王少輝，劉萍萍，魏建超，邵東華，史子學(xué)，李蓓蓓，馬志永

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海200241）

上海市動(dòng)物源性食品中單增李斯特菌的流行病學(xué)及生物被膜形成能力研究

王少輝，劉萍萍，魏建超，邵東華，史子學(xué)，李蓓蓓，馬志永

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海200241）

為了解上海市動(dòng)物源性食品中單增李斯特菌的污染狀況，在上海市不同超市和農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)采集479份動(dòng)物源性食品樣品，依據(jù)國(guó)標(biāo)方法進(jìn)行菌株分離，并對(duì)分離菌株的耐藥性、血清型及生物被膜形成能力進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果共分離鑒定34株單增李斯特菌，分離率為7.1%（34/479）。藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示單增李斯特菌分離株的耐藥率雖然不高，但日趨嚴(yán)重，對(duì)氨芐青霉素和萬(wàn)古霉素均敏感，對(duì)頭孢曲松的耐藥性最高（55.88%），林可霉素次之（41.18%）。血清型鑒定表明單增李斯特菌分離株以血清型1/2a（3a）型為主（76.47%），血清型1/2c（3c）次之（17.65%），而致病性強(qiáng)的血清型4b（4d、4e）僅占2.94%。生物被膜形成能力實(shí)驗(yàn)表明，所有的菌株均能形成生物被膜，其中76.47%（26/34）分離株生物被膜形成能力微弱。上海市動(dòng)物源性食品中單增李斯特菌污染情況較為嚴(yán)重，主要流行1/2a（3a）血清型，耐藥率日趨嚴(yán)重，均可形成生物被膜。因此，應(yīng)加強(qiáng)對(duì)動(dòng)物源性食品中單增李斯特菌的監(jiān)控。

單增李斯特菌；耐藥性；血清型；生物被膜

單核細(xì)胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes，LM）又稱單增李斯特菌，是一種胞內(nèi)寄生的革蘭陽(yáng)性桿菌。LM是重要的人獸共患病原菌，是危害嚴(yán)重的食源性疾病致病菌之一。近年來(lái)，由LM引起的食物中毒的情況日趨嚴(yán)重，在歐美等地由此菌造成的食物污染程度和病例已大大超過(guò)沙門(mén)菌［1-3］。李斯特菌病雖發(fā)病率不高，但其致死率（20%～30%）遠(yuǎn)高于其他常見(jiàn)食源性病原菌［4，5］。因此，應(yīng)加強(qiáng)對(duì)食品中LM的檢測(cè)及監(jiān)控，為該病的防控提供理論依據(jù)。

本研究依據(jù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)對(duì)上海市的超市和農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)的動(dòng)物源性食品進(jìn)行了抽樣調(diào)查，并對(duì)分離得到的LM菌株進(jìn)行血清型及生物被膜形成能力分析，更深入了解動(dòng)物源性食品中LM的流行情況，為預(yù)防人感染 LM 提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品收集和標(biāo)準(zhǔn)菌株 2011年6月～2012年6月分別在上海市大型超市、農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)、菜市場(chǎng)采集生肉類、散裝熟肉制品、生奶等各類食品共479份樣品，用于菌株分離鑒定。LM菌株10403s、EGDe、英諾克李斯特菌（L.innocua）（ATCC33090）由浙江大學(xué)方維煥教授惠贈(zèng)［6］；單增李斯特菌CVCC 53004購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所菌種保藏中心。

1.2 試劑和儀器 腦心浸液培養(yǎng)基（Brain Heart Infusion，BHI）、PALCAM選擇性培養(yǎng)基均購(gòu)自青島海博生物技術(shù)公司；細(xì)菌基因組提取試劑盒、2×PCR MasterMix及DNA Marker均購(gòu)自天根（北京）生物科技有限公司；藥敏紙片購(gòu)自杭州天和微生物試劑有限公司；PCR儀購(gòu)自Applied Biosystems公司；核酸電泳儀購(gòu)自北京市六一儀器廠；凝膠成像分析儀購(gòu)自Bio-Rad公司；多功能酶標(biāo)儀購(gòu)自BioTek公司。

