劉椏菲 劉獻(xiàn)志 翟廣 楊斌 毛沖沖

(1.鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院 神經(jīng)外科 河南 鄭州 450052;2.鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院 神經(jīng)外科 河南 鄭州 450052)

人腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤(human gliomas)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中最為常見的一種原發(fā)性惡性腫瘤，通常呈浸潤(rùn)性生長(zhǎng)，手術(shù)難以完全切除，預(yù)后較差。世界衛(wèi)生組織根據(jù)病理中人腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤的惡性程度遞增，將其劃分為Ⅰ～Ⅳ級(jí)［1］，臨床診治中常常將Ⅰ～Ⅱ級(jí)視為低分級(jí)神經(jīng)膠質(zhì)瘤，Ⅲ～Ⅳ級(jí)視為高分級(jí)神經(jīng)膠質(zhì)瘤。一般認(rèn)為神經(jīng)膠質(zhì)瘤的發(fā)病機(jī)制和多個(gè)調(diào)控基因異常過度表達(dá)或者受到抑制有關(guān)。哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)是一種非典型絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，同時(shí)它也是一類重要的信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，在基因表達(dá)及細(xì)胞增殖中發(fā)揮中間橋梁作用。Survivin 又稱存活蛋白，是凋亡抑制蛋白家族之一，通常只表達(dá)于惡性腫瘤或者某些胚胎組織，具有較好的特異性，表達(dá)情況多和腫瘤細(xì)胞的增殖及浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。本研究通過免疫組化檢測(cè)71 例膠質(zhì)瘤中mTOR 及Survivin 的表達(dá)，并進(jìn)行差異性和相關(guān)性統(tǒng)計(jì)分析，從而探討其在人腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)及其相互關(guān)系，為臨床診斷與治療提供幫助。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 收集2010年11月至2013年10月期間鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)外科行手術(shù)切除且保存完好的人腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤石蠟包埋標(biāo)本71 例，收集10 例該科室同期因重度顱腦外傷性內(nèi)減壓術(shù)的患者的腦組織作為正常腦組織(切片經(jīng)病理科醫(yī)師審定)。按照WHO 人腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤分級(jí)，其中Ⅰ級(jí)16 例，Ⅱ級(jí)19 例，Ⅲ級(jí)17 例，Ⅳ級(jí)19 例。把Ⅰ、Ⅱ級(jí)人腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤標(biāo)本合并為低分級(jí)膠質(zhì)瘤組，把Ⅲ、Ⅳ級(jí)人腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤標(biāo)本合并為高分級(jí)膠質(zhì)瘤組。選取標(biāo)準(zhǔn):所有患者術(shù)前均完善了相關(guān)檢查，未進(jìn)行過化療、生物免疫治療和放療等，且患者為第1 次手術(shù)治療，無糖尿病、痛風(fēng)等代謝性疾病或冠心病、慢性阻塞性肺疾病等心肺疾病以及其他嚴(yán)重并發(fā)癥。所有標(biāo)本在手術(shù)切除后去除出血、壞死、燒灼的組織，用生理鹽水反復(fù)沖洗后去除血污，1 h 內(nèi)用10%福爾馬林溶液浸泡固定，5 d內(nèi)進(jìn)行石蠟包埋，留以備用。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器

1.2.1 實(shí)驗(yàn)試劑 即用型免疫組化EliVisionTMplus試劑盒，兔抗人mTOR 單克隆抗體購于美國EPITOMICS 公司，兔抗人Survivin 蛋白多克隆抗體購于福州邁新生物技術(shù)有限公司，DAB 顯色增強(qiáng)試劑及S－P9001試劑盒均購于北京市中杉金橋有限公司。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)儀器 成像系統(tǒng):LE－5 顯微數(shù)碼照像系統(tǒng)(德國Leica 公司)、圖片分析系統(tǒng):PLS－MZ0021 全智能病理圖片分析系統(tǒng)(北京普利生儀器公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法 用半定量免疫組化(Envision 法)檢測(cè)mTOR 和Survivin 的表達(dá)強(qiáng)度，操作嚴(yán)格按照EliVisionTMplus 試劑盒說明進(jìn)行。兔抗人mTOR 單克隆抗體1∶100，兔抗人Survivin 蛋白多克隆抗體1∶100，PBS緩沖試劑代替一抗作為陰性對(duì)照，采用已知表達(dá)的膠質(zhì)瘤標(biāo)本作為陽性對(duì)照。

