趙 飛，王 擺，2，張曉娜，田 華，王 蔚，汝少國*（.中國海洋大學海洋生命學院，山東 青島 266003；2.遼寧省海洋水產(chǎn)科學研究院，遼寧 大連 6023）

久效磷農(nóng)藥對金魚肝細胞DNA的損傷及其機制研究

趙 飛1，王 擺1，2，張曉娜1，田 華1，王 蔚1，汝少國1*（1.中國海洋大學海洋生命學院，山東 青島 266003；2.遼寧省海洋水產(chǎn)科學研究院，遼寧 大連 116023）

以金魚（Carassius auratus）為模式生物，研究了久效磷農(nóng)藥暴露導致的DNA損傷類型及其作用機制.結果表明:0.01，0.10，1.00mg/L的久效磷農(nóng)藥暴露24，48，96，168h均導致金魚肝細胞DNA損傷程度顯著升高，48h損傷最嚴重；暴露48h采用堿性、pH值12.1和中性彗星電泳發(fā)現(xiàn)DNA損傷類型主要為堿不穩(wěn)定位點形成，其次為單/雙鏈斷裂；采用Endo Ⅲ酶和FPG酶處理的堿性彗星電泳，發(fā)現(xiàn)DNA出現(xiàn)氧化損傷；暴露24h肝臟谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）活性顯著降低，丙二醛（MDA）含量顯著升高達到峰值，96～168h超氧化物歧化酶（SOD）和GSH-Px活性顯著升高，MDA含量與24h相比有所降低，表明活性氧自由基（ROS）含量在短期暴露升高（24h）、在96～168h暴露逐漸降低.影響抗氧化酶活性、干擾ROS清除過程是久效磷農(nóng)藥造成DNA損傷的主要機制.

久效磷；DNA損傷；金魚；活性氧自由基

久效磷農(nóng)藥是一種防治農(nóng)林業(yè)病蟲害的有機磷農(nóng)藥，目前在某些非洲和亞洲國家仍在使用［1-2］，并在農(nóng)作物和水環(huán)境中殘留，印度Andaman群島茄子等蔬菜中的久效磷殘留量在0.023～1.140mg/kg之間［3］，印度Lucknow市的工業(yè)廢水中久效磷的濃度達到（8.32±3.9）ng/mL［4］.殘留農(nóng)藥進入生物體后會作用于不同組織器官的遺傳物質，導致DNA的損傷，Saleha等［5］首次報道了久效磷能夠造成魚類外周血細胞DNA鏈斷裂，還可導致小鼠外周血細胞［6］、人淋巴細胞［7］以及淡水硬骨魚Channa punctatus鰓、腎、淋巴細胞［8］的DNA鏈斷裂.DNA的損傷主要包括DNA雙鏈斷裂（DSB）、單鏈斷裂（SSB）、堿不穩(wěn)定位點（ALS）形成、DNA堿基氧化損傷、DNA-蛋白交聯(lián)和DNA-DNA交聯(lián)等不同類型［9］，但目前尚未證明久效磷農(nóng)藥導致的DNA斷裂是單鏈還是雙鏈斷裂或者是堿基損傷等其他類型.研究發(fā)現(xiàn)有機磷農(nóng)藥主要通過增加組織內(nèi)的氧化壓力導致活性氧自由基過量產(chǎn)生，活性氧自由基攻擊DNA造成DNA鏈斷裂和堿基氧化［10］.有機磷農(nóng)藥可通過兩種途徑誘導活性氧自由基的過量產(chǎn)生:一是在細胞色素P450酶系作用下，硫代磷酸酯類有機磷農(nóng)藥中由—P︰S鍵轉化而來的—P︰O，或者磷酸酯類的—P︰O，在氧化還原循環(huán)中很容易獲得一個電子并將電子轉移給氧分子生成超氧陰離子自由基，或進一步轉變?yōu)槠渌杂苫缌u自由基［11-12］；二是通過降低機體抗氧化能力而引起氧化-抗氧化穩(wěn)態(tài)失衡，導致抗氧化系統(tǒng)對活性氧自由基的清除能力減弱.Yu等［13］研究發(fā)現(xiàn)毒死蜱可以造成鼠視網(wǎng)膜DNA損傷增加，脂質過氧化，超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶和谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）活性降低，抗氧化酶活性的變化可能升高了組織內(nèi)活性氧等自由基的含量引起DNA損傷，而抗氧化劑維生素C和維生素E可以減輕DNA損傷.Kashyap等［14］發(fā)現(xiàn)10-6～10-4mol/L的久效磷能夠上調CYP1A1/1A2，2B1/2B2，2E1等酶的mRNA水平，并顯著增加PC12細胞活性氧自由基含量，但目前尚不清楚久效磷能否通過干擾抗氧化系統(tǒng)從而影響活性氧自由基的清除過程來誘發(fā)DNA損傷.因此，本文在識別久效磷農(nóng)藥對DNA損傷類型的基礎上，選取對超氧自由基和過氧化氫具有清除作用的SOD、GSH-Px以及丙二醛（MDA）含量為指標，探討了久效磷農(nóng)藥對DNA氧化損傷的作用機制.

