楊振泉，靳彩娟，張咪，王曉霖，高璐，顧瑞霞

（1.揚(yáng)州大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇揚(yáng)州225127；2.江蘇省乳品生物技術(shù)與安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇揚(yáng)州225127）

高粘附性戊糖片球菌的篩選、標(biāo)記及其表面疏水與自凝聚性特征

楊振泉1，2，靳彩娟1，張咪1，王曉霖1，高璐1，顧瑞霞1，2

（1.揚(yáng)州大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇揚(yáng)州225127；2.江蘇省乳品生物技術(shù)與安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇揚(yáng)州225127）

通過(guò)常規(guī)乳酸菌分離技術(shù)結(jié)合形態(tài)觀察、生理生化試驗(yàn)，以及16S rDNA同源性分析等方法，從臭豆腐發(fā)酵鹵水中分離獲得7株戊糖片球菌分離株，并通過(guò)隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA技術(shù)構(gòu)建了不同菌株的特征指紋圖譜；以Caco-2細(xì)胞和固定化腸黏液蛋白質(zhì)作為體外模型，研究了菌株的粘附能力，并探討了菌株粘附能力與基因型以及表面疏水性、自凝聚能力等表型特征的相關(guān)性。結(jié)果顯示，發(fā)酵鹵水中的戊糖片球菌存在高度分子多樣性，7個(gè)分離株中存在6種不同的指紋圖譜模式，其中A5型菌株（F28-8和Y27-4）對(duì)Caco-2細(xì)胞和腸黏液蛋白質(zhì)的粘附性最強(qiáng)，并顯示了高度的疏水性（＞90%）和較強(qiáng)的自凝聚能力（＞25%）。相關(guān)性分析表明，戊糖片球菌表面疏水率和自凝聚率與Caco-2細(xì)胞粘附率測(cè)定結(jié)果呈顯著正相關(guān)（r=0.900和0.792，P＜0.05），但是與腸黏液蛋白質(zhì)粘附率測(cè)定結(jié)果相關(guān)性不顯著（r=0.426和0.700，P＞0.05）。研究成果為建立高粘附性戊糖片球菌快速篩選方法及其體內(nèi)定植和分布研究提供了依據(jù)。

戊糖片球菌，粘附性，表面疏水性，自凝聚能力，DNA指紋圖譜

戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）廣泛分布于腌制和泡制蔬菜、干酪、香腸等傳統(tǒng)發(fā)酵食品中，對(duì)提高發(fā)酵食品的營(yíng)養(yǎng)、風(fēng)味及安全性具有重要作用［1-2］。該菌代謝糖類產(chǎn)生乳酸，并產(chǎn)生IIa類片球菌素，對(duì)病原菌及腐敗微生物產(chǎn)生強(qiáng)烈的抑制效應(yīng)［3］。已有的研究表明，戊糖片球菌的一些菌株具有提高機(jī)體的天然免疫能力、促進(jìn)健康以及抵抗病原菌的侵襲等益生特性［4-5］，具有用于人類或動(dòng)物的微生態(tài)制劑的開(kāi)發(fā)潛力。菌株粘附能力是微生態(tài)制劑在腸道發(fā)揮生態(tài)效應(yīng)和生理作用的重要基礎(chǔ)，篩選高粘附性菌株對(duì)微生態(tài)制劑開(kāi)發(fā)具有重要意義，但目前國(guó)內(nèi)外對(duì)戊糖片球菌粘附特性及其機(jī)制的研究尚不多見(jiàn)。利用人結(jié)腸癌細(xì)胞系Caco-2評(píng)價(jià)乳酸菌的粘附能力是目前廣泛使用的體外模型和方法［6］，但是沒(méi)有考慮到腸道內(nèi)覆蓋在腸上皮細(xì)胞外層的腸黏液的作用［7］，固定化小腸黏液蛋白質(zhì)模型能夠反映乳酸菌在體內(nèi)與腸黏液的作用［8］，結(jié)合這兩種模型可以較好地評(píng)價(jià)乳酸菌的粘附特性，但是這兩種模型需要復(fù)雜的細(xì)胞培養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物操作，價(jià)格昂貴，不利于大規(guī)模的菌株篩選。

