姜　　寧，劉曉鵬，，*，張俊霞，江亞東，丁振國，李　　力

（1.湖北民族學院生科院，湖北恩施445000；2.南京醫(yī)藥股份股份有限公司，博士后工作站，江蘇南京210012；3.南京同仁堂洪澤中藥材科技有限公司，江蘇洪澤223200）

Box-Behnken設計-效應面法優(yōu)化連錢草多糖提取工藝

姜寧1，劉曉鵬1，2，*，張俊霞1，江亞東3，丁振國3，李力2

（1.湖北民族學院生科院，湖北恩施445000；2.南京醫(yī)藥股份股份有限公司，博士后工作站，江蘇南京210012；3.南京同仁堂洪澤中藥材科技有限公司，江蘇洪澤223200）

對連錢草多糖進行提取，并通過單因素及響應面實驗對提取的四個因素：pH、液固比、提取溫度和提取時間進行了優(yōu)化。結果表明：當提取工藝為pH7.2、液固比33∶1（mL/g）、提取溫度89℃、提取時間160min時，多糖提取率最高，可達3.40%±0.05%，與理論值3.39%接近。此研究為連錢草多糖的進一步開發(fā)和利用提供了理論依據(jù)。

連錢草，Box-Behnken設計，效應面法，多糖，提取

連錢草為唇形科活血丹屬植物活血丹［Glechoma longituba（Nakai）Kupr.］干燥地上部分，曬干；或鮮用。連錢草性味涼辛，微苦，微寒。歸肝、腎、膀胱經［1］，具有降血糖［2］、利尿利膽［3］、抑菌［4］等功效。臨床上主要用于利小便，治療膀胱結石、腎結石、輸尿管結石、腎炎水腫、濕熱黃疸、膽囊炎、膽石癥、腮腺炎、燒傷等［5］。我國連錢草資源豐富，除西北、內蒙古外，各地均有栽培。

研究表明植物多糖尤其是藥用植物多糖具有抗氧化［6］、免疫調節(jié)［7］、抗腫瘤［8］、抗炎［9］等功能，但目前對連錢草化學成分的研究主要集中在有機酸［10］、生物堿［11］、苷［12］、黃酮［13］、揮發(fā)油［14］等方面，尚無連錢草多糖研究的報道。本研究采用響應面分析優(yōu)化了熱水浴提取連錢草多糖的工藝，以期為連錢草這一傳統(tǒng)中藥的進一步開發(fā)利用奠定基礎。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

連錢草南京同仁堂洪澤中藥材科技有限公司提供，經劉曉鵬副教授鑒定為唇形科活血丹屬植物活血丹［Glechoma longituba（Nakai）Kupr.］；葡萄糖、無水乙醇、蒽酮、硫酸分析純，購自國藥集團化學試劑有限公司。

TU-1810型紫外可見分光光度計北京普析通用儀器有限責任公司；RT-02A型多功能粉碎機弘荃機械企業(yè)有限公司；BECKMAN COUCTER型離心機美國BECKMAN公司；HHS型恒溫水浴鍋上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠。

1.2實驗方法

1.2.1連錢草多糖的提取將連錢草60℃烘干、粉碎，過60目篩。稱取一定量的連錢草粉末，加適量的一定pH的緩沖液，水浴提取。將浸提液離心（8000r/min，20min），將無水乙醇緩緩加入上清液中，邊加邊攪拌，使乙醇終濃度為80%。將醇沉液離心（8000r/min，20min），將入蒸餾水溶解沉淀。按多糖溶液∶三氯甲烷∶正丁醇三者體積比25∶5∶1混合，振蕩20min，離心（8000r/min，20min）。蒽酮-濃硫酸法［15］測上清液中的多糖，按下列公式計算提取率：

式中：c為測定樣液的質量濃度（mg/mL）；V為提取體積（mL）；m為連錢草質量（mg）。

1.2.2單因素實驗

1.2.2.1pH對連錢草多糖提取的影響稱取一定量的連錢草粉末，在液固比30∶1（mL/g）、水浴溫度90℃和提取時間120min下，分別以pH6.0、6.5、7.0、7.5、8.0緩沖液提取多糖，考察不同pH對連錢草多糖提取的影響。實驗重復三次。

