劉　　云，唐軍榮，辛培堯，闞　歡，*，陶秀艷

（1.西南林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，云南昆明650224；2.西南林業(yè)大學(xué)國家林業(yè)局西南地區(qū)生物多樣性保育重點實驗室，云南昆明650224）

響應(yīng)面分析法優(yōu)化組培金線蓮多糖提取工藝研究

劉云1，唐軍榮2，辛培堯2，闞歡1，*，陶秀艷1

（1.西南林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，云南昆明650224；2.西南林業(yè)大學(xué)國家林業(yè)局西南地區(qū)生物多樣性保育重點實驗室，云南昆明650224）

利用響應(yīng)面法對組培金線蓮多糖提取過程中的醇沉工藝進(jìn)行優(yōu)化。在單因素實驗基礎(chǔ)上選取實驗因素與水平，根據(jù)中心組合（Box-Benhnken）實驗設(shè)計原理采用三因素三水平的響應(yīng)面分析法，以組培金線蓮多糖提取率為響應(yīng)值進(jìn)行響應(yīng)面實驗。得出組培金線蓮多糖提取過程中醇沉的最佳工藝條件為：乙醇與水浸提液的比例（液料比）3∶1（mL/mL）、沉淀時間3.1h，、離心時間15.0min，組培金線蓮多糖的提取率可達(dá)到3.992%。

組培金線蓮，多糖，提取，醇沉，響應(yīng)面分析

金線蓮（A noectochilus roxburghii（wall）Lind.l）即花葉開唇蘭，又稱金絲草、金不換、烏人參等，是蘭科開唇蘭屬的一種多年生草本植物，國家二級保護(hù)植物，也是一種多年生珍惜名貴的中草藥［1］。主要分布于海拔500～1800m的溫帶林地，性喜陰涼潮濕，生長在山澗溪谷的巖壁上或野林下陰濕的草叢中，一般呈稀疏、零星分布，很少成片密生［2］。現(xiàn)代藥理研究表明，其主要成分是多糖，多糖是一類具有高活性的生命大分子物質(zhì)具有抗氧化的作用。它在抗腫瘤、抗炎癥、刺激免疫及降血糖方面都有一定的作用［3-5］。

近年來，國內(nèi)外對于金線蓮活性多糖進(jìn)行了一些研究，關(guān)于金線蓮水提工藝的研究也曾有過報道［6-8］。但是對組培金線蓮多糖的研究卻鮮見報道。本實驗采用響應(yīng)面分析法，以多糖提取率為考察指標(biāo)，優(yōu)化組培金線蓮多糖的提取過程的醇沉工藝，找出最佳醇沉條件。研究結(jié)果將豐富組培金線蓮的應(yīng)用研究，累積研究資料，以期為組培金線蓮多糖的進(jìn)一步研究與開發(fā)利用提供實驗依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

組培金線蓮苗由西南地區(qū)生物多樣性保育重點實驗室組培室提供，烘箱中60℃烘干，粉碎過60目篩后保存于4～6℃冰箱中；葡萄糖天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司，分析純；苯酚天津市大茂化學(xué)試劑廠，分析純；硫酸汕頭市達(dá)濠精細(xì)化學(xué)品有限公司，分析純；95%乙醇天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司，食品級。

HH-2型數(shù)顯電子恒溫水浴鍋國華電器有限公司；DGH-9140A型數(shù)顯電熱鼓風(fēng)干燥箱上海一恒科學(xué)儀器有限公司；CP224C型電子天平上海奧豪斯儀器有限公司；UV-1000型紫外可見分光光度計北京萊伯泰科儀器有限公司；3K15型臺式冷凍高速離心機(jī)德國SIGMA公司。

1.2實驗方法

1.2.1組培金線蓮多糖的提取組培金線蓮干粉0.5g，按料水比1∶35的比例加入蒸餾水，在83℃的恒溫水浴鍋中保溫2.2h［7］。將浸提液用抽濾瓶進(jìn)行抽真空過濾，將抽濾后的浸提液按照一定的乙醇與水浸提液的比例（液料比）加入95%的乙醇進(jìn)行醇沉，充分?jǐn)嚢?，靜置一段時間后，于離心機(jī)中4000r/min離心一定時間，收集醇沉物。