細(xì)菌表面疏水性和自凝聚性與粘附特性密切相關(guān)。表面疏水性是決定細(xì)菌非特異性粘附到生物表面的重要?jiǎng)恿?，在乳酸菌向腸壁粘附和定植的過(guò)程中發(fā)揮重要的作用［9］。自凝聚特性有助于細(xì)菌形成生物膜并在宿主腸道定植，阻止病原菌的粘附和侵襲，并且與致病菌的清除存在一定關(guān)聯(lián)［10］。目前已有研究表明，在部分雙歧桿菌和乳酸桿菌菌種中，基于菌株的表面疏水性和自凝聚能力與其對(duì)腸上皮細(xì)胞粘附能力的相關(guān)性，可以應(yīng)用簡(jiǎn)單廉價(jià)的凝聚性和疏水性測(cè)定方法替代昂貴的細(xì)胞和動(dòng)物評(píng)價(jià)模型對(duì)菌株的粘附能力進(jìn)行預(yù)測(cè)和初步篩選［11］，對(duì)從大量菌株中篩選高粘附性菌株，縮小試驗(yàn)范圍和降低成本具有重要意義。但是，目前對(duì)于戊糖片球菌的粘附能力和表面疏水性以及自凝聚能力之間的相關(guān)性還需要進(jìn)一步數(shù)據(jù)證實(shí)。本研究中從臭豆腐發(fā)酵鹵水中分離鑒定了7株戊糖片球菌，通過(guò)Caco-2細(xì)胞和固定化小腸黏液蛋白質(zhì)模型，比較了不同菌株的粘附能力，并探討了粘附能力與菌株基因型、表面疏水性以及自凝聚特性的相關(guān)性，為高粘附性戊糖片球菌菌株高效定向篩選及微生態(tài)制劑開(kāi)發(fā)提供了候選菌株和依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1主要試劑PCR試劑、溶菌酶、蛋白酶K，均購(gòu)自上海生工生物工程有限公司；MRS培養(yǎng)基以及細(xì)菌生化鑒定試劑，廣州環(huán)凱生物試劑有限公司產(chǎn)品；細(xì)菌16SrDNA擴(kuò)增引物8F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’和15R：5’-AAGGAG GTGATCCAGCCGCA-3’，以及DNA指紋圖譜擴(kuò)增隨機(jī)引物M13：5'-GAGGGTGGCGGTTCT-3'和M14：5'-GAG GGTGGGGCCGTT-3'，均由上海生工生物工程有限公司合成；其它化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.2主要儀器設(shè)備ABI2720型熱循環(huán)儀，美國(guó)Life Technologies公司制造；凝膠成像系統(tǒng)，法國(guó)Vilber Lourmat公司制造；UV-7504C分光光度計(jì)，上海欣茂儀器有限公司制造；Elx-800型酶標(biāo)儀，美國(guó)Bio-Tek公司制造；顯微鏡，日本Olympus公司制造；S-4800型場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡，日本日立公司制造；Heracell 240i CO2培養(yǎng)箱，美國(guó)Thermo Scientific公司制造。

1.1.3細(xì)胞與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物Caco-2細(xì)胞株，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心；DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清、質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.25%胰蛋白酶、DHank′s緩沖液，均購(gòu)自GIBCO公司；青霉素和鏈霉素，美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品；6周齡ICR實(shí)驗(yàn)小鼠，購(gòu)自揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心。

1.2方法

1.2.1戊糖片球菌的分離及生理生化鑒定臭豆腐發(fā)酵鹵水樣品分別采集自揚(yáng)州本地不同臭豆腐生產(chǎn)作坊。發(fā)酵鹵水樣品充分混勻后用滅菌生理鹽水10倍稀釋。吸取250 μL不同稀釋度樣品液涂布含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.75%CaCO3的MRS平板，放入?yún)捬豕蓿?7℃恒溫培養(yǎng)48 h，選擇分離程度較好的平板挑取有溶鈣圈的單菌落，在MRS平板上反復(fù)劃線純化，按文獻(xiàn)［12］所述的方法對(duì)接觸酶陰性、產(chǎn)酸的革蘭氏陽(yáng)性球菌進(jìn)行耐鹽性、溫度、耐酸堿、動(dòng)力學(xué)以及糖和氨基酸發(fā)酵試驗(yàn)，細(xì)菌的細(xì)胞微觀形態(tài)采用掃描電鏡觀察。

