養(yǎng)基（YMA）組成:甘露醇10.0g，磷酸氫二鉀（K2HPO4） 0.5g，硫酸鎂（MgSO4·7H2O） 0.2g，氯化鈉 （NaCl）0.1g，酵母汁（1%）100mL，蒸餾水900mL，固體培養(yǎng)基中加入15.0g/L瓊脂粉.

磷酸緩沖液（PBS）母液組成:0.2mol/L磷酸氫二鈉（Na2HPO4）:71.6g溶于蒸餾水定容至1L；0.2mol/L磷酸二氫鈉（NaH2PO4）:31.2g溶于蒸餾水定容至1L.

表1 不同pH值的PBS的配制Table 1 Preparation of PBS of different pH

1.2 附著劍菌的發(fā)酵培養(yǎng)

將菌種接種于YMA固體平板上30℃活化48h，挑取單菌落接入3mL液體種子YMA試管培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)，然后以1%的接種量（M/V）再次轉(zhuǎn)接到50mL YMA液體培養(yǎng)基中30℃、180r/min培養(yǎng)24h.

1.3 附著劍菌去除2，4，4′-TCB的機(jī)制研究

將發(fā)酵培養(yǎng)的菌懸液（此時OD為1.3）離心（12000r/min、5min），收集菌體，用pH7.0的0.05mol/L 磷酸緩沖液（PBS）洗滌兩次后重懸，將菌體轉(zhuǎn)接入含有20mg/L的2，4，4′-TCB的PBS中，調(diào)整菌體OD值為0.8，30℃、180r/min搖床培養(yǎng)，設(shè)置活菌和滅菌兩組處理.測定計算轉(zhuǎn)化0.1、1、2、4、8、18、24h后2，4，4′-TCB的去除率、吸附率、降解率.

1.4 不同條件影響下附著劍菌對PCBs的生物吸附和生物降解作用

菌體離心、洗滌、用PBS重懸后，轉(zhuǎn)接入以20mg/L的2，4，4′-TCB的PBS中，180r/min轉(zhuǎn)化2h，選取pH值、溫度、OD值、金屬離子濃度四因素進(jìn)行實驗（如表2），考察其對菌株R2去除、吸附、降解2，4，4′-TCB的影響.

表2 實驗因素與水平Table 2 Factors and levels of design

1.5 2，4，4′-TCB的提取和測定

菌株與2，4，4′-TCB加入到緩沖體系后，在設(shè)定的采樣時間，全部菌液離心（3500r/min，10min），分別收集上清和菌體，用2倍體積的正己烷萃取，渦旋5min，靜置1h，吸取兩者上層清液，過0.22μm的濾膜，置于棕色進(jìn)樣瓶待測.

采用帶有電子俘獲檢測器和自動進(jìn)樣的Thermo AS3000型氣相色譜儀分析.色譜柱:DB-1701（30m × 0.25mm × 0.25μm），進(jìn)樣溫度為260℃，檢測器溫度為300℃.程序升溫:初始溫度為120℃，0.5min，10℃/min梯度升溫至180℃，持續(xù)1min，然后15℃/min梯度升溫至250℃，持續(xù)25min.無分流進(jìn)樣1μL，載氣為高純氮，流速1.0mL/min.

1.6 數(shù)據(jù)處理方法

活菌去除率（%）=［（空白樣中PCBs含量-上清中PCBs含量）/空白樣中PCBs含量］×100%

活菌吸附率（%）=［菌體中PCBs含量/空白樣中PCBs含量］×100%

活菌降解率（%）=活菌去除率（%）-活菌吸附率（%）

滅菌去除率（%）=［（空白樣中PCBs含量-上清中PCBs含量）/空白樣中PCBs含量］×100%

滅菌吸附率（%）=［（空白樣中PCBs含量-上清中PCBs含量）/空白樣中PCBs含量］×100%

采用SPSS 20.0統(tǒng)計分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析及差異顯著性檢驗；采用Origin8.0進(jìn)行繪圖.

2 結(jié)果與分析

2.1 附著劍菌對2，4，4′-TCB的生物吸附和生物降解作用

由圖1可見在24h內(nèi)，滅菌處理中去除率和菌體吸附率一致，并在實驗時間范圍內(nèi)保持穩(wěn)定，說明生物吸附是滅活菌體去除溶液2，4，4′-TCB的唯一途徑.活菌處理下生物吸附和生物降解作用同時存在，且菌株的吸附率高于降解率，說明菌體在短期內(nèi)主要發(fā)揮的是吸附作用［13］.

滅菌處理的去除率明顯高于活菌對照，這與Binupriya等［14］的研究結(jié)果相同，這主要可能是由于細(xì)胞經(jīng)高溫高壓滅菌后，細(xì)胞壁破碎，使得更多的細(xì)胞表面官能團(tuán)被暴露，出現(xiàn)更多的結(jié)合位點，顯著提高了吸附性能［15-17］.

