馬　濤，劉利霞，趙　旭，王　勃，劉　賀，惠麗娟，何余堂

（1.渤海大學(xué)化學(xué)化工與食品安全學(xué)院，遼寧錦州121013；2.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧沈陽110866；3.遼寧省糧食科學(xué)研究所，遼寧沈陽110866）

循環(huán)逆流提取發(fā)芽糙米γ-氨基丁酸工藝條件優(yōu)化

馬濤1，劉利霞2，趙旭3，王勃1，劉賀1，惠麗娟1，何余堂1

（1.渤海大學(xué)化學(xué)化工與食品安全學(xué)院，遼寧錦州121013；2.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧沈陽110866；3.遼寧省糧食科學(xué)研究所，遼寧沈陽110866）

以水為提取溶劑，采用實(shí)驗(yàn)室模擬動態(tài)逆流提取工藝，并通過響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法對發(fā)芽糙米γ-氨基丁酸（GABA）的提取工藝條件進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明：提取溫度51℃、單級提取時間59min、液料比5.9∶1（mL/g），提取級數(shù)3級，在此條件下，發(fā)芽糙米GABA提取率可達(dá)到89.35%。

發(fā)芽糙米，γ-氨基丁酸，逆流提取，條件優(yōu)化

γ-氨基丁酸（GABA）是廣泛分布于動植物中的一種非蛋白質(zhì)氨基酸，糙米在發(fā)芽過程中谷氨酸在內(nèi)源谷氨酸脫羧酶作用下會轉(zhuǎn)化為GABA，其含量成倍增加［1］。GABA具有改善腦機(jī)能、調(diào)整血壓、促進(jìn)生長激素分泌，以及保護(hù)肝臟等功能［2］。同時，GABA作為一種天然的食品加工原料被廣泛應(yīng)用［3］，因此，發(fā)芽糙米及其生理活性物GABA受到國內(nèi)外廣泛的關(guān)注。

連續(xù)循環(huán)逆流提取技術(shù)是一種集萃取、重滲透、動態(tài)、逆流為一體的新型提取技術(shù)［4］。動態(tài)逆流提取逐漸取代了傳統(tǒng)的分批提取過程，其優(yōu)勢在于降低溶劑消耗、縮短處理時間、減少成本［5-7］；與傳統(tǒng)的提取方法相比，具有經(jīng)濟(jì)、安全等特點(diǎn)［8］。本實(shí)驗(yàn)采用實(shí)驗(yàn)室模擬工業(yè)生產(chǎn)中連續(xù)式逆流提取方法，以水為提取溶劑，并通過Box-Behnken響應(yīng)面法對發(fā)芽糙米提取GABA工藝條件進(jìn)行了優(yōu)化，為實(shí)現(xiàn)GABA提取工業(yè)化提供參考。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

糙米市購，經(jīng)發(fā)芽［9］干燥、微粉碎后備用；γ-氨基丁酸（GABA）標(biāo)品（純度＞99%） Sigma公司；次氯酸鈉分析純，有效氯為9%，天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；重蒸苯酚分析純，天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；硼酸、無水乙醇分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；谷氨酸鈉（味精）谷氨酸鈉＞99%，無鹽，北京市朝陽區(qū)中聯(lián)化工試劑廠。

HH-601A型超級恒溫水浴鍋江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠；HPX-9082ME型電熱恒溫培養(yǎng)箱、DHG-9055A型電熱鼓風(fēng)干燥箱上海一恒科學(xué)儀器有限公司；RRH-A500型高速多功能粉碎機(jī)海緣沃工貿(mào)有限公司；UV-2550型紫外可見分光光度計(jì)日本島津Shimadzu公司；SC-279GA型海爾冰柜海爾公司；AR224CN型電子天平上海奧豪斯儀器有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1循環(huán)逆流法提取發(fā)芽糙米GABA工藝