1.2.2細(xì)菌基因組DNA提取基因組DNA的制備按文獻(xiàn)［13］所述的CTAB法進(jìn)行，并作適當(dāng)改良。吸取48 h培養(yǎng)物1.5 mL置于離心管中，10 000 r/ min離心5 min，收集細(xì)胞；細(xì)胞用TE緩沖液洗滌2次后重懸于567 μL TE緩沖液中，加入30 μL質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%SDS和5 μL 20 mg/mL蛋白酶K，顛倒混勻，37℃溫育1 h；加入100 μL 5 mol/L的NaCl溶液，混勻后加入80 μL CTAB-NaCl溶液，65℃水浴10 min。用酚-氯仿-異戊醇（體積比25∶24∶1）抽提兩次，上清液加2倍體積的無(wú)水乙醇和0.1倍體積的3 mol/L NaAc，-20℃靜置1 h；10 000 r/min離心5 min收集沉淀，用體積分?jǐn)?shù)70%乙醇洗滌兩次，沉淀經(jīng)真空冷凍干燥2 h后用40 μL TE緩沖液溶解，加入1 μL 10 mg/L的RNA酶，37℃消化1 h。提取物用核酸測(cè)定儀測(cè)定總DNA濃度，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.316S rDNA PCR擴(kuò)增與測(cè)序鑒定以細(xì)菌基因組DNA為模板進(jìn)行16S rDNA的PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系（50 μL）包括：2 μL模板（50 ng/μL）、2 μL dNTPs（10 mmol/L）、引物8F（10 pmol/μL）和15R（10 pmol/μL）各2.0 μL，以及5 μL 10×Buffer、5 μL MgCl2（25 mmol/L）、0.3 μL Tag酶（5 U/μL），最后加ddH2O補(bǔ)足至50 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5 min；94℃變性40 s，50℃退火35 s，72℃延伸2.0 min，35次循環(huán)；72℃延伸10 min。取7.0 μL PCR產(chǎn)物用質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)片段大小，其余PCR產(chǎn)物委托上海生物工程有限公司測(cè)序，所得序列在GenBank（http：//www.ncbi. nlm.nih.gov）數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行在線比對(duì)，序列同源性大于99%設(shè)為相同種。

1.2.4菌株分子指紋圖譜鑒別菌株之間的基因型差異通過(guò)RAPD指紋圖譜鑒別。以細(xì)菌基因組DNA為模板，應(yīng)用M13和M14隨機(jī)引物進(jìn)行RAPD擴(kuò)增。將DNA提取物用ddH2O稀釋至100 ng/μL，隨機(jī)引物濃度稀釋至10 pmol/μL；優(yōu)化的PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為：模板2.0 μL，dNTPs 0.5 μL，隨機(jī)引物2.0 μL，10×Buffer 2.5 μL，MgCl22.5 μL，Tag酶0.3 μL，ddH2O 15.7 μL；RAPD反應(yīng)循環(huán)參數(shù)為：95℃預(yù)變性2 min，94℃變性1 min；53℃退火1 min；72℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)；72℃補(bǔ)充延伸8 min。取10 μL產(chǎn)物在質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.5%的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳（電壓5 V/cm）1.5 h，EB染色20 min，凝膠成像系統(tǒng)拍照記錄，根據(jù)條帶清晰程度、彌散背景以及帶型強(qiáng)弱情況選擇穩(wěn)定的指紋圖譜進(jìn)行分析。

1.2.5指紋圖譜聚類分析根據(jù)在指紋圖譜中同一遷移率位點(diǎn)上的擴(kuò)增條帶的“有”和“無(wú)”進(jìn)行數(shù)字化處理，用“1”表示“有”，“0”表示“無(wú)”，建立矩陣，應(yīng)用DPS7.05數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)中的0-1系統(tǒng)聚類分析程序，選擇Nei氏遺傳距離和類平均法進(jìn)行聚類分析。