1.2.2多糖含量與提取率的測定

1.2.2.1葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制［9］精密稱取經(jīng)105℃干燥恒重的標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖100mg，用溫蒸餾水溶解，并定容至100mL，搖勻。此溶液質(zhì)量濃度為1mg·mL-1。分別取上述葡萄糖溶液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0mL至100mL的容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度；精密量取上述各濃度的標(biāo)準(zhǔn)液2.0mL于10mL的具塞試管中，精密加入5%的苯酚溶液1.0mL，搖勻，再精密加入5.0mL濃硫酸搖勻，放置5min后置于90℃的水浴鍋中加熱15min取出，室溫冷卻，采用紫外可見分光光度法，在490nm的波長下測定吸光度。

1.2.2.2多糖含量及多糖提取率的測定采用苯酚-硫酸法［9-11］。樣品含量測定：醇沉物烘干復(fù)溶至100mL，從中取1mL至10mL的具塞試管中定容至刻度，再從中取出1mL，按照制作葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的步驟操作測定吸光度，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計算出多糖濃度。多糖提取率的計算式為：

1.2.3響應(yīng)面法對組培金線蓮多糖提取過程中醇沉工藝的優(yōu)化實驗

1.2.3.1單因素實驗

a.液料比對組培金線蓮多糖提取率的影響：在固定沉淀時間為9h、離心時間12min的條件下按液料比2∶1、2.5∶1、3∶1、3.5∶1、4∶1、4.5∶1、5∶1、5.5∶1、6∶1（mL/mL）分別進(jìn)行提取，平行測定3次取平均值，考察液料比對多糖提取率的影響。

b.沉淀時間對組培金線蓮多糖提取率的影響：在固定液料比為2.5∶1（mL/mL）、離心時間為12min的條件下，按沉淀時間分別為0、3、6、9、12、15h進(jìn)行提取，平行測定3次取平均值，考察沉淀時間對多糖提取率的影響。

c.離心時間對組培金線蓮多糖提取率的影響：在固定液料比為2.5∶1（mL/mL）、沉淀時間為3h的條件下，按離心時間分別為3、6、9、12、15min進(jìn)行提取，平行測定3次取平均值，考察離心時間對多糖提取率的影響。

1.2.3.2響應(yīng)面實驗在單因素實驗的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法中的Box-Behnken設(shè)計對組培金線蓮多糖的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，選取液料比、沉淀時間、離心時間為考察因素，分別以X1、X2和X3代表，多糖的提取率為響應(yīng)值（Y），實驗因素與水平設(shè)計如表1所示。

表1　響應(yīng)面實驗因素水平表Table 1　Factors and levels of RAS test

1.2.3.3驗證實驗響應(yīng)面法得出組培金線蓮多糖最佳提取工藝后，按照得出的最佳工藝條件進(jìn)行驗證實驗，重復(fù)三次，再與回歸方程所得的預(yù)測值進(jìn)行比較，來驗證采用響應(yīng)面法得到的實驗參數(shù)是否準(zhǔn)確可靠。

1.2.4數(shù)據(jù)處理運用Excel和Design-Expert 8.0.6軟件對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2　結(jié)果與分析

2.1葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

以葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)，對應(yīng)吸光值為縱坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖1所示。得到回歸方程y= 0.0140x-0.0034，相關(guān)系數(shù)R2=0.9993，葡萄糖濃度在0～60.0μg·mL-1范圍與吸光度有良好的線性關(guān)系。

圖1　葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1　The standard curve of glucose

2.2單因素實驗結(jié)果

2.2.1不同液料比對組培金線蓮多糖提取率的影響由圖2可以看出多糖提取率隨著液料比的增加而增大。在液料比從2∶1（mL/mL）增加到2.5∶1（mL/mL）時，多糖提取率增加明顯，繼續(xù)提高液料比對多糖提取率沒有明顯影響。液料比過小導(dǎo)致提取液中乙醇濃度較低，難以使原料中的多糖全部沉析出來，造成多糖沉淀不完全、提取率偏低；而料液比過大時，溶劑過多造成浪費并使后續(xù)離心工藝難度加大。因此，從降低成本和簡便操作考慮，在以后的實驗中液料比選擇2.5∶1（mL/mL）較為適宜。

