羅勁，陳一強(qiáng)，孔晉亮，黃宏，侯長春，李冰，董必英

桂皮醛聯(lián)合伏立康唑?qū)εR床分離煙曲霉菌的體外作用研究

羅勁，陳一強(qiáng)，孔晉亮△，黃宏，侯長春，李冰，董必英

目的評價桂皮醛與伏立康唑（VRC）聯(lián)合應(yīng)用對臨床分離煙曲霉菌的體外抗菌活性。方法參照美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會（CLSI）推薦的微量液基稀釋法及棋盤法，分別測定桂皮醛、VRC單獨(dú)使用及聯(lián)合使用對42株臨床分離煙曲霉菌的最小抑菌濃度（MIC），比較2藥單用與聯(lián)用的MIC50、MIC90、MIC幾何均數(shù)（MICG）及MIC分布；繪制濃度-累積抑菌百分率曲線并計算分級抑菌指數(shù)（FICI），判斷藥物聯(lián)合作用的類型。結(jié)果桂皮醛與VRC聯(lián)用后，2藥的MIC50、MIC90及MICG均較各自單用時明顯降低（P＜0.01），MIC峰值分布及濃度-累積抑菌百分率曲線較單用時左移；2藥聯(lián)用的FICI值為0.187 5～1.5，其中16株（38.10%）體現(xiàn)為協(xié)同作用，19株（45.23%）為相加作用，7株（16.67%）為無關(guān)作用，未出現(xiàn)拮抗作用。受試菌株對VRC的敏感性越低，2藥聯(lián)用的FICI均數(shù)越小。結(jié)論桂皮醛與VRC聯(lián)用對臨床分離煙曲霉菌的體外聯(lián)合抗菌效應(yīng)主要表現(xiàn)為協(xié)同和相加作用，且該藥物組合對VRC敏感性較低的煙曲霉菌表現(xiàn)出較強(qiáng)的協(xié)同抗菌作用。

藥物療法，聯(lián)合；體外研究；桂皮醛；伏立康唑；煙曲霉菌

煙曲霉菌廣泛存在于周圍自然環(huán)境中，是造成臨床免疫力低下患者深部真菌感染的常見致病真菌之一。近年來，隨著骨髓和器官移植技術(shù)的廣泛開展，廣譜抗生素、免疫抑制劑以及侵入性監(jiān)測設(shè)備的應(yīng)用，使煙曲霉菌感染呈現(xiàn)逐年上升趨勢，其導(dǎo)致的侵襲性曲霉?。╥nvasive aspergillosis，IA）病死率可高達(dá)80%～90%［1］。伏立康唑（VRC）為當(dāng)前IA治療的首選藥物，其廣泛應(yīng)用使唑類耐藥菌株不斷增加，尤其是多重耐藥菌株的出現(xiàn)，給臨床IA的治療帶來極大的挑戰(zhàn)［2］。相關(guān)研究表明，中藥肉桂的單體活性成分桂皮醛具有抗煙曲霉菌作用［3］，但桂皮醛與抗真菌藥物聯(lián)合用于抗煙曲霉菌感染少見報道。本研究旨在探討桂皮醛在體外聯(lián)合伏立康唑?qū)熐咕R床分離株的抗菌活性，以期為IA的治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1菌株收集2012年10月—2014年2月于本院臨床診斷為侵襲性煙曲霉菌感染的不同患者的痰、肺泡灌洗液及傷口分泌物分離的42株煙曲霉菌，其中呼吸內(nèi)科28株，燒傷外科7株，重癥監(jiān)護(hù)病房（ICU）3株，血液科2株，內(nèi)分泌科、新生兒各1株。經(jīng)形態(tài)學(xué)及48℃溫度實(shí)驗(yàn)鑒定均為經(jīng)典煙曲霉菌［4］。獲取標(biāo)本前42株受試菌株對應(yīng)患者均未接受抗真菌治療。抗真菌治療前嚴(yán)格無菌技術(shù)留取標(biāo)本送檢。質(zhì)控菌株選用美國臨床與實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會（CLSI）M38-A2絲狀真菌藥敏指南（以下簡稱“指南”）推薦的近平滑念珠菌ATCC22019，由本院臨床微生物檢定中心惠贈。

