羅姍姍，王潤菡，萬　斌，邵遠(yuǎn)志

（海南大學(xué)食品學(xué)院，海南?？?70228）

具有拮抗膠孢炭疽菌活性酵母菌的分離和篩選

羅姍姍，王潤菡，萬斌，邵遠(yuǎn)志*

（海南大學(xué)食品學(xué)院，海南?？?70228）

從芒果果皮、葉片和芒果園土壤中分離篩選得到具有拮抗膠孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）活性的酵母菌，研究其對(duì)芒果中膠孢炭疽菌的抑制作用。采用平板對(duì)峙法和活體實(shí)驗(yàn)進(jìn)行篩選，采用形態(tài)學(xué)及rDNA-ITS序列分析等方法進(jìn)行鑒定。通過平板對(duì)峙和活體實(shí)驗(yàn)篩選發(fā)現(xiàn)，菌株T18對(duì)芒果炭疽病病原菌膠孢炭疽菌的拮抗作用明顯。抑菌實(shí)驗(yàn)表明，當(dāng)T18菌懸液濃度為1×108cfu/mL時(shí)，對(duì)膠孢炭疽菌的抑菌半徑為14.33mm。活體實(shí)驗(yàn)中，經(jīng)T18處理的芒果果實(shí)炭疽病病斑直徑僅為1.58mm，具有較強(qiáng)抑菌效果。通過菌落和菌體形態(tài)、生理生化、ITS序列分析對(duì)菌株T18進(jìn)行鑒定，最終確定為尼泊爾德巴利酵母（Debaryomyces nepalensis）。

膠孢炭疽菌，酵母菌，篩選，鑒定

芒果（Mangifera indica.L）又稱檬果，是熱帶和亞熱帶地區(qū)非常重要的水果。芒果營養(yǎng)豐富，并以其美觀的果形、鮮美的色澤、香甜的果肉、芳香的氣味而聞名于世，素有“熱帶水果之王”的美譽(yù)。但芒果果實(shí)貯藏較為困難，其中炭疽病是芒果采后貯藏運(yùn)輸過程中的主要病害，引起的芒果腐爛損失可達(dá)20%～30%［1］。長期以來，炭疽病的防治主要依賴使用化學(xué)殺菌劑［2］，然而多菌靈、苯來特和甲基硫菌靈等苯并咪唑類殺菌劑的長期大量使用，導(dǎo)致炭疽病主要致病菌膠孢炭疽菌對(duì)該類殺菌劑產(chǎn)生了抗藥性，使得防效下降。近年來，隨著人們對(duì)環(huán)境保護(hù)和食品安全越來越重視，研發(fā)更加安全、環(huán)保的芒果炭疽病防治新技術(shù)（如生物防治），顯得更加迫切［3-4］。在生防菌中，由于酵母具有抗逆性強(qiáng)、能在營養(yǎng)貧瘠的條件下生長、繁殖快速、不產(chǎn)生抗生素、受殺蟲劑影響較小等優(yōu)點(diǎn)，逐漸成為研究的熱點(diǎn)［5-7］。以拮抗酵母菌制成的生物制劑取代化學(xué)菌劑也將成為果蔬保鮮綠色環(huán)保防治措施的必然趨勢(shì)。

目前已報(bào)道的拮抗酵母菌有10余種，包括季也蒙畢赤酵母［8］、漢遜德巴利酵母、瓦爾維亞假絲酵母［9］等，主要用于防治果蔬貯藏時(shí)期的青霉病、綠霉病、灰霉病及其他腐爛病。此外，研究發(fā)現(xiàn)，多數(shù)拮抗酵母菌分離于健康芒果果皮表面或果實(shí)傷口處。為此，本研究從海南不同品種的芒果果皮、葉片以及不同地區(qū)芒果園土壤中分離篩選對(duì)膠孢炭疽菌具有拮抗作用的酵母菌，為進(jìn)一步應(yīng)用酵母菌防治芒果炭疽病奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

芒果果實(shí)摘自海南三亞芒果園，品種分別為紅貴妃、雞蛋芒、臺(tái)農(nóng)、象牙芒、澳芒、凱特芒、呂宋芒、金煌芒、紅玉芒、蘋果芒；土壤、葉片均取自海南三亞昌江芒果園；酵母膏、細(xì)菌學(xué)蛋白胨、細(xì)菌學(xué)瓊脂粉分析純，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；無水葡萄糖分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；EX Taq酶、dNTP、100 bp DNA Ladder（Dye Plus） TaKaRa；引物（ITS1：5’-TCCGATGGTGAACCTGCGG-3、ITS4：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’） 上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；Marker II（MD102） 天根生化科技（北京）有限公司。