圖1　實(shí)驗(yàn)室模擬動態(tài)逆流提取GABA示意圖Fig.1　The schematic diagram of GABA extraction using laboratory simulation dynamic countercurrent method

由圖1可見，逆流法提取發(fā)芽糙米GABA工藝流程是：新鮮溶劑水從第一級進(jìn)入逆流體系，對第2級排出的渣2進(jìn)行提取，提取后的渣1排出體系；去除沉淀后的水1進(jìn)入第2級，對第3級排出的渣3進(jìn)行提?。环蛛x得到的水2進(jìn)入第3級，對第4級的渣4進(jìn)行提??；以此類推，最后水相N-1進(jìn)入N級對原料進(jìn)行提取，排出的渣N-1進(jìn)入N-1級，而去除沉淀后的水相N即為所需的發(fā)芽糙米GABA提取液［10］。

1.2.2發(fā)芽糙米的制備精選顆粒飽滿、成熟高的糙米原料，每份稱取10g，并用20mL蒸餾水清洗3遍，然后用1%的次氯酸鈉溶液浸泡5min（加入量以剛好淹沒糙米為宜），消毒之后每份用20mL清水清洗3遍，然后用20mL蒸餾水清洗3遍，于30℃水浴鍋中浸泡12h，30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)發(fā)芽28h，發(fā)芽結(jié)束后，用去離子水清洗，于55℃烘箱中終止活性、干燥5h，于4℃冰箱保存?zhèn)溆茫?］。

1.2.3GABA檢測方法

1.2.3.1GABA標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作準(zhǔn)確稱取濃度為0.1、0.25、0.5、0.75、1.0mg/mL的γ-氨基丁酸標(biāo)準(zhǔn)溶液分別取0.5mL，加入0.2mL硼酸緩沖溶液（pH9.0），1mL濃度為6g/100mL的重蒸苯酚溶液，0.4mL有效氯含量10%的次氯酸鈉溶液，充分振蕩，置于沸水浴10min，再立即冰浴20min，并不斷振蕩，待出現(xiàn)藍(lán)綠色后加入2mL體積分?jǐn)?shù)60%的乙醇溶液，再次振蕩均勻，靜置后于645nm波長處測定其吸光度，以濃度為橫坐標(biāo)x，吸光度為縱坐標(biāo)y，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3.2樣品GABA含量的檢測將干燥后的發(fā)芽糙米粉碎過60目篩，稱取10g發(fā)芽糙米粉，用水進(jìn)行逆流提取，過濾后，取濾液，即GABA粗提液。取上清液0.5mL，加入0.2mL硼酸緩沖溶液（pH9.0），1mL濃度為6g/100mL的重蒸苯酚溶液，0.4mL有效氯含量10%的次氯酸鈉溶液，充分振蕩，置于沸水浴10min，再立即冰浴20min，并不斷振蕩，待出現(xiàn)藍(lán)綠色后加入2mL體積分?jǐn)?shù)60%的乙醇溶液，再次振蕩均勻，靜置后于645nm波長處測定其吸光度［11］。

1.2.3.3GABA提取率的計(jì)算方法

GABA提取率（%）=WE/WO×100

式中：WE為原料浸出的可溶性固形物量（g）；WO為原料中可溶性固形物含量（g）。

1.2.4單因素實(shí)驗(yàn)以水為提取溶劑，準(zhǔn)確稱取10g/份發(fā)芽糙米粉，考察提取溫度、提取時間、液料比以及提取級數(shù)四個因素對發(fā)芽糙米GABA提取率的影響，每次實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

以水為提取溶劑，設(shè)定液料比為6∶1，提取級數(shù)為3級，分別在20、30、40、50、60、70℃條件下逆流提取60min，以GABA提取率為響應(yīng)值，重復(fù)3次。

以水為提取溶劑，設(shè)定液料比為6∶1，提取級數(shù)為3級，分別在50℃條件下逆流提取30、60、90、120、150min，以GABA提取率為響應(yīng)值，重復(fù)3次。