1.2主要試劑與儀器桂皮醛（美國Sigma公司，批號：V900539），VRC（中國食品藥品檢定研究院，批號：100862-201402），馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA，中國路橋技術(shù)責(zé)任有限公司），RPMI-1640粉末（Gibco公司），MOPS（美國Sigma公司），96孔板（Corning公司），二甲基亞砜（DMSO，美國Amresco公司），恒溫生化培養(yǎng)箱（常州市偉嘉儀器制造有限公司），BHC-1300ⅡB2型生物安全柜（蘇州凈化設(shè)備有限公司），含0.025%Tween20的PBS液（本實(shí)驗(yàn)室自制）。

1.3方法

1.3.1煙曲霉菌孢子懸液及受試藥物的制備將各受試菌株復(fù)蘇并轉(zhuǎn)種于PDA斜面，37℃孵育3～5 d，用含0.025% Tween20的PBS液沖洗斜面表面收集孢子，經(jīng)MOPS緩沖后pH為7.0的RPMI-1640重懸孢子，光學(xué)顯微鏡下用血細(xì)胞計數(shù)板調(diào)節(jié)濃度為2×106CFU/mL。再以RPMI-1640液體培養(yǎng)基將其稀釋100倍，得到2倍終濃度的受試孢子懸液。參照指南，將桂皮醛及VRC用100%DMSO溶解，均配制成32 000 mg/L儲存液，經(jīng)0.22 μm濾器濾過并分裝后，于-80℃保存。

1.3.2單藥最低抑菌濃度（MIC）測定參照指南推薦的微量液基稀釋法分別測定桂皮醛、VRC單用對42株受試煙曲霉菌及質(zhì)控菌株的MIC。其中桂皮醛的工作濃度范圍為1～1 024 mg/L，VRC為0.03～16 mg/L。終點(diǎn)的判讀：MIC定義為肉眼直接觀察到的無真菌生長的最低藥物濃度。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。依據(jù)指南及文獻(xiàn)［5］，劃分受試菌株對VRC的敏感性：VRC單用的MIC≤1 mg/L為敏感，MIC=2 mg/L為劑量依賴性敏感，MIC＞2 mg/L為耐藥。

1.3.3桂皮醛與VRC聯(lián)合抑菌實(shí)驗(yàn)參照指南及2種藥物單藥對各受試菌株的MIC值，采用棋盤式設(shè)計法，將4× MIC～1/32×MIC 8個對倍稀釋濃度的桂皮醛及VRC兩兩組合加入96孔板各孔中，每種藥物加入量為50 μL，將100 μL制備好的孢子懸液加入各孔。生長對照孔僅含100 μL孢子懸液及100 μL RPMI-1640培養(yǎng)基，無菌對照孔僅含200 μL RPMI-1640培養(yǎng)基，35℃孵育48 h后觀察結(jié)果。分別記錄2藥聯(lián)用后產(chǎn)生最佳抑菌效應(yīng)時各自的MIC值，作為各自聯(lián)用的MIC。每個菌株均按照上述方法進(jìn)行3次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.4聯(lián)合抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果評價（1）依據(jù)測得桂皮醛、VRC單用和聯(lián)用的MIC，分別計算2藥單用及聯(lián)用對42株受試煙曲霉的MIC幾何均數(shù)（MICG）、MIC50及MIC90，并比較MICG單用與聯(lián)用的差異。（2）繪制桂皮醛、VRC單用與聯(lián)用的MIC分布圖，觀察單用與聯(lián)用MIC峰值分布情況。（3）分別統(tǒng)計桂皮醛、VRC單用及聯(lián)用時，對所有受試菌株在各濃度點(diǎn)的累積抑菌百分率，以藥物濃度為橫坐標(biāo)，累積抑菌百分率為縱坐標(biāo)，繪制濃度累積抑菌百分率曲線。（4）計算桂皮醛與VRC聯(lián)用的分級抑菌濃度指數(shù)（FICI）：FICI=（桂皮醛聯(lián)用的MIC/桂皮醛單用的MIC）＋（VRC聯(lián)用的MIC/VRC單用的MIC）。以FICI≤0.5為協(xié)同作用；0.5＜FICI≤1為相加作用；1＜FICI≤2為無關(guān)作用；FICI＞2為拮抗作用，F(xiàn)ICI值越小，協(xié)同作用越明顯［5］。