1 材料與方法

1.1 材料

金魚（Carassius auratus）購自青島市南山市場，金魚體長（8.53±0.83）cm，體重（24.05±2.74）g，實驗室馴養(yǎng)2周后進行久效磷暴露試驗.

久效磷農(nóng)藥購自青島農(nóng)藥廠，為40%水溶性制劑.其他藥品試劑均為分析純，購自Sigma公司（St. Louis， MO， USA）或國藥集團化學試劑有限公司（Beijing， P.R. China）.

1.2 久效磷農(nóng)藥暴露方法

采用半靜態(tài)暴露實驗，70L玻璃水族箱裝入50L連續(xù)曝氣24h的自來水，每組2個水族箱，每箱6條魚，共12條魚.根據(jù)急性毒性預試驗，久效磷農(nóng)藥暴露金魚的LC50約為100mg/L，本試驗選擇LC50的1/10000，1/1000，1/100，即0.01，0.10和1.00mg/L暴露金魚24、48、96和168h，同時設對照組.為保持久效磷農(nóng)藥濃度每天換水50%，并補加農(nóng)藥至暴露濃度.試驗條件: T（20±2）℃，ρ（DO）（7.0±0.1）mg/L，pH（7.6±0.2），光暗比14h:10h，試驗期間不投餌.每組取3條魚，75mg/L MS-222 （Sigma， St. Louis， MO， USA）麻醉后，取部分肝臟，用預冷的0.75%的NaCl漂洗去除血細胞，剪碎，過濾，0.75%的NaCl調整細胞密度為105個/mL，臺盼蘭染色法檢測單細胞懸液的細胞存活率大于95%后，進行彗星電泳.剩余肝臟組織拭干后稱重，加入9倍體積4℃預冷的勻漿緩沖液（PBS，pH 7.4）冰浴勻漿，4000g/min下離心10min，取上清液測定SOD、GSH-Px活性和MDA含量.

1.3 彗星電泳

彗星電泳操作在4℃避光條件下進行，參照Singh等［15］的方法略加改進.堿性彗星電泳，肝細胞固化在玻片上后，浸入裂解液（2.5mmol/L NaCl，100mmol/L Na2EDTA，10mmol/L Tris-base，pH=10，使用前加入1% TritonX-100和10% DMSO）裂解細胞1.5h，然后浸入電泳緩沖液（0.3mol/L NaOH，1mmol/L Na2EDTA， pH＞13）解旋DNA 20min，CYY-Ⅲ型電泳儀（北京六一儀器廠，中國）在25V（300mA）電壓下電泳20min.結束后向每張玻片滴加30μL溴化乙錠（20μg/mL）染色15min，在Olympus BX-51型熒光顯微鏡（Tokyo，Japan）200×下鏡檢計數(shù)，每張玻片隨機選取50個彗星細胞觀察并拍照，每條魚制作2張玻片.pH值12.1的彗星電泳和中性彗星電泳的操作步驟同堿性彗星電泳，不同的是電泳緩沖液pH分別為12.1和8.2～8.5.