以水為提取溶劑，按液料比為4∶1、5∶1、6∶1、7∶1、8∶1、10∶1mL/g，在50℃條件下逆流提取60min，提取級數(shù)為3級，以GABA提取率為響應(yīng)值，重復(fù)3次。

以水為提取溶劑，設(shè)定液料比為6∶1，在50℃逆流提取60min，對發(fā)芽糙米GABA分別進(jìn)行了5級提取，以GABA提取率為響應(yīng)值，重復(fù)3次。

1.2.5響應(yīng)面法優(yōu)化逆流提取發(fā)芽糙米GABA工藝條件在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，利用Design-Expert（version 8.0.6）軟件以提取溫度、提取時間、液料比及提取級數(shù)為考察變量，分別以A、B、C、D表示，以γ-氨基丁酸提取率Y為響應(yīng)值，其中以+1、0、-1分別代表自變量的高、中、低水平［12］，各因素及水平編碼如表1所示。

表1　Box-Behnken實(shí)驗(yàn)因素及水平編碼Table 1　Four main induction conditions and their levels for Box-Behnken design

1.2.6數(shù)據(jù)分析運(yùn)用Design-Expert軟件（Version 8.0.6）對響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行線性回歸和方差分析，模型和因素的顯著性以F值進(jìn)行考察（p＜0.05），每次實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

2　結(jié)果與討論

2.1GABA標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)果

根據(jù)1.2.3.1方法繪制GABA標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2所示，得到的GABA標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為y=0.4154x+ 0.1020，R2=0.9987。

圖2　γ-氨基丁酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2　Standard curve of γ-aminobutyric acid

2.2單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1提取溫度對發(fā)芽糙米GABA提取率的影響由圖3可知，隨著提取溫度的升高，發(fā)芽糙米GABA提取率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，溫度升高，溶劑的傳質(zhì)動力增加，使得物質(zhì)的提取率上升，在50℃時提取率達(dá)到最大；之后隨著提取溫度的增加，發(fā)芽糙米發(fā)生糊化現(xiàn)象，而且高溫會破壞熱敏性物質(zhì)的結(jié)構(gòu)，本實(shí)驗(yàn)取50℃為最佳提取溫度。

圖3　提取溫度對發(fā)芽糙米GABA提取率的影響Fig.3　Effect of extraction temperature on extraction rate of GABA

2.2.2提取時間對發(fā)芽糙米GABA提取率的影響由圖4可知，發(fā)芽糙米GABA提取率隨著提取時間的延長先增加后降低，在60min內(nèi)提取率最大，原因是隨著提取時間的增加，溶劑粘度下降，析出的物質(zhì)含量降低。從操作費(fèi)用和能源消耗上考慮，60min為發(fā)芽糙米GABA最佳提取時間。

圖4　提取時間對發(fā)芽糙米GABA提取率的影響Fig.4　Effect of extraction time on extraction rate of GABA

2.2.3液料比對發(fā)芽糙米GABA提取率的影響從圖5可知，隨著液料比的增加，GABA的提取量在不斷的增高，這是因?yàn)樵黾右毫媳龋瑐髻|(zhì)動力增加，GABA就更容易溶出，損失減少［13］，考慮經(jīng)濟(jì)效益，本實(shí)驗(yàn)選取最佳提取液料比為6∶1。

2.2.4提取級數(shù)對發(fā)芽糙米GABA提取率的影響由圖6可知，GABA提取率在3級時達(dá)到最大值，之后提取率趨于平緩，原因是新物料的加入會大量的吸水，當(dāng)達(dá)到一定級數(shù)時，提取液中GABA含量達(dá)到飽和，提取率下降，本實(shí)驗(yàn)發(fā)芽糙米逆流提取GABA最佳提取級數(shù)確定為3級。