1.4統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。藥物單用與聯(lián)用的MICG比較采用Wilcoxon符號秩和檢驗(yàn)，行×列表資料采用趨勢卡方檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1單藥MIC測定結(jié)果桂皮醛單藥對42株受試煙曲霉菌的MIC范圍在64～256 mg/L；VRC單藥的MIC范圍在0.25～2 mg/L。每次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)測得VRC單藥對質(zhì)控菌株ATCC22019的MIC均為2 mg/L，均符合CLSI M38-A2指南的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)，且生長對照孔生長良好，實(shí)驗(yàn)結(jié)果可靠。42株受試煙曲霉菌中，4株為VRC劑量依賴性敏感株，38株為VRC敏感株。

2.2桂皮醛與VRC聯(lián)合抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果及評價

2.2.1桂皮醛、VRC單用與聯(lián)用MIC及其峰值分布情況比較（1）桂皮醛與VRC聯(lián)合使用對42株受試煙曲霉的MIC50、MIC90均較各自單用時低，MICG差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），見表1。（2）2藥聯(lián)用后的MIC峰值分布均較單用時左移，且4株VRC劑量依賴性菌株的MIC均降至＜1 mg/L，即敏感范圍之內(nèi)，見圖1。

Tab.1The MICs of Cinnamaldehyde and VRC alone or in combination against 42 iaolates of Aspergillus fumigatus表1 桂皮醛與VRC單用與聯(lián)用對42株受試煙曲霉菌的MIC（mg/L）

Fig.1The MICs distribution of VRC and Cinnamaldehyde alone or in combination圖1 桂皮醛、VRC單用與聯(lián)用的MIC分布圖（n=42）

2.2.2桂皮醛與VRC聯(lián)用的濃度-抑菌百分率曲線及FICI分布（1）2藥聯(lián)用后的曲線與各自單用時相比，均表現(xiàn)為左移，即同一藥物在相同濃度下，聯(lián)合使用時的累積抑菌百分率比單用時高，見圖2。（2）桂皮醛與VRC聯(lián)用后對42株受試煙曲霉的FICI值范圍在0.187 5～1.5，其中有16株（38.10%）FICI≤0.5，為協(xié)同作用；19株（45.23%）0.5＜FICI≤1，為相加作用；7株（16.67%）1＜FICI≤2為無關(guān)作用；未見拮抗作用。隨著菌株對VRC的MIC值增高，2藥聯(lián)用的FICI均數(shù)越小，協(xié)同作用越明顯（P＜0.001），見表2。

Fig.2Percentage curves of concentration-accumulative inhibition for Cinnamaldehyde and VRC alone or in combination圖2 桂皮醛、VRC單用及聯(lián)用的濃度-累積抑菌百分率曲線

Tab.2Comparison of Cinnamaldehyde in combination with different MICs of VRC against 42 Aspergillus fumigatus iaolates表2 桂皮醛與VRC聯(lián)用對VRC敏感性不同的煙曲霉菌臨床分離株FICI分布

3 討論

耐藥菌株的感染是導(dǎo)致IA治療失敗的原因之一［2］。大劑量使用抗真菌藥物，不僅無法有效殺滅耐藥煙曲霉菌，還給機(jī)體帶來更多的不良反應(yīng)，增加患者經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。當(dāng)前，采用聯(lián)合用藥的方式以及從天然中草藥中尋找高效低毒的抗真菌活性成分，是解決煙曲霉菌耐藥問題的理想策略。