隨著時間的延長，2，4，4′-TCB去除率、菌體吸附率、2，4，4′-TCB降解率均呈先快速上升后平穩(wěn)的趨勢，在添加2，4，4′-TCB 6min后，活菌和滅菌處理的去除率分別達(dá)46.89%和82.14%，2h基本達(dá)到平衡，此時活菌處理的去除率、吸附率、降解率分別達(dá)73.28%、60.59%，16.09%，滅菌處理的去除率為91.47%，菌體吸附在短時間（2h）即可達(dá)到較高的吸附率與葉錦韶等［18］報道的菌體對有機(jī)物三苯基錫吸附的研究結(jié)果相似.推測菌體的吸附作用與根瘤菌細(xì)胞壁上的脂多糖（LPS）及一些胞外產(chǎn)物中的莢膜多糖（CPS），蛋白質(zhì)和糖醛酸等聚復(fù)合體有關(guān)，這些物質(zhì)表面存在豐富的官能團(tuán)（羧基、氨基、羥基、磷酸基等），為PCBs提供了結(jié)合位點，使其易于吸附水體中的PCBs［17，19-22］.

圖1 附著劍菌R2對2，4，4′-TCB的生物吸附和生物降解隨時間的變化Fig.1 Effect of time on the contributions of biosorption and biodegradation in removal of 2，4，4′-TCB by E. adhaerens

2.2 pH值影響下附著劍菌R2對2，4，4′-TCB的生物吸附和生物降解作用

由圖2可見，不同pH值條件下R2活菌的吸附率總體高于降解率.其中吸附率隨pH值升高呈先下降后逐漸平穩(wěn)的趨勢，6.0為最優(yōu)pH值，此時吸附率為56.17%.這可能是由于pH值是影響生物吸附的重要因素之一，通常，它可以通過影響吸附劑及有機(jī)物的溶解性、電荷狀況，對結(jié)合點位及靜電作用為主要機(jī)制的吸附過程的影響尤為明顯，pH 值對吸附的影響主要通過改變吸附質(zhì)與吸附劑表面電性，進(jìn)而影響二者間的靜電作用來實現(xiàn)的［23］，因為2，4，4′-TCB的分子結(jié)構(gòu)與性質(zhì)不會隨pH值變化而明顯變化，所以可能是pH6.0的環(huán)境更易于菌體表面的酸性多糖發(fā)揮活性從而促進(jìn)吸附.Fu等［24］利用黑曲霉吸附剛果紅的實驗也出現(xiàn)了相同的結(jié)果，即在pH6.0時展現(xiàn)了最好的吸附效率.降解率隨pH值升高呈上升趨勢，最高可達(dá)19.45%，可能是中性環(huán)境更易于菌體的生長和相關(guān)的降解酶發(fā)揮活性的緣故.

圖2 pH值對附著劍菌R2對2，4，4′-TCB的生物吸附和生物降解的影響Fig.2 Effect of pH on the contributions of biosorption and biodegradation in removal of 2，4，4′-TCB by E. adhaerens

2.3 溫度影響下附著劍菌對2，4，4′-TCB的生物吸附和生物降解作用

圖3 溫度對附著劍菌對2，4，4′-TCB的生物吸附和生物降解的影響Fig.3 Effect of temperature on the contributions of biosorption and biodegradation in removal of 2，4，4′-TCB by E. adhaerens

由圖3可見，隨著溫度的升高，去除率呈先上升后略微降低的趨勢，最高可達(dá)69.06%，吸附率同樣明顯高于降解率.吸附率隨溫度升高呈上升趨勢，最高分別可達(dá)57.34%.這可能因為在此溫度范圍內(nèi)菌體的吸附為吸熱過程，溫度升高更利于吸附反應(yīng)的進(jìn)行［16］.降解率隨溫度升高呈下降趨勢，可能是因為微生物對污染物的降解是一種酶促降解過程，溫度的變化直接影響降解酶的活性，高溫對酶活有一定的抑制作用.

2.4 OD值影響下附著劍菌對2，4，4′-TCB的生物吸附和生物降解作用

圖4 OD對附著劍菌對2，4，4′-TCB的生物吸附和生物降解的影響Fig.4 Effect of OD on the contributions of biosorption and biodegradation in removal of 2，4，4′-TCB by E. adhaerens

由圖4可見，隨著菌體的增加，2，4，4′-TCB去除率呈上升而后逐漸平穩(wěn)的趨勢，活菌的吸附率高于降解率；吸附率及去除率均隨OD值增加呈先升高后平穩(wěn)的趨勢，最高分別達(dá)56.99%、70.77%；說明一方面，菌量影響污染物的去除和吸附，這與Sreekumar等［25］的結(jié)論是一致的；但吸附作用是有限的，達(dá)到一定程度，吸附效率將不再提高，可能是由于吸附劑的濃度達(dá)到某一特定值后，菌體開始出現(xiàn)堆積，反而導(dǎo)致可用于吸附的凈表面積減少，所以吸附效率沒有上升，程林潔［26］關(guān)于木霉吸附廢水中的鉻的實驗中也出現(xiàn)了類似的現(xiàn)象，實驗所用附著劍菌能夠產(chǎn)生豐富的多糖，多糖易使菌集結(jié)成團(tuán)，影響了菌體有效吸附的面積，所以生物吸附效率在0.2～0.8OD沒有明顯變化.降解率隨OD值增加沒有明顯變化，穩(wěn)定在20%左右，PCBs的降解是酶促降解過程，菌體對污染物有一個適應(yīng)過程和酶活的誘導(dǎo)激活過程，而本實驗所設(shè)置的2h的時間周期可能相對來說較短，所以就是增加菌體密度，降解率也沒有顯著升高.