1.2.2.2液固比對連錢草多糖提取的影響稱取一定量的連錢草粉末，加入pH7.0的緩沖液，90℃水浴，提取120min，分別按液固比10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1（mL/g），考察不同液固比對連錢草多糖提取的影響。實驗重復三次。

1.2.2.3提取溫度對連錢草多糖提取的影響稱取一定量的連錢草粉末，按液固比30∶1（mL/g）加入pH7.0的緩沖液，分別置于60、70、80、90、98℃水浴，提取時間均為120min，考察不同溫度下連錢草多糖提取率的變化。實驗重復三次。

1.2.2.4提取時間對連錢草多糖提取的影響稱取一定量的連錢草粉末，于pH7.0、液固比30∶1（mL/g），提取溫度90℃條件下分別提取60、90、120、150、180min，計算多糖提取率，以考察不同提取時間對連錢草多糖提取的影響。實驗重復三次。

1.2.3Box-Behnken實驗根據(jù)單因素實驗結果，采用Design-Expert 8.0軟件進行Box-Behnken實驗設計，以pH、液固比、提取溫度和提取時間為自變量，多糖提取率為響應值優(yōu)化連錢草多糖的提取工藝。實驗因素水平設計見表1。

表1　因素水平表Table 1　Levels and factors table

1.2.4數(shù)據(jù)分析單因素實驗數(shù)據(jù)用Origin 8.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析，數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標準誤（SE）表示，組間差異比較采用Tukey實驗。Box-Behnken實驗設計和結果分析采用Design-Expert 8.0軟件。

2　結果與分析

2.1單因素實驗結果

2.1.1pH對連錢草多糖提取的影響不同pH對連錢草多糖提取的影響如圖1所示。由圖1可以得知：當提取液的pH為7.0時，連錢草多糖的提取率最高，并與其他pH條件時的提取率差異極顯著（p＜0.01）。說明連錢草多糖在pH7.0時，溶解性及穩(wěn)定性最好，過酸過堿的提取條件可能會降低連錢草多糖的溶解性能或增加其水解。

圖1　pH對多糖提取率的影響Fig.1　Effect of pH on polysaccharides yield

2.1.2液固比對連錢草多糖提取的影響不同液固比會顯著影響連錢草多糖的提取率（圖2）。隨著液固比的增加，提取率隨之增加，當液固比達到30∶1（mL/g）時，提取率的增加不再顯著（p＞0.05），當液固比為50∶1（mL/g）時，多糖的提取率反而有所下降。這是因為隨著液固比增加，多糖的溶出會增加，但過大的液固比會使后續(xù)操作體積過大從而增加損耗，反而使提取率下降。

圖2　液固比對多糖提取率的影響Fig.2　Effect of liquid-solid ratio on polysaccharides yield

2.1.3提取溫度對連錢草多糖提取的影響如圖3所示，提取溫度對連錢草多糖提取有著顯著影響。提取溫度為98℃時提取率最高，但與90℃水浴提取相比，差異不顯著（p＞0.05）。這可能是因為提高溫度會使植物細胞內的多糖溶出增加，但過高的溫度會增加多糖的降解。

2.1.4提取時間對連錢草多糖提取的影響如圖4所示，隨著提取時間的延長，連錢草多糖的提取率也顯著增加，但當提取時間達到150min后，提取率的增加不再顯著。這是因為隨著加熱時間的延長，連錢草多糖溶出增加，細胞內外的多糖濃度梯度降低，最終達到平衡，溶出的多糖不再顯著增加。

圖3　提取溫度對多糖提取率的影響Fig.3　Effect of extraction temperature on polysaccharides yield

圖4　提取時間對多糖提取率的影響Fig.4　Effect of extraction time on polysaccharides yield

表2　Box-Behnken實驗結果Table 2　Results of Box-Behnken experiment

表3　Box-Behnken實驗結果方差分析表Table 3　ANOVA of Box-Behnken experiment results

2.2Box-Behnken實驗結果

2.2.1回歸模型的建立和檢驗表2為Box-Behnken實驗的結果。采用Design-Expert 8.0統(tǒng)計軟件對實驗結果進行分析，建立了四元二次回歸方程：

