彭 戩程 光馬 軍王南下

（1.湖北省武漢市東湖醫(yī)院，湖北 武漢 430074；2.華中科技大學附屬協(xié)和醫(yī)院，湖北 武漢430030）

丹參酮ⅡA對膿毒癥大鼠肺損傷的保護作用*

彭 戩1程 光2馬 軍2王南下2

（1.湖北省武漢市東湖醫(yī)院，湖北 武漢 430074；2.華中科技大學附屬協(xié)和醫(yī)院，湖北 武漢430030）

目的 探討丹參酮ⅡA對膿毒癥大鼠肺損傷的保護作用及其機制。方法 選取健康成年Wistar大鼠24只，隨機分為假休克對照組（Sham組）、模型組（CLP組）、丹參酮ⅡA組（TanⅡA組）3組各8只。膿毒癥組和丹參酮ⅡA組采用盲腸結(jié)扎穿孔手術(shù)（CLP）法制作大鼠膿毒癥模型，術(shù)后即刻分別腹腔注射20mg/d的丹參酮ⅡA磺酸鈉注射液和生理鹽水，對照組僅做盲腸探查術(shù)。實驗結(jié)束時，收集各組肺組織測定肺組織濕/干質(zhì)量比（W/D），肺組織勻漿中超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽（GSH）、活性氧自由基（ROS）活性和丙二醛（MDA）含量，光鏡下觀察各組肺組織形態(tài)學改變，采用Western blot檢測各組肺組織γ-GCS蛋白的表達。結(jié)果 光鏡下可見Sham組肺組織結(jié)構(gòu)基本上正常，肺泡結(jié)構(gòu)清晰；CLP組肺組織充血水腫，大量炎性細胞浸潤，肺泡間隔明顯增寬，可見部分肺泡塌陷、不張；TanⅡA組肺組織間質(zhì)稍增厚，少量炎性細胞浸潤，肺組織的炎性病理改變較CLP組顯著減輕。CLP組、TanⅡA組的肺組織W/D均較Sham組增高，但TanⅡA組的肺組織W/D與CLP組相比較有明顯下降（P＜0.05）。CLP組、TanⅡA組的肺組織SOD和GSH活性較Sham組顯著降低，但TanⅡA組與CLP組的肺組織SOD和GSH活性比較有明顯增高（P＜0.05）。CLP組、TanⅡA組的肺組織MDA含量和ROS活性較Sham組明顯增高，但TanⅡA組的肺組織MDA含量和ROS活性較CLP組低（P＜0.05）。Western blot結(jié)果示，CLP組、TanⅡA組肺組織γ-GCS蛋白表達低于Sham組（P＜0.05），而TanⅡA組γ-GCS蛋白較CLP組則明顯增加（P＜0.05）。結(jié)論 丹參酮ⅡA可促進γ-GCS蛋白表達，增加GSH的生成，抑制炎性反應(yīng)，抑制細胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化，清除氧自由基，從而減輕膿毒癥大鼠的肺損傷。

膿毒癥 肺損傷 丹參酮ⅡA

膿毒癥是由感染因素誘發(fā)的全身炎癥反應(yīng)，是臨床常見的危重癥之一，如不及時救治，常危及生命，肺常是其首先侵害的器官，其可能與膿毒癥的全身性炎癥反應(yīng)導(dǎo)致的氧化/抗氧化失衡有一定的關(guān)系［1］。谷胱甘肽（GSH）具有抗氧化作用，是體內(nèi)的重要抗氧化物之一，在抗氧化、清除氧自由基方面有重要作用。作為GSH合成限速酶的γ-谷氨酰半胱氨酸合酶（γ-GCS）是調(diào)控GSH生成的速度和量的關(guān)鍵蛋白［2］。丹參酮ⅡA為丹參的有效成分，具有抗氧化、清除氧自由基的作用，但在膿毒癥肺損傷的臨床應(yīng)用卻較少報道。近年來，有研究報道丹參具有抗內(nèi)毒素所致急性肺損傷的作用［3］，但具體機制并不清楚。本實驗通過建立膿毒癥大鼠模型，觀察丹參酮Ⅱ是否能通過調(diào)控γ-GCS的表達抗氧化、清除氧自由基達到對膿毒癥肺損傷的保護的作用，為臨床提供實驗依據(jù)?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 動物與試藥 24只健康成年Wistar雄性大鼠，體質(zhì)量200～250 g，雌雄不限，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，合格證號0056837；丹參酮ⅡA磺酸鈉注射液（諾新康2mL∶10mg，上海第一生化藥業(yè)有限公司，國藥準字H31022558），兔抗大鼠β-actin、γ-GCS單克隆抗體均購買于美國Santa Cruz公司；超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）和GCS試劑盒（南京建成生物有限公司）；其余試劑為國產(chǎn)分析純（武漢康盛醫(yī)藥科技有限公司）。