1.2.6菌株表面疏水性測(cè)定參照文獻(xiàn)［8］應(yīng)用微生物粘著碳?xì)浠衔铮∕icrobial Adhesion To Hydrocarbons，MATH）法測(cè)定菌株的表面疏水性。取36 h細(xì)菌培養(yǎng)物4 000 r/min離心10 min收集菌體，生理鹽水洗滌兩次，5 000 r/min離心10 min。以生理鹽水調(diào)整受試菌株菌液濃度，使菌懸液在600 nm波長(zhǎng)下A值約為1.0（A600=1.0）。取2 mL菌懸液與2 mL二甲苯混合，渦旋120 s，室溫靜置30 min分層。取1 mL水相，以生理鹽水為空白對(duì)照組，測(cè)定A600，每株細(xì)菌平行做3管重復(fù)。細(xì)菌表面疏水率（CSH）計(jì)算：

式（1）中：H即CSH，A0和A分別是與二甲苯混勻前后水相測(cè)定所得的A600值。

1.2.7菌株自凝聚能力測(cè)定菌株自凝聚能力測(cè)定參照文獻(xiàn)［14］進(jìn)行。菌株懸液制備同1.2.6。取4 mL制備好的菌懸液（A600=1.0）置于10 mL帶刻度的螺口試管中，室溫靜置分層，分別在靜置1、2、3、4、5 h后吸取1 mL上層懸液測(cè)A600值，分別記作A1、A2、A3、A4、A5，每個(gè)菌株每個(gè)時(shí)間點(diǎn)平行做3管重復(fù)。細(xì)菌自凝聚率（AA）計(jì)算：

式（2）中：C即AA，A0和At分別是自凝聚前后上層懸液在600 nm下測(cè)量所得的A值。

1.2.8菌株對(duì)Caco-2細(xì)胞的粘附能力測(cè)定采有Caco-2細(xì)胞作為體外模型測(cè)試菌株的粘附能力。Caco-2細(xì)胞用添加體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清和100 U/mL青鏈雙抗的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)，細(xì)胞于體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)，2 d換液一次。細(xì)胞用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.25%胰酶消化并轉(zhuǎn)移到24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，于37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至單層細(xì)胞形成。戊糖片球菌用MRS活化兩代，離心收集菌體，PBS洗2次，用不含胎牛血清和抗生素的DMEM培養(yǎng)液重懸菌體。傾去Caco-2細(xì)胞培養(yǎng)板中的培養(yǎng)液，用無(wú)菌PBS沖洗2次，然后加入0.5 mL菌懸液，培養(yǎng)1 h后用無(wú)菌PBS洗滌4次，洗去未粘附的菌體，加入1 mL Triton 100（體積分?jǐn)?shù)1%），使粘附的菌體同細(xì)胞分離，吹打混勻，梯度稀釋平板法測(cè)定粘附細(xì)菌數(shù)。用細(xì)菌數(shù)與陰性對(duì)照孔中的細(xì)胞數(shù)的比值（cfu/cell）表示菌株對(duì)Caco-2細(xì)胞的粘附能力。

1.2.9菌株對(duì)小腸黏液的粘附能力測(cè)定參照文獻(xiàn)［15］方法制備小腸黏液，將6周齡ICR小鼠固定24 h后解剖，取小腸置于冰面，用無(wú)菌PBS（pH 7.2，0.01 mol/L）沖洗小腸3次后縱向剪開(kāi)，刮取小腸內(nèi)表面黏液，加入2倍體積的PBS緩沖液，混勻，然后12 000 r/min、4℃離心10 min，收集上清液，用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定黏液蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度，分裝后-20℃保存?zhèn)溆?。?.0 mL不同濃度的戊糖片球菌懸液于離心管中，10 000 r/min離心10 min，棄上清液，加入1.0 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%結(jié)晶紫溶液染色50 min后離心收集菌體，PBS洗滌5次后加入1.0 mL檸檬酸鹽緩沖液重懸，室溫放置60 min后測(cè)定A540，建立A540和菌懸液細(xì)胞數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。再參考Vesterlund等建立的方法［16］測(cè)定菌株對(duì)小腸黏液的粘附能力。取96孔板，每孔加入100 μL鼠小腸黏膜提取液（蛋白質(zhì)2.0 mg/mL），4℃過(guò)夜固定。每孔加入100 μL菌懸液，4℃孵育2 h傾去懸液并用PBS緩沖液洗滌4次，除去未粘附的細(xì)菌。將96孔板置于60℃烘箱30 min。每孔加入100 μL質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%結(jié)晶紫溶液染色50 min，250 μL PBS洗滌5次，加入100 μL檸檬酸鹽緩沖液（pH 4.3，0.02 mol/L），室溫放置60 min后測(cè)定A540，并根據(jù)建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算多孔板中粘附的細(xì)菌數(shù)量，以粘附細(xì)菌數(shù)和加入細(xì)菌數(shù)的百分?jǐn)?shù)表示菌株的粘附能力。