Endo Ⅲ酶和FPG酶處理的堿性彗星電泳，玻片在裂解液中裂解后，用酶反應緩沖液（10mmol/L三羥甲基氨基丙烷-鹽酸，10mmol/L MgCl2，1mmol/L二硫蘇糖醇，pH 7.0，0.1mg/mL胎牛血清）漂洗兩次，每次8min，晾干后每個樣品六張載玻片中，分別取兩張滴加Endo Ⅲ酶識別和切除氧化的嘧啶、兩張滴加FPG酶識別和切除氧化的嘌呤，剩余兩張滴加酶反應緩沖液作為對照.37℃溫浴45min后放入電泳緩沖液中進行電泳，后續(xù)步驟同堿性彗星電泳.

使用CASP軟件（http://www.casp.of.pl/）對彗星細胞進行分析［16］.以Olive尾矩（OTM值）評估DNA損傷程度.Olive尾矩（OTM值）=彗星頭部重心和尾部重心之間的距離×尾部DNA含量.

1.4 SOD活性、GSH-Px活性和MDA含量測定

使用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶和丙二醛試劑盒，按照說明書測定肝臟組織SOD活性、GSH-Px活性和MDA含量.SOD活性:每mg組織蛋白在1mL反應液中INT還原抑制率達50%時所對應的SOD量為一個SOD活力單位（U）.GSH-Px活性:每mg蛋白質，每分鐘扣除非酶促反應作用，反應體系中GSH濃度降低1μmol/L為一個酶活力單位.MDA含量:每mg組織蛋白中MDA的摩爾數(shù).肝臟組織勻漿中的蛋白含量采用考馬斯亮藍法，用小牛血清蛋白（BSA）作為標準.

1.5 統(tǒng)計學分析

所有試驗數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標準差形式表示，采用單因素方差分析和Tukey多重檢驗分析顯著性，P＜0.05為差異顯著.

2 結果與討論

2.1 結果

2.1.1 肝細胞DNA的損傷 久效磷農(nóng)藥暴露48h后，對照組金魚肝細胞DNA完整，彗星細胞幾乎無拖尾現(xiàn)象，0.01mg/L暴露濃度組彗星細胞可見明顯拖尾，0.10和1.00mg/L暴露濃度組彗星細胞的尾部亮度逐漸增加、尾長逐漸延長（圖1A）.不同暴露時間和不同暴露濃度與對照組相比均能導致肝細胞OTM值顯著升高（P＜0.05，圖1B）；同一暴露濃度條件下，暴露24h即已出現(xiàn)損傷，48h時DNA損傷達到峰值，96h時損傷有所減輕，168h時的損傷明顯降低（圖1B）.

圖1 不同濃度久效磷農(nóng)藥暴露對金魚肝細胞DNA的損傷效應Fig.1 DNA-damaging effects of different concentrations of monocrotophos pesticide on hepatic cells of goldfish

2.1.2 肝細胞中DNA堿不穩(wěn)定位點、單鏈斷裂和雙鏈斷裂的形成 由圖1可知，久效磷農(nóng)藥暴露金魚48h后肝細胞DNA損傷最顯著，以后的試驗均選取48h暴露.由圖2可見，對于堿性（pH＞13）、pH值12.1和中性（pH值8.2～8.5）彗星電泳，各暴露濃度組的OTM值均顯著高于對照組（P＜0.05）；堿性彗星電泳的OTM值均顯著高于pH值12.1和中性彗星電泳的OTM值（P＜0.05）.