1.2 分組與造模、給藥 24只Wistar大鼠隨機分為3組：對照組（Sham組）、膿毒癥組（CLP組）和丹參酮ⅡA組（TanⅡA組），每組8只。其中CLP組和TanⅡA組大鼠采用盲腸結(jié)扎穿孔手術(shù)（CLP）法制作大鼠膿毒癥模型，術(shù)前禁食12 h。10%水合氯醛0.4mL/100 g腹腔注射麻醉成功后仰臥位固定，常規(guī)消毒腹部皮膚，于中下腹正中線縱行切開，打開腹腔，充分暴露盲腸，于距盲腸末端1 cm處采用3號縫合線環(huán)形結(jié)扎，保證腸道通暢，并據(jù)結(jié)扎處5mm位置采用9號針頭貫穿盲腸2次，并輕擠壓確保糞便溢出，以進行后續(xù)的關(guān)閉腹腔手術(shù)。術(shù)后即刻TanⅡA組和CLP組分別腹腔注射20mg/d的丹參酮ⅡA磺酸鈉注射液和生理鹽水，對照組僅做盲腸探查術(shù)。術(shù)后各組所有藥物均處理連續(xù)48h，所有大鼠均提供相同環(huán)境和飲食，均禁食、自由飲水。

1.3 標本采集與檢測 術(shù)后48 h處死大鼠，迅速剖胸取肺組織置深低溫凍存管于液氮中保存以備用。1）肺組織濕/干質(zhì)量（W/D）比值測定：處死大鼠后，剖胸取右肺上葉組織，用濾紙吸干肺表面水分，精確稱質(zhì)量后放入烤箱內(nèi)72 h（60℃），測定W/D比值。2）肺組織病理學觀察：取左肺上葉，10%甲醛浸泡固定，常規(guī)石蠟包埋切片，HE染色，分別在光學顯微鏡觀察肺組織形態(tài)學改變。3）肺組織SOD、MDA、GCS、活性氧自由基（ROS）的測定：取左下肺組織，制成10%肺組織勻漿。Bradford方法測定蛋白濃度，采用發(fā)光法測定SOD，采用比色法測定MDA、ROS、和GCS，按試劑盒說明書操作。4）肺組織γ-GCS的表達：取大鼠右肺下葉肺組織約500mg，提取各組總蛋白，Western blot檢測各組γ-GCS的表達。以β-actin為內(nèi)參，目的蛋白與相應(yīng)的β-actin吸光度值的比值作為蛋白的相對表達強度。

1.4 統(tǒng)計學處理 采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件。計量資料以（±s）表示，數(shù)據(jù)采用單因素方差分析，組間比較采用t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組肺組織形態(tài)學改變 見圖1。光鏡下可見Sham組肺組織結(jié)構(gòu)基本上正常，肺泡結(jié)構(gòu)清晰，肺泡腔及支氣管腔未見炎細胞及滲出物，可見少許紅細胞；CLP組肺組織充血水腫，大量炎性細胞浸潤，肺泡間隔明顯增寬，可見部分肺泡塌陷、不張；TanⅡA組肺組織間質(zhì)稍增厚，少量炎性細胞浸潤，肺組織的炎性病理改變較CLP組顯著減輕。