1.2.10數(shù)據(jù)分析菌株表面疏水率、自凝聚率以及粘附指數(shù)試驗(yàn)結(jié)果取3次試驗(yàn)的平均值，以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，菌株間差異及數(shù)據(jù)間的相關(guān)性采用Sigmaplot 10.0軟件中的t檢驗(yàn)和線性回歸模式進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果與分析

2.1戊糖片球菌分離鑒定結(jié)果

通過(guò)改良MRS平板分離和厭氧培養(yǎng)在采集的不同來(lái)源的臭豆腐發(fā)酵鹵水樣品中均分離得到大量革蘭氏陽(yáng)性、接觸酶陰性的產(chǎn)酸菌株，其中菌株F28-8、Y45-30、F3、Y27-4、H13、H6和H10的細(xì)胞形態(tài)呈二聯(lián)或四聯(lián)球狀的分離株，如圖1（a）所示，掃描電鏡結(jié)果顯示分離株的細(xì)胞形態(tài)以四聯(lián)球?yàn)橹鳎⑶页善奂谝黄?，如圖1（b）所示。這7個(gè)菌株具有相同的生理生化特征，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1所示，根據(jù)伯杰細(xì)菌手冊(cè)［17］及常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)［12］描述，這7株球菌菌株均具有典型的戊糖片球菌的生理生化特征。進(jìn)一步提取7個(gè)球菌分離株的基因組DNA并進(jìn)行16S rDNA擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物和預(yù)期大小一致（1 500 bp左右）。將擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果在基因庫(kù)GenBank（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov）中進(jìn)行Blasten比對(duì)，結(jié)果如表2所示，序列同源性相似性最高的均為戊糖片球菌（最大同源性＞99%），只是不同的菌株在GenBank中相似度最高的菌株有所不同。因此，這7個(gè)分離株均屬于戊糖片球菌種，但可能屬不同的基因型。

圖1　戊糖片球菌分離株的細(xì)胞形態(tài)Fig.1　Cell morphology of Pediococcus pentosaceus strains

表1　戊糖片球菌分離株的生理生化鑒定結(jié)果Table 1　Resultsofphysiologicalandbiochemical characteristicsofPediococcuspentosaceus strains

表2　戊糖片球菌分離株16S rDNA測(cè)序鑒定結(jié)果Table 2　Sequencing results of 16S rDNA identification of Pediococcus pentosaceus strains

2.2戊糖片球菌的菌株分子多樣性

應(yīng)用RAPD分子分型方法對(duì)7株戊糖片球菌分離株的基因型進(jìn)行分析，兩種不同隨機(jī)引物M13和M14的擴(kuò)增譜帶模式如圖2所示。M13擴(kuò)增得到2個(gè)不同的指紋圖譜（A型和B型），M14擴(kuò)增得到5個(gè)不同的指紋圖譜，分別為1型、2型、3型、4型和5型。將兩種譜帶模式進(jìn)行組合分型，獲得了6種基因型，表明發(fā)酵鹵水中的戊糖片球菌存在高度的分子多樣性，其中H6為A1型，H10為B2型，H13為B3型，F(xiàn)3為A4型，Y45-30為A6型，菌株F28-8和Y27-4譜型相同均為A5型。將菌株的特征指紋圖譜中的擴(kuò)增條帶按“有”和“無(wú)”進(jìn)行數(shù)字化處理，應(yīng)用Nei氏遺傳距離和類平均法進(jìn)行聚類分析，結(jié)果顯示在Nei氏遺傳距離為0.30處，可以分成4簇，其中第1簇包含菌株H6、F28-8、Y27-4和Y45-30，顯示了這4個(gè)菌株具有較為相似的基因型，而F3、H10和H13各自形成一簇，表明菌株間基因型具有較大的差異性。