AL-204電子分析天平梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；ZEALWAYGR60DA高壓滅菌器廈門致微儀器有限公司；LRH-150B生化培養(yǎng)箱廣東省醫(yī)療器械廠；SW-CJ-2FD超凈工作臺(tái)蘇州尚田潔凈技術(shù)有限公司；BHWV-200變頻搖床寧波海曙賽福實(shí)驗(yàn)儀器廠；Nikon ECLIPSE Ci-s/Ci-L顯微鏡南京衡橋儀器有限公司；101-2型電熱鼓風(fēng)干燥箱常州市華普達(dá)教學(xué)儀器有限公司；A200基因擴(kuò)增儀杭州朗基科學(xué)儀器有限公司；TG16KR臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)長沙東旺實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；RDY-SP1Z核酸電泳儀北京容陽經(jīng)典科技有限公司；JY04S-3C凝膠成像系統(tǒng)北京君意東方電泳設(shè)備有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1菌株的分離純化為擴(kuò)大酵母菌種資源，對(duì)海南地區(qū)不同品種的芒果果實(shí)及其葉片、土壤中的菌種進(jìn)行分離篩選。采用稀釋平板法和平板劃線法多次分離、純化酵母菌和芒果炭疽病原菌，直至獲得純培養(yǎng)物［10-11］。

1.2.2病原菌的鑒定及致病性檢測參照《真菌鑒定手冊(cè)》，同時(shí)采用rDNA-ITS序列分析（引物ITS1：5’-TCCGATGGTGAACCTGCGG-3’、引物ITS4：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’）對(duì)芒果炭疽病原菌進(jìn)行鑒定，確定病原菌種類。

1.2.3離體防效實(shí)驗(yàn)在平板上對(duì)分離純化的酵母菌和芒果炭疽菌進(jìn)行對(duì)峙培養(yǎng)［12］。測量抑菌帶寬，每個(gè)測量重復(fù)4次，計(jì)算平均值。

1.2.4活體防效實(shí)驗(yàn)參考Lima等［13］的方法：用接種針在果實(shí)腰部制造一個(gè)4mm（深）×3mm（寬）的傷口，室溫下干燥1h，分別接種離體復(fù)篩抑菌效果較好、濃度為1×108cfu/mL的酵母懸浮液20μL，4h后接種20μL濃度為1×106個(gè)/mL的炭疽菌孢子懸浮液。設(shè)無菌水（只加入40μL無菌水）和CK（20μL無菌水+ 20μL C.gloeosporioides菌液）兩種對(duì)照，室溫曬干后，于28℃高濕條件下培養(yǎng)。分別于接種第6d和12d觀察各處理果實(shí)的病斑直徑及其發(fā)病率，每個(gè)測量重復(fù)4次，計(jì)算平均值，篩選出拮抗效果最好且穩(wěn)定的酵母菌。

1.2.5酵母菌的鑒定菌體形態(tài)特征觀察參照沈萍等［14］的方法，采用美蘭浸片染色法，生理生化特征按照《酵母菌的特征與鑒定手冊(cè)》進(jìn)行［15］。同時(shí)采用rDNA-ITS序列分析（引物ITS1：5’-TCCGATGGTGAA CCTGCGG-3’、引物ITS4：5’-TCCTCCGCTTATTGAT ATGC-3’）對(duì)酵母菌進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定。

1.2.6數(shù)據(jù)分析實(shí)驗(yàn)中所有數(shù)據(jù)采用SPSS Statistics 19.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行處理，采用ANOVA進(jìn)行Duncan多重差異分析。

2　結(jié)果與分析

2.1酵母菌的分離、篩選

本研究從不同品種芒果表皮分離純化酵母菌192株，土壤分離97株，葉片分離70株，共分離359株（圖1），其中從芒果果皮病健交界處分離到的菌株最多，占總分離酵母數(shù)的33.70%。不同品種的芒果分離結(jié)果也有所差異，其中從呂宋芒、象牙芒、凱特芒處分離的酵母最多，分別為74、55、29株，占總分離酵母菌數(shù)的20.61%、15.32%、8.07%。所有酵母菌接種于試管斜面，4℃保藏。