1.4 免疫組織化學(xué)結(jié)果判定方法 mTOR 和Survivin進(jìn)行的免疫組化均采用了PBS 代替一抗作對(duì)照。采用PLS－MZ0021 全智能病理圖片分析系統(tǒng)在統(tǒng)一光強(qiáng)，統(tǒng)一放大倍數(shù)(10 ×40)下測(cè)量表達(dá)情況，以染色最淡的視野為起點(diǎn)。任選5 個(gè)視野，將其染色強(qiáng)度(淡黃色＜棕黃色＜棕褐色)以及陽性細(xì)胞的百分比作為mTOR 及Survivin 陽性表達(dá)的量化指標(biāo)。實(shí)驗(yàn)采取配對(duì)設(shè)計(jì)的方法，將mTOR 和Survivin 按照編號(hào)進(jìn)行配對(duì)，并排除其他可能影響因素，從而便于相關(guān)性分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0 分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，陽性表達(dá)情況的比較采用統(tǒng)計(jì)方法采用χ2檢驗(yàn)和Spearman 秩相關(guān)法統(tǒng)計(jì)方法行相關(guān)性分析，P ＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 mTOR 在人腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤中的表達(dá) 在正常腦組織標(biāo)本中，mTOR 未見到有陽性表達(dá)。在低級(jí)別膠質(zhì)瘤組中，mTOR 陽性表達(dá)后被染色的細(xì)胞所占的百分比相對(duì)較低，陽性表達(dá)率為37.14%，而在高級(jí)別膠質(zhì)瘤組中染色較深，其所占比率亦較高，陽性表達(dá)率為69.44%。方差分析顯示，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F =7.444，P=0.009 ＜0.05)。對(duì)病理級(jí)別與表達(dá)水平再行Spearman 秩相關(guān)法分析，秩相關(guān)系數(shù)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(r=0.470，P =0.000 ＜0.05)，說明隨著神經(jīng)膠質(zhì)瘤病理級(jí)別和惡性程度的增加，mTOR 的表達(dá)增強(qiáng)。

圖1 mTOR 在不同級(jí)別膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)(×400)

2.2 Survivin 在人腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤中的表達(dá) 在正常腦組織標(biāo)本中，Survivin 未見到有陽性表達(dá)。在低級(jí)別膠質(zhì)瘤組中，Survivin 陽性表達(dá)后被染色的細(xì)胞所占的百分比相對(duì)較低，陽性表達(dá)率為40.00%，而在高級(jí)別膠質(zhì)瘤組中染色較深，其所占比率亦較高，陽性表達(dá)率為66.67%。行方差分析結(jié)果顯示，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=5.073，P=0.033 ＜0.05)。對(duì)病理級(jí)別與表達(dá)水平再行Spearman 秩相關(guān)法分析，秩相關(guān)系數(shù)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(r =0.399，P =0.001 ＜0.05)，說明隨著神經(jīng)膠質(zhì)瘤病理級(jí)別及惡性程度的提高，Survivin 表達(dá)水平也增加。

圖2 Survivin 在不同級(jí)別膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)(×400)

2.3 mTOR 與Survivin 在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中表達(dá)的相關(guān)性 在71 例病例標(biāo)本中，mTOR 和Survivin 在人腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤中陽性表達(dá)率分別為53.52%和56.34%，其中同為陰性表達(dá)的有20 例，同為陽性表達(dá)的有25 例。mTOR 與survivin 在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中的表達(dá)呈現(xiàn)相關(guān)性(χ2=4.947，P=0.026 ＜0.05)，采用Spearman 秩相關(guān)檢驗(yàn)方法可以認(rèn)為mTOR 與Survivin 的表達(dá)存在正相關(guān)(r=0.264，P=0.026 ＜0.05)。