2.3不同戊糖片球菌菌株細(xì)胞表面特性及粘附能力測(cè)定結(jié)果

7株不同戊糖片球菌細(xì)胞表面特性及粘附能力測(cè)定結(jié)果如圖3所示。MATH法測(cè)定表面疏水率結(jié)果顯示7株戊糖片球菌的表面疏水性存在高度的菌株差異性，如圖3（a）所示，不同菌株的表面疏水率大小介于12.7%～97.1%，其中3個(gè)基因型高度相似的菌株F28-8、Y27-4和Y45-30顯示了高度疏水性，疏水率分別為96.5%，97.1%和93.6%。而菌株F3和H13的疏水率為12.7%和24.2%，顯著低于其它菌株（P﹤0.01），為弱疏水性菌株。應(yīng)用分光光度法對(duì)7株戊糖片球菌在渦旋后靜置1～5 h的自凝聚性進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如圖3（b）所示。結(jié)果顯示，菌株懸液渦旋振蕩以后隨著靜置時(shí)間的延長(zhǎng)自凝聚率逐漸增大，菌株間的自凝聚率具有顯著差異，其中菌株F28-8、Y27-7在2 h后的各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的凝聚率均顯著高于其它菌株（P＜0.01），顯示了較高的自凝聚能力。而菌株F3和H13顯示了較弱的自凝聚能力。應(yīng)用Caco-2細(xì)胞作為模型研究了7株戊糖片球菌對(duì)腸上皮細(xì)胞的粘附性，結(jié)果如圖3（c）所示。結(jié)果表明，不同菌株的Caco-2細(xì)胞粘附率在12.8～57.4 cfu/cell之間，其中高疏水性菌株F28-8、Y27-4和Y45-30具有較高的粘附性，細(xì)胞粘附率分別為57.4、46.5 cfu/cell和51.7 cfu/cell，而弱疏水性菌株F3和H13細(xì)胞粘附率分別為12.8、10.6 cfu/ cell，顯示了相對(duì)較低的細(xì)胞粘附性。通過(guò)提取小鼠的腸黏液蛋白質(zhì)建立體外模型測(cè)定了7株戊糖片球菌對(duì)腸黏液的粘附率，結(jié)果如圖3（d）所示。不同菌株對(duì)腸黏液蛋白質(zhì)顯示了不同的粘附率，其中菌株F28-8和Y45-30顯示了較高的粘附性，分別為35.2%和25.8%，顯著高于其它菌株（P＜0.01），菌株H13、H6和H10的粘附率分別為9.7%、5.7%和4.3%，顯示了相對(duì)較低的粘附性。

圖2　不同戊糖片球菌分離株的RAPD指紋圖譜及聚類分析Fig.2　RAPD fingerprinting and clustering analysis of different Pediococcus pentosaceus strains

圖3　不同戊糖片球菌表面疏水性、自凝聚能力以及對(duì)Caco-2細(xì)胞和腸黏膜蛋白質(zhì)的粘附能力比較Fig.3　Comparison of surface hydrophobicity，autoaggregation ability，and adhesion ability to Caco-2 cell andintestinalmucusofdifferentPediococcus pentosaceus strains