圖1　酵母菌菌株培養(yǎng)形態(tài)Fig.1　The colony morphology of yeasts

2.2炭疽病原菌的鑒定及致病性檢測結(jié)果

2.2.1炭疽病原菌的形態(tài)特征觀察結(jié)果菌落近圓形，邊緣整齊。氣生菌絲白色至灰白色，漸變?yōu)樯罨疑?，絮狀或絨狀（圖2A）。分生孢子圓筒形或長橢圓形，有些一端稍尖，單胞無色，有油球（圖2B）。在PDA培養(yǎng)基上，多數(shù)菌株在后期能產(chǎn)生橘紅色或黑色的分生孢子堆，分生孢子梗短小，單枝，分生孢子圓柱形、橢圓形或卵圓形，單孢，近中部有一油球。

圖2　膠孢炭疽菌菌落形態(tài)（A）和菌體形態(tài)（B）Fig.2　Photographs of colonies（A）and cells（B）of the C.gloeosporioides

2.2.2病原菌的致病性檢測依據(jù)柯赫氏法則，從病果的病健交界處分離的芒果炭疽病原菌，在PDA培養(yǎng)基上分離純化，獲得炭疽病原菌純培養(yǎng)；再將純培養(yǎng)菌株接種到健康的芒果果實(shí)上，出現(xiàn)了相同癥狀的病害；從接種發(fā)病的芒果果實(shí)上再分離得到的純培養(yǎng)，性狀與接種物相同。

2.2.3炭疽病原菌的rDNA-ITS序列分析結(jié)果由圖3并結(jié)合rDNA-ITS序列分析結(jié)果可知，該病原菌的ITS序列全長為576bp，在GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行Blast同源性分析，結(jié)果表明菌株與Colletotrichum gloeosporioides的同源性為100%（EU149938）。綜合以上各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，可以鑒定該病原菌為膠孢炭疽菌。

圖3　病原菌的rDNA-ITS電泳圖譜Fig.3　PCR amplification of rDNA-ITS sequence of the pathogen

2.3平板對(duì)峙法拮抗酵母菌篩選結(jié)果

通過平板對(duì)峙法初篩，共篩選出對(duì)膠孢炭疽菌有拮抗作用的酵母菌67株，占總分離酵母菌株的18.66%。再經(jīng)過平板對(duì)峙法復(fù)篩，從67株拮抗膠孢炭疽菌的酵母菌中共篩選出21株抑菌圈較明顯的酵母菌，菌種名稱及其抑菌帶寬見表1。其中從呂宋芒果果皮分離到的拮抗膠孢炭疽菌的酵母菌最多，為7株，占21株酵母菌的33.33%，從象牙芒、紅貴妃、表金煌芒和凱特芒果皮表面分離得到有效拮抗酵母菌株數(shù)依次為6、5、2、1，分別占其總數(shù)的28.57%、23.81%、9.52%和4.77%。再次復(fù)篩得到4株酵母菌，由表1可知，F(xiàn)1-3、T18、T21、LA-4這4株酵母菌對(duì)膠孢炭疽菌的拮抗作用較明顯，抑菌帶寬分別為14.90、14.33、12.45、12.45mm（圖4）。

表1　拮抗膠孢炭疽菌的酵母菌離體復(fù)篩結(jié)果Table 1　Results of in vitro inhibition of C.gloeosporioides by yeasts

圖4　拮抗酵母菌在PDA平板上對(duì)膠孢炭疽菌的抑菌效果Fig.4　Antagonistic action of yeast strains on C.gloeosporioides in PDA medium

2.4拮抗酵母菌活體篩選結(jié)果

將復(fù)篩得到的21株酵母菌與膠孢炭疽菌（各20μL）共同接種到芒果果實(shí)傷口處，于28℃高濕條件下培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)，經(jīng)菌株T18處理的芒果果實(shí)炭疽病病斑直徑為1.58mm，顯著（p＜0.05）低于CK的13.11mm。菌株F1-3、LA-4、T21接種到果實(shí)上基本沒有表現(xiàn)出抑菌效果，其果實(shí)病斑直徑分別為11.31、10.97和12.91mm，與CK的差異不顯著（p≥0.05）。

圖5　酵母菌T18、T21、LA-4、F1-3的活體篩選結(jié)果Fig.5　Results of in vivo test of T18、T21、LA-4 and F1-3

2.5拮抗膠孢炭疽菌酵母菌的形態(tài)特征觀察結(jié)果

平板菌落奶白色，不透明，表面光滑且粘稠，邊緣光滑，反光，有發(fā)酵的香氣（圖6A）。麥芽汁液體培養(yǎng)基中25℃培養(yǎng)三天，菌體呈橢圓形，芽殖，未觀察到假菌絲（圖6B）。