3 討論

mTOR 屬于磷脂酰肌醇－3－激酶復(fù)合體家族成員之一，它是TOR 信號(hào)通路分子種群的一種［1］。經(jīng)過近些年學(xué)者的研究，mTOR 信號(hào)通路異常激活與多種腫瘤發(fā)生密切相關(guān)，它能夠加速細(xì)胞周期、減少細(xì)胞凋亡、并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移，在腦膠質(zhì)瘤、乳腺癌、卵巢癌中早已有報(bào)道［2］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明隨著神經(jīng)膠質(zhì)瘤惡性程度的增加，mTOR 的表達(dá)呈現(xiàn)增強(qiáng)的趨勢(shì)。對(duì)于mTOR 信號(hào)通路在人腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展過程中可能的作用機(jī)理主要有以下3 個(gè)方面:首先，mTOR 信號(hào)通路的活性可受到多種細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)，此途徑主要通過PI3K/Akt/mTOR 信號(hào)分子傳導(dǎo)實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)及增殖的調(diào)控作用［3］。PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路的過度激活，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)信號(hào)大量表達(dá)，細(xì)胞異常增殖，最終導(dǎo)致腫瘤的產(chǎn)生。其次，mTOR 信號(hào)通路具有抑制細(xì)胞凋亡、促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)的作用，其過度激活可導(dǎo)致細(xì)胞凋亡過度抑制，細(xì)胞增殖能力過度加強(qiáng)，進(jìn)而促使腫瘤的發(fā)生［14－16］。最后，當(dāng)細(xì)胞增殖速度過快時(shí)，可增加細(xì)胞適應(yīng)低氧環(huán)境的能力，并通過大量生成的血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子促進(jìn)微血管的形成，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞能量供應(yīng)及生長(zhǎng)。通過對(duì)mTOR 信號(hào)通路的深入研究，探索其在人腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤中的表達(dá)水平，可能會(huì)發(fā)現(xiàn)相關(guān)異常蛋白，分析這些蛋白在顱腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤發(fā)病中所起的作用，可能會(huì)為將來對(duì)此疾病的生物靶向治療提供依據(jù)。

Survivin 基因最早是由耶魯大學(xué)Ambrosini 等人通過克隆的方法從人類基因庫中分離出來，其基因定位于染色體17q25，Survivin 蛋白是凋亡抑制蛋白家族之一［7］，也是迄今為止發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)的具有抑制凋亡、促進(jìn)增殖的抑制因子。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明Survivin 的陽性表達(dá)隨著神經(jīng)膠質(zhì)瘤惡性程度的增加而增強(qiáng)。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果推斷，Survivin 基因及其表達(dá)產(chǎn)物可參與促進(jìn)細(xì)胞的增殖、抑制細(xì)胞凋亡，其過度表達(dá)可出現(xiàn)異常增殖，從而導(dǎo)致腫瘤的產(chǎn)生。Survivin 具有促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的能力，它參與了神經(jīng)膠質(zhì)瘤血管形成［8］，這使得腫瘤的血供得以保證，為神經(jīng)膠質(zhì)瘤的快速生長(zhǎng)提供充足的營養(yǎng)供應(yīng)。通過實(shí)驗(yàn)我們發(fā)現(xiàn)，Survivin在正常組織中的表達(dá)微乎其微，因而具有高度的腫瘤特異性，針對(duì)它的靶向治療具有良好的特異性［9］。Survivin 是一個(gè)目前較為理想可行的靶點(diǎn)，對(duì)人腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤的研究和診治具有很大的價(jià)值。

對(duì)于mTOR 和Survivin 的表達(dá)相關(guān)性研究，推測(cè)其機(jī)制可能為:①人腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤中大多存在PI3K 表達(dá)過度的情況，而mTOR 和Survivin 的表達(dá)均受到PI3K 調(diào)節(jié)，當(dāng)PI3K 表達(dá)上調(diào)，會(huì)間接通過AKT 途徑而激活Survivin 和mTOR 通路，促進(jìn)其表達(dá)［6］;②10 號(hào)染色體上的磷酸酶基因(phosphatase and tensin homology deleted on chromosome 10，PTEN)作為PI3K/Akt/mTOR 信號(hào)通路的抑制因子，它的失活也可導(dǎo)致神經(jīng)膠質(zhì)瘤的發(fā)生。PTEN 的失活可導(dǎo)致對(duì)PI3K 的抑制降低而表達(dá)過度，進(jìn)而激活Survivin 和mTOR 通路，促進(jìn)其表達(dá);③mTOR 可能會(huì)增強(qiáng)與中間蛋白結(jié)合而間接增強(qiáng)mRNA 的穩(wěn)定性，促進(jìn)其穩(wěn)定表達(dá)，降低對(duì)抑制因素的敏感性，從而導(dǎo)致Survivin 表達(dá)上調(diào)。

綜上所述，mTOR 及Survivin 都是反映人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖和侵襲活性的標(biāo)志性物質(zhì)，因而針對(duì)Survivin 的過度表達(dá)進(jìn)行干預(yù)的同時(shí)，可以考慮運(yùn)用mTOR 信號(hào)通路抑制劑聯(lián)合治療人腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤，可能會(huì)產(chǎn)生一定的治療效果，而且可能為人腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤的聯(lián)合治療、檢測(cè)以及評(píng)估等提供新的思路。

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