余曉紅，鄭穎娟，呂宏迪，楊 旸，楊廷桐

肝纖維化是由多種原因引起肝小葉結(jié)構(gòu)破壞和細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrixc，ECM）過(guò)度沉積的結(jié)果，尋求防治肝纖維化已經(jīng)成為當(dāng)前醫(yī)學(xué)界的重中之重。因此深入研究探討誘導(dǎo)ECM沉積的原因，阻斷這個(gè)過(guò)程，可能成為臨床上預(yù)防肝硬化重要的環(huán)節(jié)。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子 β1（transforming growth factor－β，TGF－β1）／Smad7 通路具有刺激成纖維細(xì)胞增生，促進(jìn)組織器官纖維化形成等作用，但其在肝纖維化發(fā)生中的機(jī)制尚不清楚，國(guó)內(nèi)外尚少見(jiàn)研究報(bào)道，因此深入研究TGF－β1／smad7信號(hào)傳導(dǎo)通路在肝纖維化中激活與作用，對(duì)于闡明肝纖維化發(fā)病機(jī)制意義重大。并可對(duì)臨床上防治肝的纖維化提供新的思路。

1 材料與方法

1．1 材料

1．1．1 藥品及試劑 CCl4（天津市北宏試劑廠），TGF－β1、Smad3、Smad7 （北京中生物技術(shù)有限公司），RT－PCR試劑盒及相關(guān)試劑 （北京賽百盛公司）。

1．1．2 動(dòng)物 健康清潔級(jí) Wistar大鼠 （scxk豫2007－0001）40 只，雌雄各半，體質(zhì)量（180±20） g，購(gòu)自河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1．2 方法

1．2．1 肝臟纖維化模型建立 將Wistar大鼠40只隨機(jī)均分為兩組。對(duì)照組20只，給予腹腔注射0．9%氯化鈉注射液，模型組20只，給予腹腔注射10%的CCl4，每周2次，連續(xù)8周。8周后用10%水合氯醛 0．3ml／kg 麻醉處死，經(jīng)門(mén)靜脈采血 2ml，1500 r／min離心5min，取上清備用。取肝臟組織，一部分肝組織固定于10%甲醛中，另一部分肝組織儲(chǔ)存于液氮備用。

1．2．2 檢測(cè)項(xiàng)目 血清 TGF－B1、ALT（丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶）和HA檢測(cè)：采用Olympas7100全自動(dòng)生化儀酶法和放射免疫法檢測(cè)。

1．2．3 肝組織病理學(xué)觀察 取肝組織經(jīng)脫水，浸蠟，石蠟包埋，常規(guī)制片，4μm切片，HE染色在Olympus BX51光學(xué)顯微鏡下觀察。炎性反應(yīng)分級(jí)及纖維化分期參見(jiàn)文獻(xiàn)［1］。

1．2．4 Western blot分析 取適量模型組與對(duì)照組肝組織，提取總蛋白，用Bradford法測(cè)定蛋白含量。取50μg總蛋白變性5min后進(jìn)行 SDS－PAGE電泳，分離后的蛋白10 V恒壓35min轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜（NC膜）。5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，用含0．05%Tween－20 的 Tris緩沖液（TBST）洗滌 NC 膜 3次，加入 1∶100 稀釋的 TGF－β1，Smad3，Smad7 特異抗體，4℃過(guò)夜，TBST洗膜后加入辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)志的二抗（1∶1 000 稀釋），室溫 2 h，洗膜后加入化學(xué)發(fā)光 （electrochem－iluminescence，ECL）試劑顯色曝光。以β－actin為上樣量的內(nèi)參照，用相對(duì)吸光度值（目的基因條帶吸光度值／β－actin條帶吸光度值）表示 TGF－β1，Smad3，Smad7 蛋白的相對(duì)表達(dá)強(qiáng)度。應(yīng)用 Olympus BX51光學(xué)顯微鏡觀察，攝影。采用北京航空航天大學(xué)病理圖像分析系統(tǒng)分析結(jié)果，每個(gè)樣本取3張切片，每張切片取5個(gè)視野進(jìn)行光密度值分析。

1．2．5 肝組織 TGF－β1、Smad3 和 Smad7 表達(dá)的檢測(cè) 用RT－PCR法，采用Trizol試劑一步法提取肝組織總RNA，合成cDNA，PCR擴(kuò)增。PCR引物設(shè)計(jì)如下：