2.4相關(guān)性分析結(jié)果

將不同戊糖片球菌菌株的Caco-2細(xì)胞粘附率、黏液蛋白質(zhì)粘附率、表面疏水率和自凝聚率（2 h）數(shù)據(jù)兩兩組合進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，繪制相關(guān)性散點(diǎn)圖（如圖4（a）—（f）所示），并用線性模型模擬它們之間的關(guān)系。結(jié)果表明戊糖片球菌不同菌株對(duì)Caco-2細(xì)胞粘附性和腸黏液蛋白質(zhì)的粘附率呈顯著正相關(guān)（r=0.763，P=0.046，圖4（f）），可能Caco-2細(xì)胞和腸黏液蛋白質(zhì)中存在共同的戊糖片球菌粘附素受體。菌株的表面疏水率和自凝聚率（2 h）與Caco-2細(xì)胞粘附率呈顯著正相關(guān)（r=0.900和0.792，P＜0.05，圖4（a）（d）），但是與腸黏液蛋白質(zhì)粘附率相關(guān)性不顯著（r=0.426和0.700，P＞0.05，圖4（b）（e）），可能原因是戊糖片球菌在與Caco-2細(xì)胞粘附中表面疏水性和自凝聚能力等非特異粘附發(fā)揮了主要作用，而在腸黏液蛋白質(zhì)作用體系中“粘附素-受體”特異性粘附起主要作用，表面疏水性和自凝聚能力影響較小。疏水性與自凝聚的相關(guān)性分析結(jié)果顯示，兩者呈正相關(guān)趨勢(shì)（r=0.727），但不顯著（P= 0.064，圖4（c）），疏水性是細(xì)菌發(fā)生自凝聚的主要驅(qū)動(dòng)力，但是受多種因素的影響，如細(xì)菌表面組分和結(jié)構(gòu)等，但是總體看來(lái)疏水性較高的菌株如F28-8和Y27-4自凝聚率也相對(duì)較高。

圖4　戊糖片球菌細(xì)胞表面特性與粘附能力的相關(guān)性分析Fig.4　Correlation analysis between cell surface characteristics and adhesion abilities of Pediococcus pentosaceus strains

3　討論

由于抗生素在人類疾病治療和動(dòng)物飼養(yǎng)中的大量使用，導(dǎo)致環(huán)境中抗生素的積累和耐藥性菌株的不斷出現(xiàn)，對(duì)環(huán)境和食品安全帶來(lái)了威脅。微生態(tài)制劑因其能夠改善胃腸道功能、提高動(dòng)物免疫力，在疾病預(yù)防和動(dòng)物飼養(yǎng)中得到了大量推廣和應(yīng)用。戊糖片球菌由于其獨(dú)特的抗菌性能和免疫調(diào)節(jié)功能而具有良好應(yīng)用前景［4-5，18-19］。目前普遍認(rèn)為粘附能力是益生菌發(fā)揮生理作用的前提，也是決定這種益生菌制劑實(shí)際效果的重要因素［20］。本課題研究中從臭豆腐發(fā)酵鹵水中分離鑒定了7株戊糖片球菌，DNA指紋圖譜顯示具有高度的種內(nèi)分子多樣性。應(yīng)用Caco-2細(xì)胞系和固定化腸黏液蛋白質(zhì)兩種體外模型評(píng)價(jià)了7株戊糖片球菌分離株的粘附性，結(jié)果顯示特征指紋圖譜為A5型的兩個(gè)菌株（F28-8和Y27-4）顯示了最高的Caco-2細(xì)胞和腸黏液蛋白質(zhì)粘附能力。

應(yīng)用Caco-2細(xì)胞系和固定化腸黏液蛋白質(zhì)模型評(píng)價(jià)菌株的黏附能力涉及到細(xì)胞培養(yǎng)和動(dòng)物解剖試驗(yàn)，操作復(fù)雜且耗費(fèi)昂貴。應(yīng)用分光光度法測(cè)定細(xì)菌自凝聚能力和微生物粘著碳?xì)浠衔铮∕icrobial Adhesion To Hydrocarbons，MATH）法測(cè)定疏水性，對(duì)細(xì)菌粘附性進(jìn)行預(yù)測(cè)和初步篩選更為簡(jiǎn)單、廉價(jià)。本文中探討了戊糖片球菌表面理化特性與其腸道細(xì)胞和黏液粘附的相關(guān)性，研究結(jié)果顯示，戊糖片球菌的表面疏水性和自聚集能力存在顯著菌株差異性，其中指紋圖譜最相近的3個(gè)菌株F28-8（A5型）、Y27-4（A5型）和Y45-30（A6型）顯示了高度疏水性（＞90%）。本研究中戊糖片球菌的表面疏水率和自凝聚率（2 h）與Caco-2細(xì)胞粘附率呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），與前期報(bào)道中對(duì)Bifidobacterium longum菌株的研究結(jié)果［21］一致，表明菌株的表面疏水性和自凝聚性在Caco-2細(xì)胞粘附過(guò)程中發(fā)揮了重要作用。盡管有研究表明乳酸菌的一些菌株在體外對(duì)Caco-2細(xì)胞粘附性和腸黏液粘附能力并不一致［22］，但本研究中戊糖片球菌對(duì)Caco-2細(xì)胞和固定化腸黏液的粘附率卻呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），這可能是戊糖片球菌對(duì)這兩種基質(zhì)的粘附存在共同的作用機(jī)制和影響因素。但是表面疏水率和自凝聚率與腸黏液蛋白質(zhì)粘附率相關(guān)性不顯著（P＞0.05），可能原因是戊糖片球菌在固定化腸黏液蛋白質(zhì)作用體系中“粘附素-受體”特異性粘附起了主要作用［23］，表面疏水性和自凝聚能力引起的非特異粘附影響較小。