圖2 久效磷農(nóng)藥暴露48h后金魚肝細胞DNA不同pH值的彗星電泳條件下的OTM值Fig.2 Olive tail moment （OTM） values of DNA in hepatic cells of goldfish exposed to monocrotophos for 48h， assessed by comet assay under different pH conditions

圖3 久效磷農(nóng)藥暴露48h經(jīng)Endo Ⅲ或FPG酶處理后金魚肝細胞DNA的OTM值Fig.3 Olive tail moment （OTM） values of DNA in hepatic cells of goldfish exposed to monocrotophos for 48h，assessed by alkaline comet assay with the use of Endo III or FPG enzyme

2.1.3 肝細胞中DNA氧化損傷的形成 由圖3可見，對于陰性對照、Endo Ⅲ酶和FPG酶處理，各暴露濃度組的OTM值均顯著高于對照組（P＜0.05）；Endo Ⅲ酶和FPG酶處理后OTM值顯著高于陰性對照（P＜0.05），Endo Ⅲ酶處理后各暴露組OTM值是陰性對照的1.5～1.7倍，F(xiàn)PG酶處理后各暴露濃度組是陰性對照組的1.7～2.0倍.

圖4 久效磷農(nóng)藥暴露后金魚肝臟組織超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）活性及丙二醛（MDA）含量的變化Fig.4 Activities of superoxide dismutase （SOD） and glutathione peroxidase （GSH-Px） and concentrations of malondialdehyde （MDA） in the liver tissues of goldfish exposed to monocrotophos

2.1.4 久效磷農(nóng)藥對肝臟組織SOD活性、GSH-Px活性和MDA含量的影響 由圖4可見，久效磷農(nóng)藥暴露24h和48h，金魚肝臟組織SOD活性變化與對照相比無顯著差異，暴露96h和168h，SOD活性與對照相比顯著升高（P＜0.05，圖4A）；暴露24h各久效磷暴露組GSH-Px活性與對照相比均顯著降低（P＜0.05），暴露48h GSH-Px活性與對照相比無顯著差異，暴露96h和168h時GSH-Px活性明顯升高（P＜0.05，圖4B）；暴露24h各久效磷暴露組肝臟組織MDA含量與對照相比均顯著升高（P＜0.05），暴露48h、96h和168h MDA含量與24h相比有所降低，但仍顯著高于對照組（P＜0.05，圖4C）.

2.2 討論

諸多研究利用堿性彗星電泳技術，發(fā)現(xiàn)久效磷農(nóng)藥通過食物或水環(huán)境等介質暴露后可導致多種實驗動物淋巴細胞、外周血細胞等循環(huán)系統(tǒng)組織細胞的DNA損傷［5-8］.本研究的堿性彗星電泳結果表明暴露24，48，96和168h時，0.01、0.10和1.00mg/L久效磷農(nóng)藥均能導致金魚肝細胞OTM值的顯著升高，表明肝細胞是久效磷農(nóng)藥DNA損傷作用的靶點之一.Ali等［8］報道1.59～4.78mg/L久效磷農(nóng)藥（商標濃度為36%）暴露淡水硬骨魚Channa punctatus 21d，發(fā)現(xiàn)暴露96h時對鰓、腎、淋巴細胞的DNA損傷均達到峰值，96h后損傷逐漸減低，鰓細胞更易產(chǎn)生DNA損傷，其損傷水平約為對照組的4～5倍.本研究0.01～1.00mg/L久效磷農(nóng)藥暴露金魚48h時，肝細胞DNA損傷即達到峰值，各暴露濃度組損傷水平是對照組的30.6～32.3倍，表明金魚肝細胞DNA對久效磷農(nóng)藥的暴露更敏感，暴露48h后OTM值逐漸降低，表明肝臟組織同時具有較強的DNA損傷修復能力.