1.3 LM的分離鑒定 參照國(guó)標(biāo)（GB/T4789.30-2008）方法略加修改后進(jìn)行LM的分離及鑒定。將樣品進(jìn)行預(yù)增菌，取增菌液劃線接種于PALCAM選擇性瓊脂平板，培養(yǎng)24～48 h，挑選黑色或者灰綠色疑似單菌落，37℃培養(yǎng)。然后采用PCR方法擴(kuò)增LM溶血素基因hly，引物見(jiàn)表1。

表 1 本研究使用的引物Table 1 Primers used in this study

1.4 細(xì)菌基因組的提取 根據(jù)DNA提取試劑盒根生化科技有限公司）說(shuō)明書(shū)提取LM的基因組，-40℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 藥敏試驗(yàn) 采用紙片擴(kuò)散法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。將LM分離株以1:100比例接種于5 mL BHI培養(yǎng)基中，37℃過(guò)夜培養(yǎng)，取菌液致密劃線于BHI瓊脂平板表面，將藥敏片貼于培養(yǎng)基表面，37℃培養(yǎng)24 h后測(cè)量抑菌圈直徑。根據(jù)美國(guó)臨床檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)委員（CLSI）標(biāo)準(zhǔn)判定LM分離株的藥物敏感性。

1.6 血清型分型 參照文獻(xiàn)［7，8］中方法，根據(jù)lmo0737、lmo1118、ORF2819、ORF2110、prs五個(gè)基因序列設(shè)計(jì)并合成引物（表1），采用PCR方法對(duì)LM分離株進(jìn)行血清型分型。

1.7 生物被膜形成能力分析 將LM在相同條件下培養(yǎng)，調(diào)節(jié)OD600=0.3，然后1:100稀釋，加入96孔聚苯乙烯微孔板，每孔200 μL，每個(gè)樣品6個(gè)重復(fù)，37℃靜置培養(yǎng)24 h。棄去培養(yǎng)液，無(wú)菌PBS清洗3次除去浮游菌體，然后加入200 μL結(jié)晶紫染色1 h。PBS清洗3次，自然風(fēng)干，加入200 μL 95%乙醇作用5～10 min，測(cè)定OD595，以無(wú)菌培養(yǎng)基作為陰性對(duì)照。

參照Stepanovic等［9］的方法，分析各個(gè)菌株生物被膜形成能力。以陰性對(duì)照的平均OD值加上3倍的標(biāo)準(zhǔn)差（s）即ODc為基準(zhǔn)，OD＜ODc為不形成生物被膜；1ODc＜OD＜2ODc為弱生物被膜形成能力；2ODc＜OD＜4ODc為形成生物被膜能力中等；OD＞4ODc則為強(qiáng)生物被膜形成能力。

2 結(jié)果

2.1 LM 在動(dòng)物源性食品中的分布 對(duì)上海市超市和農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)的479份動(dòng)物源性食品樣品進(jìn)行分析，經(jīng)預(yù)增菌、顯色培養(yǎng)基培養(yǎng)、PCR鑒定（圖1），最終分離得到34株LM，分離率為7.1%（34/479）。通過(guò)分析顯示LM主要分布于雞肉產(chǎn)品中，在牛肉產(chǎn)品中分離率較低（表2）。

表 2 LM 在不同樣品中的分布Table 2 Distribution of LM strains in the different samples

圖 1 單增李斯特菌 hly 基因擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 The PCR amplification result of hly gene of Listeria monocytogenes

2.2 藥敏試驗(yàn)結(jié)果 選用β-內(nèi)酰胺類抗生素、氨基糖苷類抗生素、四環(huán)素類抗生素、氯霉素類抗生素、大環(huán)內(nèi)酯類抗生素、喹諾酮類藥物抗菌藥物對(duì)分離得到的LM分離株進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表3。結(jié)果表明LM分離株對(duì)氨芐青霉素和萬(wàn)古霉素均敏感；對(duì)頭孢曲松的耐藥性最高（55.88%），林可霉素次之（41.18%）。