R=3.32+0.13A+0.13B-0.10C+0.09D-0.01AB-0.09AC+0.14AD+0.068BC+0.15BD+0.04CD-0.28A2-0.26B2-0.30C2-0.26D2。

該模型的決定系數(shù)R2為0.9564，校正后的R2為0.9128。對實驗結果進行方差分析，結果如表3所示。從中可以得知：模型顯著p＜0.0001，失擬項不顯著，說明該模型與實際情況擬合較好。根據(jù)F值，各因素對響應值影響大小的順序為B＞A＞C＞D。除AB、BC、CD外，其余因子對提取率的影響均顯著，故可將AB、BC、CD從回歸方程中刪除，因此，最終的回歸方程為R=3.32+0.13A+0.13B-0.10C+0.09D-0.09AC+0.14AD+ 0.15BD-0.28A2-0.26B2-0.30C2-0.26D2。

2.2.2兩因素間的交互作用作用顯著的兩因素間的交互作用如圖5～圖7所示，三組圖直觀地反應了當其他兩個因素處于最佳水平時，pH與提取溫度、pH與提取時間和液固比與提取時間的交互作用對連錢草多糖提取率的影響。

圖5為液固比為33.3∶1（mL/g）、提取時間為160.2min時，提取液pH和提取溫度對多糖得率的影響。從圖5可以看出，當pH和提取溫度都處于低水平時，提取率很低，隨著二者的上升，提取率急劇上升，當pH和提取溫度分別在7.0～7.5和85～90℃范圍內時，提取率最高。

圖5　pH和提取溫度交互作用對多糖提取率的影響Fig.5　Interactive effects of pH and extraction temperature on polysaccharides yield

圖6表示的是當液固比33.3∶1（mL/g）、提取溫度89.2℃時，pH和提取時間的交互作用對多糖提取率的影響。如圖6所示，pH和提取時間的增大會顯著提高連錢草多糖的得率，當pH在7.0～7.5之間、提取時間在150～180min范圍時，多糖的得率達到最大值。

圖6　pH和提取時間交互作用對多糖提取率的影響Fig.6　Interactive effects of pH and extraction time on polysaccharides yield

當pH7.17，提取溫度89.2℃時，液固比和提取時間交互作用對多糖產量的影響如圖7所示。當液固比較小、提取時間較短時，多糖產量較低，隨著液固比的加大、提取時間的延長，多糖產量顯著增加。當液固比處于30∶1～40∶1（mL/g）、提取時間150～180min時，多糖產量最高。

2.2.3最佳工藝優(yōu)化及驗證實驗根據(jù)建立的回歸方程進行各因素的優(yōu)化，得到當A=0.34、B=0.33、C= -0.16、D=0.34時，R有極大值3.39%。即當連錢草多糖提取條件為pH7.17、液固比33.3∶1（mL/g）、提取溫度89.2℃、提取時間160.2min時，多糖得率可達3.39%。為了方便操作，提取工藝被確定為pH7.2、液固比33∶1（mL/g）、提取溫度89℃以及提取時間為160min。對優(yōu)化的工藝進行三次驗證，每次實驗重復三次，三次的多糖提取率分別為3.26%±0.05%、3.52%±0.08%、3.41%±0.038%，平均提取率為3.40%±0.05%，說明建立的回歸模型有較好的預測性，優(yōu)化的工藝對生產實踐具有很好的指導作用。

圖7　液固比和提取時間對多糖提取率的影響Fig.7　Interactive effects of liquid-solid ratio and extraction time on polysaccharides yield

3　結論

pH、液固比、提取溫度和提取時間是影響多糖提取的四個重要因素，為了研究這四個因素對連錢草多糖提取率的影響，先進行了單因素實驗，并在此基礎上進行了Box-Behnken響應面試驗。得出提取連錢草多糖的最佳工藝是pH7.2、液固比33∶1（mL/g）、提取溫度89℃、提取時間160min，并對該工藝進行了驗證，連錢草多糖的提取率可達3.40%±0.05%。

［1］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（2010版）一部［M］.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010.

［2］袁春玲，王佩琪，郭偉英．連錢草的降血糖作用及其機制研究［J］．中藥藥理與臨床，2008，24（3）：57-58．

［3］胡萬春，郭宇，喻曉潔.連錢草和金錢草利尿利膽活性篩選與比較實驗研究［J］.中華中醫(yī)藥雜志，2007（增刊）：234.