采用不同條件的彗星電泳可以識別DNA鏈斷裂的具體類型，在pH＞13時堿不穩(wěn)定位點能夠全部轉化成單鏈損傷，可利用pH＞13的彗星電泳檢測整體DNA損傷，即能夠識別雙鏈斷裂、單鏈斷裂和堿不穩(wěn)定位點形成［17］；pH≤12.1時堿不穩(wěn)定位點能夠穩(wěn)定存在，可利用pH值12.1的彗星電泳檢測單鏈斷裂和雙鏈斷裂，但不能檢測堿不穩(wěn)定位點形成［18］；pH8.2～8.5中性彗星電泳對雙鏈斷裂的檢測具有更高的敏感性［19-20］.本研究發(fā)現(xiàn)久效磷農(nóng)藥暴露后金魚肝細胞堿性、pH12.1和中性彗星電泳的OTM值與對照相比均顯著升高，表明久效磷農(nóng)藥暴露后肝細胞中DNA的堿不穩(wěn)定位點和單/雙鏈斷裂均增加，對于不同的暴露濃度，堿性彗星電泳的OTM值是pH值12.1彗星電泳的32.7～241.5倍、中性彗星電泳的75.6～278.0倍，表明堿不穩(wěn)定位點的形成是主要的DNA損傷類型.之前報道的久效磷農(nóng)藥對魚類等實驗生物的DNA損傷均是DNA鏈斷裂［5-8］，但是斷裂的類型不明確，本研究首次識別了久效磷農(nóng)藥誘發(fā)的DNA鏈斷裂包括堿不穩(wěn)定位點形成、單鏈斷裂和雙鏈斷裂等類型，其中堿不穩(wěn)定位點的形成是DNA損傷的主要類型.堿不穩(wěn)定位點主要包括無嘌呤或無嘧啶位點（AP位點）、半脫氧核糖位點和其他弱堿性條件下容易造成DNA斷裂的位點［21］，由于細胞內(nèi)的AP位點主要在DNA糖基化酶切除氧化損傷堿基的過程中形成［22］，因而久效磷農(nóng)藥暴露后金魚肝細胞DNA中堿不穩(wěn)定位點（AP位點）的增加可能與堿基的氧化損傷有關.采用Endo Ⅲ酶或FPG酶處理DNA，將DNA上氧化的嘧啶或嘌呤切除形成DNA鏈斷裂再進行彗星電泳，通過DNA鏈斷裂（OTM值）的變化能夠判斷DNA堿基是否發(fā)生氧化損傷［23］.本研究結果發(fā)現(xiàn)與未加酶的對照組相比，兩種酶處理后肝細胞OTM值顯著升高，表明久效磷農(nóng)藥誘發(fā)了DNA堿基的氧化損傷.

DNA堿基氧化損傷與活性氧自由基，特別是羥自由基的產(chǎn)生直接相關［24-25］，Kashyap等［14］的研究結果表明久效磷能夠通過上調細胞色素P450酶的表達代謝生成過量的活性氧自由基.組織內(nèi)過量活性氧自由基可通過抗氧化酶系統(tǒng)清除，但久效磷農(nóng)藥對活性氧自由基的清除過程是否產(chǎn)生影響尚不清楚.肝臟中富含多種抗氧化酶，是機體調節(jié)氧化還原代謝反應、清除過量活性氧自由基的重要器官，其中SOD能夠將超氧自由基轉化為過氧化氫，GSH-Px進一步將過氧化氫分解為水，從而減少由超氧自由基和過氧化氫轉化的羥自由基的含量；而過量的活性氧自由基能夠造成細胞內(nèi)脂質發(fā)生過氧化反應，導致MDA含量升高.本研究中久效磷農(nóng)藥暴露24h時，肝臟組織SOD活性未發(fā)生顯著性變化，GSH-Px活性受到顯著抑制，機體對過氧化氫的分解受到干擾，導致過量羥自由基產(chǎn)生，羥自由基能夠通過與嘌呤和嘧啶雜環(huán)的雙鍵發(fā)生加成反應、與胸腺嘧啶的甲基基團和脫氧核糖發(fā)生抽氫反應［25］，最終導致暴露24h時DNA損傷顯著升高；此時，過量羥自由基的產(chǎn)生導致脂質過氧化水平達到峰值.暴露48h時久效磷農(nóng)藥對肝臟組織SOD和GSH-Px活性沒有影響，活性氧的積累導致MDA含量顯著升高，DNA損傷達到峰值.暴露96h至168h時，活性氧自由基誘導細胞引起SOD和GSH-Px活性顯著升高，機體產(chǎn)生的過量活性氧自由基逐漸被消除，細胞對DNA損傷的修復使得DNA損傷逐漸降低.暴露24～168h肝臟組織SOD、GSH-Px活性以及MDA含量與DNA損傷的相應變化表明干擾活性氧自由基的清除過程導致活性氧自由基積累是久效磷農(nóng)藥誘發(fā)金魚肝細胞DNA損傷的主要機制之一.