圖1 各組肺組織病理學變化（HE染色，200倍）

2.2 各組肺組織GSH、ROS、W/D、SOD及MDA值的比較 見表1。CLP組、TanⅡA組的肺組織GSH活性較Sham組顯著降低 （P＜0.05），但TanⅡA組與CLP組的肺組織GSH活性比較卻有明顯增高 （P＜0.05）。CLP組、TanⅡA組的肺組織ROS活性較Sham組明顯增高 （P＜0.05），但TanⅡA組的肺組織ROS活性較CLP組低 （P＜0.05）。CLP組、TanⅡA組的W/D均較Sham組增高 （P＜0.05），但TanⅡA組的W/D與CLP組相比較明顯下降（P＜0.05）。CLP組、TanⅡA組的肺組織SOD活性較Sham組顯著降低（P＜0.05），但TanⅡA組與CLP組的肺組織SOD活性比較卻有明顯增高（P＜0.05）。CLP組、TanⅡA組的肺組織MDA含量較Sham組明顯增高（P＜0.05），但TanⅡA組的肺組織MDA含量較CLP組低（P＜0.05）。

表1 各組肺組織GSH、ROS、W/D、SOD及MDA值比較（±s）

表1 各組肺組織GSH、ROS、W/D、SOD及MDA值比較（±s）

與Sham組比較，*P＜0.05；與CLP組比較，△P＜0.05。下同。

組 別 n GSH（mg/mg） W/D SOD（U/mg）MDA（nmol/mg）ROS（U/mg）Sham組 821.35±3.41 4.55±0.20 200.05±10.050.83±0.05 7.54±1.26 CLP組 89.45±5.21* 5.92±0.31*153.40±9.07*2.22±0.14* 22.34±3.05*TanⅡA組 815.71±4.35*△ 5.06±0.22*△180.22±6.28*△1.34±0.20*△ 15.01±2.25*△

2.3 各組肺組織γ-GCS蛋白的表達 見表2，圖2。Western blot結(jié)果及圖像分析結(jié)果示，CLP組、TanⅡA組肺組織γ-GCS蛋白表達低于Sham組（P＜0.05），而TanⅡA組 γ-GCS蛋白較CLP組則明顯增加 （P＜0.05）。

表2 各組肺組織γ-GCS蛋白表達比較（±s）

表2 各組肺組織γ-GCS蛋白表達比較（±s）

組別 n γ-GCS蛋白Sham組 8 CLP組 8 0.612±0.010 0.016±0.004*TanⅡA組 80.325±0.009*△

圖2 Western blot檢測各組肺組織γ-GCS蛋白的表達

3 討 論

膿毒癥是由感染因素誘發(fā)的全身炎癥反應(yīng)，是一種臨床常見危急綜合征［1］，早期死亡主要原因是由于發(fā)生難以控制的全身炎癥反應(yīng)，最終導(dǎo)致全身多臟器功能衰竭，肺常是首先受累的臟器之一。目前普遍認為膿毒癥出現(xiàn)的炎性細胞因子導(dǎo)致的氧化/抗氧化失衡是ALI發(fā)生的重要原因之一。丹參酮ⅡA作為傳統(tǒng)中藥丹參的有效成分具有抗炎、抗氧化的作用，目前已廣泛應(yīng)用于臨床膿毒癥器官保護的綜合治療，并且取得了較好的療效［3-6］，但其對膿毒癥肺損傷的研究較少。

本研究結(jié)果示，CLP組的肺組織充血水腫，大量炎性細胞浸潤，肺泡間隔明顯增寬，可見部分肺泡塌陷、不張，而且肺組織的W/D較Sham組高。TanⅡA組肺組織間質(zhì)稍增厚，少量炎性細胞浸潤，肺組織的炎性病理改變較CLP組顯著減輕，W/D與CLP組相比較有明顯下降，提示TanⅡA確能改善膿毒癥肺損傷。

研究表明在膿毒癥過程中，過度炎癥反應(yīng)和炎癥損傷導(dǎo)致肺組織的氧化/抗氧化失衡是ALI發(fā)生和進展的關(guān)鍵因素［1，7-8］。MDA含量可以反映脂質(zhì)過氧化的程度，SOD可以保護細胞不受毒性氧自由基的損傷。CLP組的肺組織MDA含量較Sham組高，但SOD活性較Sham組明顯降低，說明膿毒癥引發(fā)的氧化應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致了急性肺損傷。TanⅡA組與CLP組的肺組織SOD活性比較卻有明顯增高，MDA含量較CLP組低，說明TanⅡA能通過降低膿毒癥的氧化應(yīng)激反應(yīng)達到改善肺損傷的目的。