2.2.2不同沉淀時間對組培金線蓮多糖提取率的影響由圖3可知，在0～3h沉淀時間范圍內(nèi)，多糖提取率隨時間的延長而明顯提高；3h以后，隨著沉淀時間的延長，多糖提取率逐漸下降。原因可能是沉淀時間過短，多糖沉析不完全，提取率低，延長沉淀時間有利于多糖的沉析，使多糖提取率增加；但是沉淀時間多長可能會引起沉淀出的多糖再次溶解到水中，造成多糖提取率下降。故選擇選擇沉淀時間0～6h為宜。

2.2.3不同離心時間對組培金線蓮多糖提取率的影響由圖4可知，在離心時間低于12min時多糖提取率提高比較明顯，以后增加趨于平緩，這表明多糖提取率與沉淀時間密切相關(guān)，機(jī)械離心作用可能會有利于浸提液中多糖的析出。從節(jié)約能源和降低成本考慮，選擇選擇離心時間9～15min為宜。

圖2　液料比對多糖提取率的影響Fig.2　Effect of ratio of ethanol to material on extraction rate of polysaccharide

圖3　沉淀時間對多糖提取率的影響Fig.3　Effect of precipitation time on extraction rate of polysaccharide

圖4　離心時間對多糖提取率的影響Fig.4　Effect of centrifugal time on extraction rate of polysaccharide

2.3響應(yīng)面結(jié)果

2.3.1響應(yīng)面實驗結(jié)果及方差分析響應(yīng)面實驗結(jié)果及方差分析見表2和表3。

表2　響應(yīng)面實驗設(shè)計及實驗結(jié)果Table 2　Program and results of RSA test

根據(jù)表2、表3實驗結(jié)果，運用Design-expert 8.0.6軟件進(jìn)行二次多元回歸擬合，得到二次多元回歸方程：

Y=0.35563+2.32300X1+0.61119X2-0.33719X3-0.054833X1X2+0.089500X1X3-1.33333E-003X2X3-0.47340X12-0.068733X22+5.04444E-003X32。

由表3可以看出，此模型的p=0.0024＜0.01，響應(yīng)面回歸模型達(dá)到極顯著水平，方程對實際實驗有較好的擬合性，相關(guān)系數(shù)R2=0.9328也表明模型擬合程度較好，實驗誤差較小。失擬項不顯著（p=0.1782＞0.05），說明非實驗因素對實驗結(jié)果的影響不大，可用該回歸方程代替實驗真實點對實驗結(jié)果進(jìn)行分析。

回歸方程系數(shù)的顯著性分析結(jié)果（表3）表明，液料比（X1）、沉淀時間二次項（X22）對實驗結(jié)果影響顯著，表明各實驗因子對響應(yīng)值的影響不是簡單的線性關(guān)系。對組培金線蓮多糖提取率影響的大小依次為：液料比＞沉淀時間＞離心時間，即液料比對組培金線蓮多糖提取率的影響最大。

2.3.2響應(yīng)面交互作用分析與優(yōu)化根據(jù)回歸方程得出不同因素的響應(yīng)面結(jié)果見圖5～圖7。從該圖可以明顯的分析出多個自變量對響應(yīng)值的影響。在響應(yīng)面圖中，曲面越陡峭，則該因素對響應(yīng)值的影響越顯著。同時，在控制兩個自變量之外的因素不變的情況下，兩個有交互的自變量對響應(yīng)值的影響也可以從響應(yīng)面圖的曲面上看出。

圖5表示沉淀時間和料液比的交互作用對多糖提取率的影響。雖然料液比對提取率的影響是明顯的，但是其與沉淀時間的交互作用卻是不明顯的p= 0.4119。從曲面圖中可以看出，保持沉淀時間不變，多糖提取率隨著液料比的增加而增加；而當(dāng)液料比保持不變，多糖提取率隨沉淀時間的增加先增大后減小，但總體上變化幅度較小，響應(yīng)面比較平坦，多糖提取率在沉降時間為3h左右達(dá)到最大值，過長的沉淀時間可能會導(dǎo)致多糖的復(fù)溶，從而導(dǎo)致多糖提取率的下降。