桂皮醛是從樟科藥用植物肉桂的樹皮中提取的單體活性成分，屬苯丙醛類化合物，且為中藥復(fù)方麻黃湯的有效成分之一，具有毒性低、取材便利、價格低廉且不易誘導(dǎo)耐藥等優(yōu)點(diǎn)。本研究結(jié)果表明，桂皮醛單藥可抑制42株來源于不同患者的煙曲霉菌，且MIC波動范圍不大，證實(shí)其抗煙曲霉菌活性確切、穩(wěn)定，與Khan等［3］研究結(jié)論一致。由于桂皮醛還具有揮發(fā)油特性，因此在霧化吸入型抗真菌劑的研發(fā)及呼吸道IA治療方面具有較好的應(yīng)用前景。桂皮醛與VRC聯(lián)用后，2藥的MIC50、MIC90、MICG均較單用時降低，MIC分布峰值左移，表明2藥聯(lián)用比單用抗煙曲霉菌效果更好。聯(lián)用后濃度-累積抑菌百分率曲線均較各自單用時明顯左移，證實(shí)聯(lián)合用藥具有組合效應(yīng)，同一藥物濃度下，聯(lián)用可以抑制更多菌株的生長。由FICI分布可看出，該藥物組合對絕大多數(shù)受試的煙曲霉菌均體現(xiàn)出協(xié)同或相加抗菌活性，提示臨床上可考慮通過這兩種藥物的組合使用，以達(dá)到增強(qiáng)抗煙曲霉菌效果、提高治療效率的目的，同時還可降低相關(guān)不良反應(yīng)，防止誘導(dǎo)耐藥的發(fā)生。進(jìn)一步比較對VRC敏感性不同的菌株中FICI的分布特點(diǎn)發(fā)現(xiàn)，隨著菌株對VRC的敏感性降低，F(xiàn)ICI均值越小，協(xié)同抗煙曲霉菌作用越明顯。尤其受試的4株劑量依賴性敏感煙曲霉菌，2藥聯(lián)用后的MIC較各自單用時下降1/4～1/8，且均表現(xiàn)出較強(qiáng)的協(xié)同作用，VRC的MIC可降低至≤1 mg/L的敏感范圍之內(nèi)，提示該藥物組合可能具有抗VRC耐藥煙曲霉菌的潛力。2藥聯(lián)用效果表現(xiàn)為無關(guān)作用主要集中在對VRC敏感性較高的菌株中。由此可見，桂皮醛與VRC聯(lián)用對VRC敏感性較低的菌株比敏感性較高菌株發(fā)揮出的協(xié)同抗菌作用更強(qiáng)。筆者推測這一現(xiàn)象可能與桂皮醛在聯(lián)合用藥過程中發(fā)揮增敏作用，逆轉(zhuǎn)菌株的耐藥性有關(guān)。但由于本研究收集到VRC劑量依賴性敏感及耐藥的菌株數(shù)量偏少，且分離自不同患者個體的菌株由于起源、遺傳變異等因素可能會導(dǎo)致藥物敏感性產(chǎn)生差異，因此證實(shí)這一推論有待今后增加樣本量及對同源性VRC耐藥菌株的專項(xiàng)研究。