2.3 LM的血清型分型 采用PCR方法對(duì)LM菌株進(jìn)行血清型分型，結(jié)果顯示血清型1/2a（3a），占76.47%（26/34）；血清型1/2c（3c）占17.65%（6/34）；血清型1/2b（3b、7）和血清型4b（4d、4e）各占2.94%（1/34）（表4）。結(jié)果表明，上海市動(dòng)物源性食品中主要污染致病性較弱的1/2a（3a）血清型LM。

2.4 生物被膜形成能力分析 利用96孔微孔板法定量分析LM的生物被膜形成能力，結(jié)果顯示所有的LM分離株能形成生物被膜，其中5.9%（2/34）LM分離株具有強(qiáng)生物被膜形成能力；17.6%（6/34）LM分離株具有中等生物被膜能力；76.47%（26/34）LM分離株具有微弱形成生物被膜能力（圖2，表4）。

表 3 LM 藥敏試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results of antibiotic sensitivity test of LM isolates

表 4 單增李斯特菌的血清型、生物被膜形成能力及來(lái)源分析Table 4 The serotype， biofilm-forming capacity and source of LM strains

圖 2 單增李斯特菌的生物被膜形成能力Fig.2 The biofilm formation capacities of the LM strains

3 討論

LM是四大食源性病原菌（其他三個(gè)為沙門(mén)氏菌、大腸桿菌O157:H7、空腸彎曲桿菌）之一，能引起人畜李斯特菌病，感染后主要表現(xiàn)為敗血癥、腦膜炎和單核細(xì)胞增多等癥狀［5］。近年來(lái)，由LM引起的食物中毒的情況日趨嚴(yán)重，在歐美等地由LM造成的食物污染程度和病例已大大超過(guò)沙門(mén)菌［1-3］。本研究對(duì)上海市動(dòng)物源性食品中LM流行狀況進(jìn)行了分析，479份樣品經(jīng)預(yù)增菌、分離鑒定，最終分離得到34株LM，分離率為7.1%（34/479）。所采集的5類樣品中均分離到了LM，其中雞的副產(chǎn)品中分離率最高（表2）。國(guó)內(nèi)不同研究人員對(duì)全國(guó)各地食品中LM污染情況進(jìn)行了調(diào)查，結(jié)果表明LM分離率不盡相同，但在生肉中分離率都較高［10］。靳曉燕等［11］的研究結(jié)果顯示保定地區(qū)生肉污染率高達(dá)32.4%。國(guó)外研究人員對(duì)不同樣品中的LM污染情況進(jìn)行了分析，顯示不同地區(qū)的食品中均不同程度存在LM污染［3，12，13］。由此表明，LM在食品中污染較為嚴(yán)重，威脅著食品安全和人類健康。