2.5 金屬離子影響下附著劍菌對2，4，4′-TCB的生物吸附和生物降解作用

從圖5可以看出，添加2種金屬離子處理后，菌體的去除率呈上升趨勢，菌體的吸附率依舊高于降解率，吸附率均隨離子濃度的升高呈升高的趨勢，Mg2+的處理效率高于Ca2+，Mg2+處理后吸附效率最高可達(dá)79.39%，Ca2+處理后吸附效率最高可達(dá)73.00%，這與漆葉瓊等的研究結(jié)果相似［27］，而降解率均隨離子濃度升高呈降低趨勢.可能是由于降解是酶促反應(yīng)過程，有報道認(rèn)為菌體的相關(guān)降解酶（如漆酶、木質(zhì)素過氧化物酶、錳過氧化物酶、聯(lián)苯雙加氧酶等）的活性會受到Ca2+、Mg2+的調(diào)節(jié)，低濃度Ca2+、Mg2+會促進(jìn)酶活性［28］，而在高濃度情況下受到抑制，本實驗條件設(shè)置的濃度可能相對較高，因此出現(xiàn)了抑制現(xiàn)象.關(guān)于鈣鎂對吸附的影響，有報道認(rèn)為Ca2+、Mg2+處理后，菌體多糖的產(chǎn)量會得到提高，從而暴露更對的吸附位點，提高菌體的吸附能力［29］.

圖5 不同濃度Mg2+、Ca2+對附著劍菌吸附2，4，4′-TCB和生物降解的影響Fig.5 Effect of metal ion on the contributions of biosorption and biodegradation in removal of 2，4，4′-TCB by E. adhaerens

3 結(jié)論

3.1 附著劍菌活菌對溶液中PCBs的去除包括生物吸附和生物降解作用，實驗周期內(nèi)生物吸附所占比列更大；劍菌的滅活處理對PCBs的去除機(jī)制為生物吸附，且吸附效率高于活菌處理.

3.2 附著劍菌對PCBs的去除在較短的時間內(nèi)即可達(dá)到平衡，pH值、溫度、OD值、金屬離子處理均能不同程度地影響菌體對PCBs的吸附以及降解作用.活菌對PCBs的吸附效率隨pH升高呈現(xiàn)先降低后平穩(wěn)的趨勢；隨溫度及Ca2+、Mg2+濃度升高呈增大的趨勢，且Mg2+處理效率更高；隨OD值增加呈先升高后平穩(wěn)的趨勢.活菌對PCBs的降解率隨pH值呈先升高后平穩(wěn)的趨勢；隨溫度升高逐漸減小；隨Ca2+、Mg2+濃度升高呈降低的趨勢；降解率隨菌體密度增加無明顯變化.

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Biosorption and biodegradation mechanisms of trichlorobiphenyl by Ensifer adhaerens.

CHEN Xiong， WEI Yi-yang，LI Hui-xin， LIANG Ming-xiang， XU Li*（College of Resources and Environmental Science， Nanjing Agricultural University， Nanjing 210095， China）. China Environmental Science， 2015，25（5）：1423～1428

This study was aimed to investigate the bio-dissipation mechanisms of 2，4，4′-trichlorobiphenyl （2，4，4′-TCB，PCB28） by Ensifer adhaerens， and explore the variation of the biosorption and biodegradation with the changes of time，pH， temperature， optical density， metal ions （Ca2+、Mg2+）. The removal mechanism of 2，4，4′-TCB by dead E. adhaerens was biosorption， the adsorption efficiency reached a plateau after 2h incubation，which was 85.97%. Both biosorption and biodegradation contributed to the removal of 2，4，4′-TCB by live E. adhaerens in water， and in this experimental period biosorption was dominated. The adsorption efficiency and degradation efficiency were 60.59% and 12.90% respectively. The highest adsorption efficiency of live strain was occurring at pH of 6.0， temperature of 35℃， OD of 0.8， cell pretreated with 1mol/L metal ion. The optimal degradation efficient of live strain was under the condition of 7.5pH， 30℃， biomass pretreated with 0.05mol/L metal ion.

Ensifer adhaerens；2，4，4′-trichlorobiphenyl；biosorption；biodegradation

X52，X172

A

1000-6923（2015）05-1423-06

陳 雄（1989-），女，江蘇高郵人，碩士研究生，主要從事土壤生態(tài)及生態(tài)修復(fù)技術(shù)研究.

2014-09-19

江蘇省自然基金（BK2011655）；中國科學(xué)院土壤環(huán)境與污染修復(fù)重點實驗室（南京土壤研究所）開放基金；江蘇省優(yōu)勢學(xué)科項目

* 責(zé)任作者， 副教授， xuli602@njau.edu.cn