［4］陶勇，石米揚.連錢草的抑菌活性研究［J］.中國醫(yī)院藥學雜志，2011，31（10）：824-825.

［5］宋銳，張云，叢曉東，等.連錢草的化學成分及生物活性研究進展［J］.中華中醫(yī)藥學刊，2010，28（12）：2511-2514.

［6］賈琳斐，郭姣，李清宇，等.響應曲面法優(yōu)化海紅果水溶性多糖提取工藝及抗氧化活性的研究［J］.食品工業(yè)科技，2014，35（10）：252-257.

［7］Li Y，Hu Y，Shi S，et al.Evaluation of antioxidant and immunoenhancingactivitiesofPurslanepolysaccharidesingastric cancer rats［J］.International Journal of Biological Macromolecules，2014，68（1）：113-116.

［8］Shen H，Tang G，Zeng G，et al.Purification and characterization of an antitumor polysaccharide from Portulaca oleracea L.［J］. Carbohydrate Polymers，2013 93（1）：395-400.

［9］Batista J A，Dias EGN，Brito TV，et al.Polysaccharide isolated from Agardhiella ramosissima：Chemical structure and antiinflammation activity［J］.Carbohydrate Polymers，2014，99（1）：59-67.

［10］Kim JP，Song SB，Lee IS，et al.Anti-inflammatory activity of constituentsfromGlechomahederaceavar.longituba［J］. Bioorganic&Medicinal Chemistry Letters，2011，21（11）：3483-3487.

［11］Kumarasamy Y，Cox PJ，Jaspars M，et al.Isolation，structureelucidation and biological activity of hederacine A and B，two unique alkaloids from Glechoma hederaceae［J］.Tetrahedron，2003，59（34）：6403-6407.

［12］Yamauchi H，Kakuda R，Yaotta Y，et al.Two New Glycosides from the Whole Plants of Glechoma hederacea L.［J］.Chemical& Pharmceutical Bulletin，2007，55（2）：346-347.

［13］楊念云，段金廒，李萍，等.連錢草中的黃酮類化學成分［J］.中國藥科大學學報，2005，36（3）：210-212.

［14］樊鈺虎，周剛，張璐，等．連錢草揮發(fā)油化學成分的氣相色譜-質譜分析．中國實驗方劑學雜志，2010，16（13）：41-44.

［15］郭曉蕾，朱思潮，翟旭峰，等.硫酸蒽酮法與硫酸苯酚法測定靈芝多糖含量比較［J］.中華中醫(yī)藥學刊，2010，28（9）：2000-2002.

Optimization of extraction process of polysaccharides from Glechoma longituba by Box-Behnken design-response surface method

JIANG Ning1，LIU Xiao-peng1，2，*，ZHANG Jun-xia1，JIANG Ya-dong3，DING Zhen-guo3，LI Li2
（1.School of Biological Science and Technology，Hubei Institute for Nationalities，Enshi 445000，China；2.Postdoctoral Research Station，Nanjing Medical Co.，Ltd.，Nanjing，Nanjing 210012，China；3.Nanjing Tongrentang Hongze Chinese Herbal Science&Technology Co.，Ltd.，Hongze 223200，China）

Polysaccharides from Glechoma longituba were extracted in the present study，and four factors including pH，liquid-solid ratio，extraction temperature and time were optimized by univariate tests and response surface methodology.The results showed that the highest yield of polysaccharides extracted from Glechoma longituba reached 3.40%±0.05%when the process was pH7.2，liquid-solid ratio 33∶1（mL/g），temperature 89℃ and extraction time 160min.This research might provide a theoretical basis for the further development and utilization.

Glechoma longituba；Box-Behnken design；response surface method；polysaccharides；extraction

TS201.1

B

1002-0306（2015）14-0279-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.14.056

2014－09－12

姜寧（1968-），女，在讀博士，副教授，研究方向：生物工程。

劉曉鵬（1971-），男，博士，副教授，研究方向：生物工程。

國家“十二五”科技支撐計劃項目（2011BAI04B04）；江蘇省“企業(yè)博士后集聚計劃”項目（2011033）；2013年湖北省戰(zhàn)略性新興（支柱）產業(yè)人才培養(yǎng)（生物工程）項目。