4　結(jié)語(yǔ)

本研究結(jié)果為建立體外篩選高粘附性戊糖片球菌菌株提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，并為進(jìn)一步體內(nèi)研究戊糖片球菌功能特性提供了候選菌株。也為開(kāi)發(fā)戊糖片球菌生態(tài)制劑提供了候選菌株，同時(shí)為深入研究戊糖片球菌在動(dòng)物體內(nèi)的定植和動(dòng)態(tài)變化提供了分子追蹤方法。對(duì)從大量菌株中篩選高粘附性菌株，縮小試驗(yàn)范圍、節(jié)約測(cè)試成本具有重要意義［9，11］。

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Screening and Molecular Marking of Highly Adhesive Pediococcus pentosaceus and the Characteristics of Their Surface Hydrophobicities and Autoaggregation Abilities

YANG Zhenquan1，2，JIN Caijuan1，ZHANG Mi1，WANG Xiaolin1，GAO Lu1，GU Ruixia1，2
（1.College of Science and Engineering，Yangzhou University，Yangzhou225127，China；2.Jiangsu Key Laboratory of Dairy Biotechnology and Safety Control，Yangzhou 225127，China）

Seven strains of Pediococcus pentosaceus were isolated and identified from the fermented stinky tofu brine using methods of conventional bacteria isolation combined with physiological and biochemical test and 16S rDNA sequencing identification.The specific fingerprint for each strain was developed by the random amplified polymorphic DNA（RAPD）technique.The adhesive ability of the strain and the correlation of phenotypic characteristics of strain adhesion and genotype，surface hydrophobicity，and aggregation ability were studied using Caco-2 cell and intestinal mucus proteinas in vitro model.Results showed that six different fingerprint patterns were found in the seven Pediococcus pentosaceus strains，among them，the A5 subtype of strains（F28-8 and Y27-4）showed the strongest adhesion to the Caco-2 cells and intestinal mucus.Furthermore，these two strains also exhibited highly hydrophobic（the hydrophobicity rate＞90%）and higher aggregation ability（the aggregation rate at 2 h＞5%）.Correlation analysis results showed that the surface hydrophobicity and aggregation ability of Pediococcus pentosaceus were positively related to the adhesive ability to the Caco-2 cell significantly（r=0.900 and 0.792，P＜0.05），but they were not significantly correlated to the adhesive ability to the intestinal mucus（r=0.426 and 0.700，P＞0.05）.The results of this study provide the basis for establishing techniques of rapid screening highly adhesive Pediococcus pentosaceus strains and their colonization and distribution in vivo.

Pediococcuspentosaceus，adhesion，surface hydrophobicity，autoaggregation ability，DNA fingerprint

TS 254

A

1673—1689（2015）09—0926—09

2014-09-30

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31371806）；江蘇省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放課題；江蘇省青藍(lán)工程資助項(xiàng)目。

楊振泉（1975—），男，江蘇南通人，農(nóng)學(xué)博士，副教授，主要從事食品微生物資源開(kāi)發(fā)與利用研究。E-mail：yangzq@yzu.edu.cn