GSH是體內(nèi)重要的抗氧化成分之一，在抵御肺的氧化損傷與炎癥等方面有顯著效果。γ-GCS是GSH合成的限速酶，γ-GCS的高表達可促進GSH合成的增加，從而達到清除ROS，參與ALI的抗氧化的作用［9-11］。本研究結(jié)果示，CLP組的肺組織γ-GCS蛋白表達及GSH活性較Sham組降低，ROS活性較Sham組明顯增高。TanⅡA處理后，與CLP組的肺組織γ-GCS蛋白表達及GSH活性比較有明顯增高，肺組織ROS活性顯著降低，提示TanⅡA能通過提高GSH活性達到清除氧自由基，發(fā)揮抗氧化的作用，而GSH活性的增高可能是通過提高γ-GCS蛋白表達實現(xiàn)。

綜上所述，TanⅡA干預(yù)能夠通過提高ALI時γ-GCS蛋白的表達，從而增加GSH的合成，清除氧自由基，抑制細胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化，減輕膿毒癥所致的肺組織損傷的程度，起到有效保護作用。

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Protective Effects of Tanshinone Ⅱ A on Acute Lung Injury in Rats with Sepsis

PENG Jian1，CHENG Guang2，MA Jun2，et al. 1 Wuhan Donghu Hospital，Hubei Provicne，Hubei，Wuhan 430074，China；2 Union Hospital Affliliated to Huazhong University of Science and Technology，Hubei，Wuhan 430030，China

Objective：To study the lung protective effects and mechanism of Tanshinone Ⅱ A on acute lung injury in rats with sepsis.Methods：24 healthy adult wistar rats were randomly divided into 3 groups including sham control group，cecal ligation and puncture operation group（CLP）and Tanshinone Ⅱ A group.Lung tissues were collected at the end of the experiment.Lung tissue wet/dry quality ratio（W/D），the super oxide dismutase（SOD）activity，reactive oxygen species activity（ROS），Glutathione（GSH）activity and malondialdehyde（MDA）content of lung tissue homogenates were determined.Morphological changes of lung tissues were observed under optical microscope，the relative expressions ofγ-GCS protein in lung tissues were detected by western blot.Results：Sham group showed the normal structure of lung tissues and the clear structure of the alveolar under the optical microscope；CLP group showed hyperemia and edema of lung tissues，a large number of inflammatory cells infiltration，broadening alveolar interval，collapse and atelectasis of the alveolar；Tanshinone Ⅱ A group showed that the interstitial lung tissues were slightly thickened，a small amount of inflammatory cells were infiltrated，the inflammatory pathological changes of lung tissues were significantly reduced compared with CLP group.The W/D of lung tissues in CLP group and Tanshinone Ⅱ A group were higher than Sham group，but those of lung tissues in Tanshinone II A group was significantly lower compared with CLP group（P＜0.05）.The activity of SOD and GSH of lung tissues in CLP group and Tanshinone Ⅱ A group significantly decreased compared with Sham group，but those of lung tissues in Tanshinone Ⅱ A group was significantly higher compared with CLP group（P＜0.05）.The MDA content and ROS activity of lung tissues in CLP group and Tanshinone Ⅱ A group significantly increasedcompared with Sham group，but those of lung tissue in Tanshinone Ⅱ A group was lower than CLP group（P＜0.05）.Western blot results showed that，compared with Sham group，the relative expressions of γ-GCS protein in CLP group were relatively decreased.Those of Tanshinone Ⅱ A group were significantly increased compared with CLP group（P＜0.05）.Conclusion：Tanshinone Ⅱ A could promote the protein expressions of γ-GCS，increase the production of GSH，inhibit inflammatory reaction，inhibit lipid peroxidation，remove of oxygen free radicals，and thus reduce acute lung injury that induced by Sepsis.

Sepsis；Acute lung injury；Tanshinone Ⅱ A

R285.5

A

1004-745X（2015）05-0766-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2015.05.005

2015-02-10）

國家自然科學基金（30500657）；湖北省自然科學基金（2011CDB196）