圖5　液料比對發(fā)芽糙米GABA提取率的影響Fig.5　Effect of liquid/material ratio on extraction rate of GABA

圖6　提取級數(shù)對發(fā)芽糙米GABA提取率的影響Fig.6　Effect of extraction numbers on extraction rate of GABA

2.3響應(yīng)面分析法優(yōu)化發(fā)芽糙米GABA提取工藝結(jié)果分析

2.3.1實(shí)驗(yàn)因素水平編碼與實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用Design-Expert軟件進(jìn)行Box-Behnken中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，依次進(jìn)行提取實(shí)驗(yàn)，以發(fā)芽糙米中GABA提取率為響應(yīng)值（Y）進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果如表2所示。

2.3.2二次多項(xiàng)式回歸模型建立及統(tǒng)計(jì)分析應(yīng)用Design-Expert 8.0軟件，對表2中的GABA提取率實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合分析，擬合后得到的關(guān)于提取溫度（A）、單級提取時間（B）、液料比（C）及提取級數(shù)（D）二次多項(xiàng)回歸方程為：

Y=88.24+3.44A+1.62B-2.47C-3.66D-2.57AB+ 3.69AC+2.28AD-5.16BC+7.12BD-1.51CD-9.13A2-11.21B2-8.35C2-5.40D2

方程中各項(xiàng)系數(shù)絕對值大小直接反映各因素對響應(yīng)值的影響程度，系數(shù)的正、負(fù)反映影響的方向。由表3回歸方程的顯著性檢驗(yàn)中可知，p值說明影響提取發(fā)芽糙米GABA的提取溫度、單級提取時間、液料比及提取級數(shù)各因素存在顯著性影響。因素提取溫度、料液比、提取級數(shù)的影響極顯著（p＜0.01）；交互項(xiàng)AB、AD影響顯著（p＜0.05），且交互項(xiàng)AC、BC、BD影響極顯著（p＜0.01）。綜合上述分析得知，各個因素對響應(yīng)值的影響程度為：D（提取級數(shù)）＞A（提取溫度）＞C（液料比）＞B（單級提取時間）。

對回歸方程進(jìn)行方差分析及顯著性檢驗(yàn)的結(jié)果見表4。由表4可知，該回歸整體模型顯著（Pr＞F值＜0.0001），失擬項(xiàng)不顯著（Pr＞F值=0.1064＞0.05），說明模型與實(shí)際擬合較好，能反應(yīng)各因素對發(fā)芽糙米GABA逆流提取的影響效果，因此所得方程能夠預(yù)測響應(yīng)值隨各參數(shù)的變化規(guī)律［14］，可用作發(fā)芽糙米提取GABA提取評定的理論基礎(chǔ)。

2.3.3響應(yīng)面水平的分析與優(yōu)化利用Design-Expert8.0軟件對回歸方程構(gòu)建響應(yīng)面分析圖，響應(yīng)面分析圖是響應(yīng)值對各實(shí)驗(yàn)因子所構(gòu)成的三維空間的曲面圖，從響應(yīng)面分析圖上可以形象的看出最佳參數(shù)和各個參數(shù)之間的相互影響作用［15］。依回歸方程繪制的響應(yīng)曲面和等高線圖如圖7～圖9所示。

表2　Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化方案及結(jié)果Table 2　Optimization project design and experimental results of Box-Behnken design

表3　回歸方程的顯著性檢驗(yàn)Table 3　Test of significance for regression equation

表4　逆流提取GABA提取率回歸模型的方差分析結(jié)果Table 4　Analysis of variance for regression equation of extraction rate of countercurrent extraction on GABA

圖7　提取溫度與液料比對GABA提取率影響的響應(yīng)面圖Fig.7　Response surface plots of extraction temperature and liquid/material ratio on the GABA content

圖8　提取級數(shù)與單級提取時間對GABA提取率影響的響應(yīng)面圖Fig.8　Response surface plots of extraction numbers and single stage extraction time on the GABA content