近年來(lái)，由于抗生素的廣泛過(guò)量使用導(dǎo)致細(xì)菌（包括各類食源性病原菌）的耐藥性日益嚴(yán)重，給臨床用藥帶來(lái)很大困難。本研究對(duì)LM分離株的耐藥性進(jìn)行了分析，結(jié)果表明LM分離株對(duì)多數(shù)抗生素耐藥性不高，其中對(duì)氨芐青霉素和萬(wàn)古霉素菌完全敏感。與其他研究［14］相比，LM對(duì)抗生素的耐藥性逐漸增加，可能是由為動(dòng)物養(yǎng)殖過(guò)程中抗生素的不合理使用導(dǎo)致的。血清分型是一種傳統(tǒng)的細(xì)菌分型方法，LM分為16個(gè)血清型，其中血清型4b毒力最強(qiáng)，引起絕大多數(shù)暴發(fā)病例，而血清型1/2a通常在食品中分離率最高［15，16］。本研究采用PCR方法對(duì)分離得到的LM進(jìn)行分型，結(jié)果表明動(dòng)物源性食品中LM主要是血清型1/2a（3a），占總分離株的76.47%，血清型1/2c（3c）次之，而致病力最強(qiáng)的4b較少，與國(guó)內(nèi)外報(bào)道的結(jié)果基本一致［3，12，13］。生物被膜是細(xì)菌為適應(yīng)外界環(huán)境變化而選擇的一種與浮游形式不同的生長(zhǎng)方式，主要由附著于惰性或活性實(shí)體表面的細(xì)菌細(xì)胞和包裹著細(xì)菌的水合性基質(zhì)所組成的結(jié)構(gòu)性細(xì)菌群落。生物被膜一旦形成將很難清除，不僅能增強(qiáng)LM對(duì)藥物的抵抗力，還可以提高LM在食品的加工、消毒處理過(guò)程中的抵抗力，威脅食品安全等［17，20］。研究表明，血清型1/2a、1/2c的生物被膜形成能力較強(qiáng)，但是不同血清型之間的生物被膜形成能力之間沒(méi)有太大區(qū)別［21］。本研究表明，LM分離株均能夠形成生物被膜，有利于LM在食品加工、存儲(chǔ)環(huán)境中長(zhǎng)期定殖生存，從而不斷地污染動(dòng)物源性食品。

通過(guò)對(duì)上海市動(dòng)物源性食品的檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)LM污染情況較為嚴(yán)重，主要流行1/2a（3a）血清型，且耐藥性日趨嚴(yán)重，已經(jīng)嚴(yán)重威脅食品安全。生物被膜實(shí)驗(yàn)表明所有的LM分離株能夠形成生物被膜，從而導(dǎo)致食品不斷被LM污染。因此，應(yīng)加強(qiáng)對(duì)食品中LM的監(jiān)控，為該病的防控提供理論依據(jù)。

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EPIDEMIOLOGY AND BIOFILM-FORMATION CAPACITY OF LISTERIA MONOCYTOGENES FROM ANIMAL ORIGIN FOOD IN SHANGHAI

WANG Shao-hui， LIU Ping-ping， WEI Jian-chao， SHAO Dong-hua，SHI Zi-xue， LI Bei-bei， MA Zhi-yong
（Shanghai Veterinary Research Institute， CAAS， Shanghai 200241， China）

This study was performed to investigate the contamination of Listeria monocytogenes （LM） in animal origin food in Shanghai， which gained further insights on the public health risk caused by this food borne pathogen. A total of 479 animal origin food samples were screened for LM. Then， the antibiotic sensitivity， serotype and biofilm formation of each isolate were determined. The results showed that 34 LM strains were isolated from 479 samples， which accounted for 7.1%. The antibiotics resistance tests showed that resistant rate of LM isolates were not high. All LM isolates were sensitive to ampicillin and vancomycin. However， 55.88% isolates were resistant rate to ceftriaxone， followed by lincomycin （41.18%）. Serotying results showed that 76.47% LM strains were belonged to serovar 1/2a（3a）， followed by serovar 1/2c（3c）. Whereas， only one isolate （2.94%） was the pathogenic serotype 4b（4d、4e）. Bioilm formation assays showed that all the LM isolates could produce biofilm， in which 76.47%（26/34）were weak biofilm producers. These results indicated that animal origin food was contatiminated by LM， and the biofilm will increase the chances of LM contamination. Thus， it is necessary to inspect and survey the contamination by LM on farms and in abattoirs to reduce the incidence of foodborne infections in humans.

Listeria monocytogenes； resistance antibiotics； serotype； biofilm

S852.615

A

1674-6422 （2015）04-0031-06

2015-03-04

國(guó)家自然科學(xué)基金（81201266）

王少輝，男，副研究員，主要從事畜禽細(xì)菌性傳染病研究

馬志永，E-mail:zhiyongma@shvri.ac.cn