圖6　酵母菌T18菌落形態(tài)（A）和細(xì)胞形態(tài)（B）Fig.6　Photographs of colonies（A）and cells（B）of T18

2.6拮抗酵母菌的生理生化特征

對(duì)菌株T18進(jìn)行了生理生化實(shí)驗(yàn)，包括糖類發(fā)酵實(shí)驗(yàn)、碳源同化實(shí)驗(yàn)、氮源同化實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如表2所示。

表2　酵母菌T18的生理生化鑒定結(jié)果Table 2　Result of biochemical and physiological identification of T18

2.7拮抗膠孢炭疽菌酵母菌的ITS序列分析結(jié)果

PCR擴(kuò)增結(jié)果顯示（圖7），擴(kuò)增得到的序列大小約647bp。將擴(kuò)增得到的產(chǎn)物進(jìn)行測序，所測得序列經(jīng)過與GenBank數(shù)據(jù)庫中的已有序列進(jìn)行Blast分析后發(fā)現(xiàn)，菌株T18與GenBank中Debaryomyces nepalensis的rDNA-ITS序列相似性為99%（JN942654）。根據(jù)同源性比較結(jié)果，可以初步確定菌株T18為尼泊爾德巴利酵母（D.nepalensis）。

綜合形態(tài)學(xué)觀察、生理生化測定和ITS序列分析結(jié)果，酵母菌T18被鑒定為尼泊爾德巴利酵母（D. nepalensis）。

圖7　酵母菌T18的rDNA-ITS電泳圖譜Fig.7　PCR amplification of rDNA-ITS sequence of T18

3　結(jié)論

本研究從土壤中分離篩選出的T18菌株在離體防效實(shí)驗(yàn)和活體防效實(shí)驗(yàn)對(duì)芒果膠孢炭疽菌都具有明顯的拮抗效果。通過形態(tài)學(xué)、生理生化實(shí)驗(yàn)和分子生物學(xué)相結(jié)合的方法對(duì)該菌株進(jìn)行鑒定，鑒定為尼泊爾德巴利酵母。目前尚無從芒果果實(shí)、葉片和芒果園土壤中分離出尼泊爾德巴利酵母和關(guān)于該菌應(yīng)用于芒果采后炭疽病防治的報(bào)道。有研究已從不同來源的酵母菌中分離到揮發(fā)性產(chǎn)物、病程蛋白、抗菌肽等多種不同的抗菌物質(zhì)，今后的研究可以集中在探索尼泊爾德巴利酵母的拮抗機(jī)理和增加拮抗效力的方法上。本研究首次證明尼泊爾德巴利酵母對(duì)芒果采后炭疽病具有生防效果，擴(kuò)大了拮抗酵母菌的來源，為以后開展芒果采后炭疽病的生物防治具有重大的指導(dǎo)意義。

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Isolation and screening of antagonism yeast against mango Colletotrichum gloeosporioides

LUO Shan-shan，WANG Run-han，WAN Bin，SHAO Yuan-zhi*
（College of Food Science and Technology，Hainan University，Haikou 570228，China）

Isolation and screening of antagonism yeast against Colletotrichum gloeosporioides from peel，leaf and soil of mango fruits，and investigation of antagonistic effect of isolated yeast against C.gloeosporioides. Yeast was screened out through confront culture method and in vivo test，and identified by phenotypic and genotypic characteristics.The yeast strain T18 showed highest and most stable antagonistic effect.Results showed that inhibition zone diameter of T18 was 14.33mm at concentration of 1.0×108cfu/mL，with strong in vivo antagonistic effect of lesion diameter of 1.58mm.The strain T18 isolated from soil was identified by colony and cell morphology，biological and biochemical characteristics，and ITS sequence，and was identified as Debaryomyces nepalensis.

Colletotrichum gloeosporioides；yeast；screening；identification

TS201.3

A

1002-0306（2015）14-0216-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.14.036

2014-10-31

羅姍姍（1989-），女，碩士研究生，研究方向：果蔬保鮮與貯藏。

邵遠(yuǎn)志（1969-），男，本科，副教授，研究方向：果蔬保鮮與貯藏。

農(nóng)業(yè)部南亞熱作項(xiàng)目（14RZNJ-59）；海南省重大科技專項(xiàng)（ZDZX-2013011）。