通過上述響應(yīng)面圖可即可對任何兩個因素交互影響發(fā)芽糙米GABA提取率效應(yīng)進(jìn)行分析和評價。響應(yīng)面坡度相對平緩，表示可以接受處理?xiàng)l件的變化［16］。圖7表示固定單級提取時間和提取級數(shù)，提取溫度與液料比對提取率的影響，在提取溫度為40～60℃，液料比為5∶1～7∶1時，提取率與單級提取時間和提取級數(shù)的增加而提高。根據(jù)圖8得知，提取率隨著單級提取時間與提取級數(shù)的增加而增加。圖9表示提取溫度50℃，提取級數(shù)3級時，發(fā)芽糙米GABA提取率逐漸的提高。由響應(yīng)面的分析圖可知，回歸模型存在最大值，最高點(diǎn)位于實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)范圍內(nèi)，結(jié)合回歸模型的數(shù)學(xué)分析，對回歸方程進(jìn)行一階偏導(dǎo)并令等于零，得到響應(yīng)曲面的最大值點(diǎn)［17］，整理得出最佳條件參數(shù)為A=51.4，B=59.3，C=5.9∶1，D=3。為檢驗(yàn)RSM法的可靠性，采用上述最優(yōu)提取條件對發(fā)芽糙米GABA進(jìn)行提取實(shí)驗(yàn)，考慮到實(shí)際操作簡便，將GABA的最佳提取工藝調(diào)整為提取溫度51℃，單級提取時間59min，液料比為5.9∶1，提取級數(shù)3級，在此最佳參數(shù)條件下進(jìn)行3次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，循環(huán)逆流法提取發(fā)芽糙米GABA平均提取率達(dá)到89.35%，與理論值89.47%接近，說明回歸方程能夠真實(shí)的反應(yīng)各參數(shù)對提取率的影響，對發(fā)芽糙米GABA提取工藝具有指導(dǎo)意義。

圖9　提取溫度與提取級數(shù)對GABA提取率影響的響應(yīng)面圖Fig.9　Response surface plots of extraction temperature and extraction numbers on the GABA content

3　結(jié)論

采用Box-Behnken響應(yīng)面法建立影響因素的二次回歸模型，對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，得到發(fā)芽糙米GABA最佳逆流提取工藝為提取溫度51℃、單級提取時間59min、液料比5.9∶1、提取級數(shù)3級，此條件下GABA提取率達(dá)到89.35%，實(shí)驗(yàn)擬合誤差小，可用來實(shí)際預(yù)測和評價發(fā)芽糙米GABA提取量，該方法是一種值得參考的高效、節(jié)能的提取工藝方法，采用逆流提取技術(shù)具有一定的可行性［18］。

［1］張暉，姚惠源，姜元榮.富含γ－氨基丁酸保健食品的研究與開發(fā)［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2002，28（9）：69-72.

［2］Rui Liu，Xiangli He，Jiaqi Shi，et al.The effect of electrolyzed water decontamination，germination and g-aminobutyric acid accumulation of brown rice［J］.Food Control，2013，33（1）：1-5.

［3］NaruebodeeSrisang，WaruneeVaranyanond，Somchart Soponronnarit，et al.Effects of heating media and operating conditions on drying kinetics and quality of germinated brown rice［J］.Journal of Food Engineering，2011，107（3）：385-392.

［4］欒連軍，陳娜，劉雪松，等.葡萄籽原花青素多級逆流提取工藝研究［J］.中國食品學(xué)報，2010，10（5）：32-35.

［5］R Poirot，L Prat，C Gourdon，et al.Fast batch to continuous solid-liquid extraction from plants in continuous industrial extractor［J］.Chem Eng Technol，2006，29（1）：46-51.

［6］S M Shen，J H Dai.Development of multistage count-current continuousextracting machine［J］.Pharm Eng Des，1977，18（4）：4-5.