VRC作為當(dāng)前臨床治療IA的首選藥，作用靶點(diǎn)相對單一，主要通過抑制煙曲霉菌細(xì)胞內(nèi)14-α-去甲基酶的活性，阻斷細(xì)胞色素P450介導(dǎo)的細(xì)胞膜主要成分麥角甾醇的合成，使菌細(xì)胞因膜缺陷而發(fā)生滲透性溶解、死亡。桂皮醛的抗真菌機(jī)制則是多途徑的，不僅可以作用于細(xì)胞膜，還能破壞真菌的細(xì)胞壁，一旦與VRC聯(lián)用，VRC可借助桂皮醛對細(xì)胞壁的破壞作用，更容易滲透入細(xì)胞壁內(nèi)部的效應(yīng)靶位［7］。桂皮醛還具有高度脂溶性，可直接穿透細(xì)胞膜，進(jìn)入到菌細(xì)胞內(nèi)影響菌體DNA、RNA及蛋白質(zhì)的合成［8］。因此，桂皮醛與VRC聯(lián)合產(chǎn)生協(xié)同作用的機(jī)制可能與藥物作用靶點(diǎn)增加有關(guān)。此外，近期研究表明，煙曲霉菌對藥物主動外排作用增強(qiáng)［9］以及形成生物被膜［10］，亦為其耐藥性產(chǎn)生的原因。目前已有文獻(xiàn)報道，桂皮醛能抑制和破壞白色念珠菌的生物被膜，降低其耐藥性［11］，提示桂皮醛也有可能通過抑制和破壞煙曲霉菌生物膜，從而協(xié)同VRC發(fā)揮抗耐藥煙曲霉菌的作用。目前關(guān)于桂皮醛對真菌的藥物外排泵的相關(guān)作用尚少見報道，因此其聯(lián)合VRC發(fā)揮協(xié)同或相加抗煙曲霉菌作用涉及的具體分子機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。

本研究為桂皮醛聯(lián)合VRC用于抗煙曲霉菌感染提供了體外實(shí)驗(yàn)依據(jù)，該藥物組合能否真正應(yīng)用于臨床IA的治療，應(yīng)在后續(xù)動物體內(nèi)進(jìn)行藥代動力學(xué)、藥效學(xué)及毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)加以證實(shí)。

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（2015-02-04收稿 2015-03-25修回）

（本文編輯 陸榮展）

In vitro efficacy of the combination of Cinnamaldehyde and Voriconazole on Aspergillus fumigatus isolates

LUO Jin，CHEN Yiqiang，KONG Jinliang△，HUANG Hong，HOU Changchun，LI Bing，DONG Biying
Institute of Respiratory Disease，F(xiàn)irst Affiliated Hospital of Guangxi Medical University，Nanning 530021，China△

ObjectiveTo evaluate the in vitro antifungal activity of Cinnamaldehyde in combination with Voriconazole（VRC）against clinically isolated Aspergillus fumigatus strains.MethodsAccording to the Clinical and Laboratory Stan?dards Institute（CLSI）M38-A2 document，the minimal inhibitory concentrations（MIC）of Cinnamaldehyde and VRC alone or in combination against 42 clinical Aspergillus fumigatus isolates were determined by both microdillution method and check?board method respectively.The MIC50，MIC90，MICG and MICs distribution were compared between single drug and both in combination.The concentration-accumulative curve was drawn and fractional inhibitory concentration index（FICI）was cal?culated to evaluate the interaction between two test agents.ResultsThe values of MIC50，MIC90and MICG were significant?ly decreased（P＜0.001）when combination of the two drugs than those of their single use，with their MIC distribution concen?tration-accumulative curves shifted to the left.The value of FICI of Cinnamaldehye-VRC combination ranged from 0.187 5 to 1.5.Sixteen strains（38.10%）of them showed the synergistic effect，19 strains（45.23%）showed additive effect，and 7 strains（16.67%）showed an unrelated effect，and no antagonist effect on tested Aspergillus fumigatus strains in vitro.Conclu?sionCinnamaldehye in combination with VRC mainly shows a combined synergic and additive inhibitory effect on Asper?gillus fumigatus isolates，and this combination appears to be more active against the test strains，which are less susceptible to voriconazole.

drug therapy，combination；in vitro；Cinnamaldehyde；Voriconazole；Aspergillus fumigatus

R978.5，R379.6

A

10.11958/j.issn.0253-9896.2015.07.020

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81260002）

廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院呼吸疾病研究所（郵編530021）

羅勁（1989），男，碩士研究生在讀，主要從事肺部感染性疾病的基礎(chǔ)研究

△通訊作者E-mail：kongjl2013@126.com