TGF－β1 5＇－ACCTGCAAGACCATCCACATG－3＇5＇－GGTTTTCTCATAGATGGCATT－3＇ 258 bp Smad3 5＇－TGATCACATTTCGATATTCATC－3＇5＇－TCAGCTTCTCTGATCCTGTGTAC－3＇ 306 bp Smad7 5＇－CCATTCCTCGGAATCGATAGACG－3＇5＇－TCATTCCTCGGAATCGATAGACG－3＇ 469 bp β－actin 5＇－AAGCCCATCACCATCTTCCACGA－3＇5＇－CCTTCCCTCACCAGTTTACTTG－3＇ 124 bp

反應(yīng)條件如下：反應(yīng)條件為94℃ 5min；94℃30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，30 個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10min。擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，紫外透射儀觀察，應(yīng)用法國(guó)VL公司BIO－PROFIF凝膠圖像分析系統(tǒng)Bio－1D分析軟件對(duì)目的電泳條帶進(jìn)行分析，以目的基因條帶與內(nèi)參照β－actin條帶吸光度值之比表示表達(dá)量。

1．3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所有數(shù)據(jù)以均使用 SPSS 17．0統(tǒng)計(jì)軟件處理。

2 結(jié) 果

2．1 兩組血清ALT、HA和 TGF－β1表達(dá)水平 模型組血清 ALT （178．46±24．37）U／L，HA （693．38±206．36） μg／L ，TGF－β1（73．95±28．38） U／L，分別明顯 高于對(duì) 照組的 （42．81±8．38）U／L，（59．36±28．13） μg／L，（20．69±17．86） U／L（P＜0．01）。

2．2 兩組肝組織病理觀察 對(duì)照組大鼠肝小葉中央靜脈、肝肝索、肝竇結(jié)構(gòu)正常，無(wú)肝細(xì)胞壞死及纖維組織增生；模型組小鼠肝組織小葉內(nèi)可見(jiàn)點(diǎn)狀或灶狀肝細(xì)胞壞死伴炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，匯管區(qū)可見(jiàn)纖維組織增生，并向肝小葉內(nèi)穿插，形成纖維間隔。見(jiàn)圖1。

圖 1 對(duì)照組與模型組肝組織病理觀察（HE×10）

2．3 Western blot結(jié)果 TGF－β1、Smad3 和 Smad7蛋白在模型組與對(duì)照組中的表達(dá)是 TGF－β1，Smad3，模型組光密度值明顯高于對(duì)照組（P＜0．01），Smad7模型組光密度值明顯低于對(duì)照組 （P＜0．01）。見(jiàn)圖 2，表 1。

圖 2 Western blot分析結(jié)果

2．4 兩組肝組織中 TGF－β1、Smad3、Smad7 的表達(dá)在模型組肝組織TGF－β1、Smad3 mRNA表達(dá)明顯高于對(duì)照組（P＜0．01）；而對(duì)照組中 Smad7 mRNA表達(dá)明顯高于模型組（P＜0．01），見(jiàn)圖 3，表 1。

圖 3 RT－PCR 檢測(cè) TGFβ1，Smad3，Smad7 mRNA在模型組和對(duì)照組肝組織中的表達(dá)