3 結論

3.1 堿性彗星電泳的結果表明，0.01～1.00mg/L的久效磷農(nóng)藥暴露24、48、96和168h均能夠誘發(fā)金魚肝細胞DNA損傷，暴露48h損傷最嚴重，隨著暴露時間再延長損傷程度逐漸降低.

3.2 久效磷農(nóng)藥暴露能夠導致肝細胞DNA中堿不穩(wěn)定位點形成和單/雙鏈斷，其中堿不穩(wěn)定位點形成是損傷的主要類型.堿不穩(wěn)定位點形成與久效磷農(nóng)藥暴露后DNA堿基的氧化損傷正相關.

3.3 久效磷農(nóng)藥短期暴露（24h）能夠降低肝臟組織GSH-Px活性，升高MDA含量，機體對活性氧自由基的清除能力減弱導致過量活性氧自由基產(chǎn)生，從而誘導了DNA損傷；96～168h暴露能夠造成SOD和GSH-Px活性代償性升高，肝臟組織對活性氧自由基的清除能力增強，使得DNA損傷逐漸降低，結果表明干擾肝臟活性氧自由基的清除過程導致活性氧自由基積累是久效磷農(nóng)藥誘發(fā)DNA損傷的主要機制之一.

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DNA damage induced by monocrotophos pesticide and the underlying mechanism in hepatic cells of goldfish （Carassius auratus）.

ZHAO Fei1， WANG Bai1，2， ZHANG Xiao-na1， TIAN Hua1， WANG Wei1， RU Shao-guo1*（1.Marine Life Science College， Ocean University of China， Qingdao 266003， China；2.Liaoning Ocean and Fisheries Science Research Institute， Dalian 116023， China）. China Environmental Science， 2015，35（5）：1563～1569

Types of the DNA damage in hepatic cells and the underlying mechanism in goldfish （Carassius auratus）exposed to monocrotophos were investigated in this study. Results showed that DNA damage in hepatic cells of goldfish was significantly increased by exposure of 0.01， 0.10， and 1.00mg/L monocrotophos for 24， 48， 96， and 168h， and reached maximum at 48h. Alkali-labile sites rather than single- or double-strand breaks were found， by using the alkaline， pH 12.1，and neutral comet assay， to be the main type of DNA damage induced by monocrotophos at 48h. Further， oxidative damage in DNA bases was verified by using the alkaline comet assay combined with Endo III or FPG enzyme. At 24h，glutathione peroxidase （GSH-Px） activities significantly decreased and malondialdehyde （MDA） concentrations significantly increased and exhibited peak values， indicating an over-production of reactive oxygen species （ROS） at short exposure duration （24h）. However， superoxide dismutase （SOD） activities and GSH-Px activities significantly increased at 96～168h， and MDA concentrations showed a decreasing trend compared with those at 24h， suggesting a gradually decrease of ROS at 96～168h in the liver tissues. Accordingly， our results suggest that DNA damage induced by monocrotophos in hepatic cells of goldfish is possibly due to the inhibition of antioxidant enzymes activities and ROS scavenging.

monocrotophos；DNA damage；goldfish；reactive oxygen species

X171.5

A

1000-6923（2015）05-1563-07

趙 飛（1988-），女，山東泰安人，中國海洋大學海洋生命學院博士研究生，研究方向為污染生態(tài)學.

2014-10-07

國家自然科學基金（31101905）；高等學校博士學科點專項科研基金資助課題（博導類） （20120132110011）

* 責任作者， 教授， rusg@ouc.edu.cn