［7］Q E Wang，S M Ma，B Q Fu，et al.Development of multistage countercurrent extraction technology for the extraction of glycyrrhizic acid（GA）from licorice［J］.Biochem Eng，2004，21（3）：285-292.

［8］G O Veloso，G C Thomasa，V G Krioukov.A mathematical model of extraction in countercurrent crossed flows［J］.Chemical Engineering and Processing，2008，47（9）：1470-1477.

［9］蔣靜，馬濤.營養(yǎng)液培養(yǎng)糙米發(fā)芽富集GABA工藝條件優(yōu)化［J］.食品工業(yè)科技，2013，34（5）：195-199.

［10］張毅，寧正祥，董華強(qiáng)，等.多穗柯總黃酮的連續(xù)逆流提取研究［J］.現(xiàn)代食品科技，2011，27（5）：550-552.

［11］陳恩城，張名位，彭超英，等.比色法快速測定糙米中γ-氨基丁酸含量研究［J］.中國糧油學(xué)報，2006，21（1）：125-128.

［12］JOSHI S，YADAV S，DESAI A J.Application of response surface methodology to evaluate the optimum medium components for the enhanced production of lichenysin by Bacillus licheniformis［J］.Biochemical Engineering Journal，2008，41（2）：122-127.

［13］劉振春，張利寬，于暢，等.響應(yīng)面優(yōu)化超聲波輔助提取發(fā)芽糙米黃酮工藝［J］.食品科學(xué)，2012，33（8）：80-84.

［14］王偉.響應(yīng)面分析法優(yōu)化花生殼黃酮類化合物提取工藝及其抗氧化活性的研究［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，39（22）：13521-13523.

［15］丁雙華，葉立斌，陳衛(wèi)，等.響應(yīng)面優(yōu)化提取桑葉多酚的研究［J］.中國食品學(xué)報，2012，12（1）：52-58.

［16］陳源，楊道富，范麗華，等.響應(yīng)面法優(yōu)化微波提取茂谷橘橙皮總黃酮工藝［J］.中國食品學(xué)報，2013，13（4）：80-86.

［17］馬鳳鳴，李浦，葉萬軍.脈沖強(qiáng)光對梨多酚氧化酶鈍化實(shí)驗(yàn)研究［J］.食品工業(yè)科技，2012，33（6）：159-162.

［18］Zheng-Wei Cui，Ming-Qi Cai，Chun-Fang Song，et al. Effects of different pretreatments on dynamic countercurrent extraction of polysaccharides from Ganoderma［J］.Separation and Purification Technology，2012，85（2）：61-68.

Process optimization of γ-aminobutyric acid from germinated brown rice by circulating countercurrent extraction method

MA Tao1，LIU Li-xia2，ZHAO Xu3，WANG Bo1，LIU He1，HUI Li-juan1，HE Yu-tang1
（1.College of Chemistry，Chemical Engineering and Food Safety，Bohai University，Jinzhou 121013，China；2.College of Food Science and Technology，Shenyang Agricultural University，Shenyang 110866，China；3.Grain Science Research Institute of Liaoning Province，Shenyang 110866，China）

By using water as extraction solvent，the laboratory simulation of dynamic countercurrent extraction method and response surface experimental design method were used for optimizing process conditions of γ-aminobutyric acid from germinated brown rice.The experimental results showed that the optimal extraction conditions were single stage extraction time for 59min at 51℃，a liquid material ratio 5.9∶1（mL/g）and extracted from the series 3.Under this conditions，the average extraction rate of GABA could reach 89.35%。

germinated brown rice；γ-aminobutyric acid；countercurrent extraction；condition optimization

TS210.4

B

1002-0306（2015）14-0249-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.14.043

2014－09－01

馬濤（1962-），男，博士，教授，研究方向：食品科學(xué)，生物材料科學(xué)。