表 1 兩組肝組織中蛋白與基因 TGF－β1、Smad3、Smad7（x±s）

3 討 論

轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子1（transforming growth factorbeta1，TGF－β1）是一種具有多向生物學(xué)效應(yīng)的多肽類細(xì)胞調(diào)節(jié)因子［2］，其主要通過(guò) TGF／Smad 信號(hào)通路發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)，對(duì)其作用機(jī)制的深入闡述有非常重要的意義［3］。Smad 蛋白是 TGF－β1 跨細(xì)胞膜傳入的重要蛋白，TGF－β1與細(xì)胞膜上的 TGF－βRII結(jié)合后，活化 TGF－βRI，使 Smad2或 Smad3 C 末端磷酸化，并與Smad4形成異聚體轉(zhuǎn)錄復(fù)合物，移位至細(xì)胞核與序列特異的DNA結(jié)合，誘導(dǎo)基因轉(zhuǎn)錄，誘導(dǎo)使肝臟纖維化產(chǎn)生和發(fā)生發(fā)展。Smad7基因是TGF－β1信號(hào)傳導(dǎo)通路的抑制元件，通過(guò)與活化的TGF－βI型受體結(jié)合，一方面抑制Smad2、Smad3的磷酸化，另方面抑制Smad2、Smad3與受體結(jié)合，在TGFβ信號(hào)傳導(dǎo)中構(gòu)成負(fù)反饋環(huán)路，發(fā)揮抗纖維化作用。TGF－β1是激活HSC的主要細(xì)胞因子之一，是最強(qiáng)的肝纖維化促進(jìn)劑［4］，本研究顯示在肝臟纖維化的肝組織中Smad7的表達(dá)明顯減少，在對(duì)照組中呈現(xiàn)高表達(dá)。而TGF－β1、Smad3蛋白在對(duì)照組正常肝組織中低表達(dá)，在肝臟纖維化中呈現(xiàn)高表達(dá)。并且蛋白和基因的表達(dá)呈現(xiàn)一致性。證明了肝纖維化發(fā)生時(shí)TGF－β1／Smads通路的信號(hào)分子存在過(guò)度活化。同時(shí)Smad7的功能明顯的減弱。說(shuō)明這種基因的明顯變化證明是肝臟纖維化發(fā)生的重要基礎(chǔ)。

慢性乙肝是肝硬化和肝細(xì)胞癌的高危因數(shù)，亞洲地區(qū)目前屬其感染的高流行區(qū)［5，6］。肝纖維化是慢性肝病發(fā)展為肝硬化的病理必經(jīng)過(guò)程，目前的研究認(rèn)為肝纖維化是可逆的，而肝硬化是不可逆的。因此肝纖維化的早期診斷和及時(shí)干預(yù)對(duì)疾病的進(jìn)展及預(yù)后的改善非常重要［7］。研究肝纖維化發(fā)展過(guò)程中各階段的病理變化，解釋其發(fā)生的機(jī)制，是進(jìn)一步治療和預(yù)防肝硬化的重要措施。本研究顯示細(xì)胞的外基質(zhì)沉積是導(dǎo)致肝纖維化發(fā)生的重要條件，而TGF－β1高表達(dá)在促進(jìn)肝纖維化發(fā)生中起重要作用。因此在細(xì)胞外基質(zhì)降解下降的纖維化中發(fā)生的TGF－β1 是最為重要的細(xì)胞因子［8］。

肝臟疾病在臨床上采用肝活檢病理診斷是診斷肝臟纖維化的客觀標(biāo)準(zhǔn)，但血清學(xué)診斷的指標(biāo)是目前臨床常用的判斷和分析是否有HBV感染及患者病程的重要指標(biāo)之一［9］，也成為目前研究肝臟疾病的焦點(diǎn)，研究認(rèn)為，在肝纖維化發(fā)生過(guò)程中具有重要價(jià)值的指標(biāo)有：HA、ALT、TGF等。大鼠血清ALT、HA、TGF－β1表達(dá)水平模型組與對(duì)照組相比具有顯著性差異，并且其表達(dá)量隨肝臟纖維化演進(jìn)程度呈一致性。ALT、HA、TGF－β1三者在血清中的表達(dá)可以作為判斷肝臟纖維化程度的生物學(xué)指標(biāo)。

本研究顯示，在肝纖維化形成和演進(jìn)過(guò)程中，肝組織 TGF－β1、Smad3表達(dá)明顯增強(qiáng)，血清中ALT、HA、TGF－β1表達(dá)水平明顯升高，而肝臟組織中的Smad7表達(dá)顯著減低，TGFβ1／smad信號(hào)傳導(dǎo)通路功能明顯增強(qiáng)，這些改變對(duì)肝纖維化發(fā)生及發(fā)展都起到了十分顯著的重要作用，為臨床上防治肝臟纖維化和肝硬化提供了新的思路。但是TGFβ1／smad信號(hào)傳導(dǎo)通路中的調(diào)控機(jī)制，尚需要進(jìn)一步深入研究。

［1］中華醫(yī)學(xué)會(huì)傳染病與寄生蟲(chóng)病學(xué)分會(huì)，肝病學(xué)分會(huì)．病毒性肝炎防治方案［J］．中華肝臟病雜志，2004，8（6）：329－330．

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