表3　方差分析表Table 3　Variance analysis of regression equation

圖5　Y=f（X1，X2）的響應(yīng)面Fig.5　Response surface plot of Y=f（X1，X2）

圖6　Y=f（X1，X3）的響應(yīng)面Fig.6　Response surface plot of Y=f（X1，X3）

圖6表示離心時間和液料比的交互作用對提取率的影響。雖然料液比對提取率的影響是明顯的，但是其與離心時間的交互作用卻是不明顯的p=0.1975。從曲面圖中可以看出，當(dāng)離心時間一定時，多糖提取率隨著液料比的增加而增加；而當(dāng)液料比一定時，延長離心時間，多糖提取率呈現(xiàn)逐漸增加趨勢，但增速趨緩。

圖7表示離心時間和沉淀時間的交互作用對多糖提取率的影響。二者的交互作用是不明顯的p= 0.9023。當(dāng)保持沉淀時間不變，延長離心時間，多糖提取率呈現(xiàn)逐漸增加趨勢，但增速趨緩；而當(dāng)保持離心時間不變，多糖提取率隨沉淀時間的延長先增加，當(dāng)沉淀時間達(dá)到5.5左右時達(dá)到峰值，然后緩慢減小。

圖7　Y=f（X2，X3）的響應(yīng)面Fig.7　Response surface plot of Y=f（X2，X3）

2.4驗證性實驗

利用Design－expert 8.0.6軟件求解回歸方程，得到組培金線蓮多糖的最佳提取工藝條件為：液料比3∶1（mL/mL）、沉淀時間3.11h、離心時間15.00min，在此條件下組培金線蓮多糖提取率理論可達(dá)3.831%。為檢驗該方法的可靠性，考慮到實際操作，將最佳工藝條件修正為：液料比3∶1（mL/mL）、沉淀時間3.1h、離心時間15.0min，在此條件下進(jìn)行多糖提取的驗證實驗。3次平行實驗多糖的實際提取率分別為3.890%、4.140%及3.910%，平均值為3.992%，與理論預(yù)測值的相對誤差為0.040%，說明用響應(yīng)面對組培金線蓮多糖的提取進(jìn)行工藝優(yōu)化具有實際可操作性。

3　結(jié)論

通過響應(yīng)面Box-Behnken實驗方法對組培金線蓮多糖提取過程中的醇沉工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，并對實驗結(jié)果進(jìn)行了數(shù)學(xué)模擬和預(yù)測，優(yōu)化后得到的最佳醇沉工藝條件為液料比為3∶1（mL/mL）、沉淀時間為3.1h、離心時間為15.0min，在此條件下的多糖提取率可達(dá)到3.992%，建立的數(shù)學(xué)模型能較好的預(yù)測各因素同提取率之間的關(guān)系，能為組培金線蓮多糖的研究及組培金線蓮的開發(fā)與利用提供一定的參考。

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Optimization of extraction technique of polysaccharides from tissue culture anoectochilus by response surface methodology

LIU Yun1，TANG Jun-rong2，XIN Pei-yao2，KAN Huan1，*，TAO Xiu-yan1
（1.College of Forestry，Southwest Foresty University，Kunming 650224，China；2.Key Laboratory of Biodiversity Conservation in Southwest China，State Forestry Administration，Southwest Forestry University，Kunming 650224，China）

Based on single factor tests，the optimum alcohol precipition conditons during the extraction process of polysaccharides from tissue culture Anoectochilus were obtained through Box-Benhnken central combination design and RSM.The results showed that the optimum alcohol precipition conditons during the extraction process of polysaccharides were as follows：ratio of ethanol to material 3∶1（mL/mL），precipitation time 3.1h，centrifugal time 15.0min.Under such conditions，the extraction rate of polysaccharides from tissue culture Anoectochilus was up to 3.992%.

tissue culture anoectochilus；polysaccharides；extraction；alcohol precipitation；response surface methodology

TS201.1

B

1002-0306（2015）14-0244-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.14.042

2014-09-15

劉云（1982-），男，碩士，實驗師，主要從事林產(chǎn)品加工及研發(fā)方面的工作。

闞歡（1965-），女，碩士，教授，主要從事林產(chǎn)品加工及研發(fā)方面的工作。

云南省教育廳科學(xué)研究基金資助項目（2013Y123）；云南省省院省校教育合作咨詢共建重點學(xué)科資助（211015）。