張良雨，趙強(qiáng)強(qiáng)，郝靈珍，劉祝兵，管　　斌，*，孔　青，范金石

（1．中國(guó)海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東青島266003；2．青島科技大學(xué)化工學(xué)院，山東青島266042）

白地霉發(fā)酵過程中菌體量檢測(cè)方法的研究

張良雨1，趙強(qiáng)強(qiáng)1，郝靈珍1，劉祝兵2，管斌1，*，孔青1，范金石2

（1．中國(guó)海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東青島266003；2．青島科技大學(xué)化工學(xué)院，山東青島266042）

探討了白地霉發(fā)酵過程中菌體量的檢測(cè)方法，對(duì)白地霉的細(xì)胞組分麥角固醇和氨基葡萄糖，能否作為菌體量檢測(cè)指標(biāo)的可行性進(jìn)行了比較分析。結(jié)果表明：氨基葡萄糖在白地霉細(xì)胞中的含量較為穩(wěn)定，在不同的培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)條件和培養(yǎng)基中都有較好的穩(wěn)定性，可以作為白地霉菌體量的檢測(cè)指標(biāo)；麥角固醇受培養(yǎng)時(shí)間和培養(yǎng)基成分的影響較大，含量不穩(wěn)定，不太適合作為白地霉菌體量的檢測(cè)指標(biāo)。用氨基葡萄糖法測(cè)得的白地霉生長(zhǎng)曲線與用干重法測(cè)得的生長(zhǎng)曲線變化一致，能夠較為準(zhǔn)確地反映白地霉菌體量變化。將此方法應(yīng)用到白地霉固態(tài)發(fā)酵中，可快速得到白地霉固態(tài)發(fā)酵過程中的菌體量變化，為以后固態(tài)發(fā)酵菌體量的測(cè)定提供了依據(jù)。

白地霉，菌體量，麥角固醇，氨基葡萄糖

白地霉（Geotrichum candidum）是一種常見真菌，形態(tài)特征介于酵母菌和霉菌之間，繁殖方式以裂殖為主，少數(shù)菌株間有芽生孢子。菌落呈絨毛狀或粉狀，韌或易碎，具有真菌絲，芽孢子單個(gè)或連接成鏈，長(zhǎng)筒狀，也有些呈橢圓形［1］。白地霉生長(zhǎng)適應(yīng)性強(qiáng)，生長(zhǎng)快，在多種介質(zhì)中均能生長(zhǎng)，菌體蛋白含量豐富，可用于優(yōu)質(zhì)的蛋白飼料及脂肪酶的發(fā)酵生產(chǎn)等。

菌體量是反映微生物生長(zhǎng)情況的一項(xiàng)基本參數(shù)，通過測(cè)定其菌體量可了解發(fā)酵過程中微生物的生長(zhǎng)及發(fā)酵狀況。與液態(tài)發(fā)酵相比，固態(tài)發(fā)酵具有投資少，易操作，后處理簡(jiǎn)單，污染少，生長(zhǎng)粗放，產(chǎn)量高等優(yōu)點(diǎn)，因此受到國(guó)內(nèi)外人士的廣泛青睞，成為發(fā)酵行業(yè)中廣泛應(yīng)用的工藝類型之一。但白地霉，在固態(tài)基質(zhì)中生長(zhǎng)時(shí)，菌絲會(huì)深入培養(yǎng)基內(nèi)部，與培養(yǎng)基緊密纏繞在一起，不易從底物中分離出來，所以很難直接測(cè)定其菌體量。為解決這一難題，通常采用間接法來進(jìn)行微生物菌體量的測(cè)定。固態(tài)發(fā)酵中測(cè)定微生物菌體量的方法大致可分為以下4大類：a.直接從固態(tài)培養(yǎng)基中將菌體分離出來進(jìn)行測(cè)定，如：直接計(jì)數(shù)［2］等；b.檢測(cè)細(xì)胞的代謝成分變化，如測(cè)定O2和CO2的代謝量［3-4］、測(cè)定胞外酶的活性［5］、測(cè)定ATP［6］、免疫活性等；c.測(cè)定營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消耗，如干重?fù)p失法［7］等；d.測(cè)定細(xì)胞中的某些特殊組分，如幾丁質(zhì)［8］、核酸［9］和蛋白質(zhì)等。

目前國(guó)內(nèi)外有關(guān)白地霉液態(tài)以及固態(tài)發(fā)酵菌體量的測(cè)定方法報(bào)道較少，綜合對(duì)液態(tài)和固態(tài)發(fā)酵生物量的研究結(jié)果，選用文獻(xiàn)中較為準(zhǔn)確且易行的幾種方法：測(cè)定細(xì)胞中的特殊物質(zhì)如麥角固醇［10］、氨基葡萄糖［11］等組分含量來推測(cè)微生物菌體量。麥角固醇，是存在于真菌細(xì)胞膜中的甾類化合物，是真菌中主要的固醇類物質(zhì)，專一性很強(qiáng)。幾丁質(zhì)是真菌細(xì)胞壁的主要成分，是一種由N-乙酰氨基葡萄糖通過α-1，4糖苷鍵連接而成的直鏈高分子聚合物。本文通過研究白地霉菌體內(nèi)麥角固醇和氨基葡萄糖含量與菌體量之間的關(guān)系，考察了培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)條件、培養(yǎng)基成分對(duì)其含量的影響，力求確定一種操作簡(jiǎn)便、快速準(zhǔn)確的測(cè)定白地霉菌體量或反映白地霉生長(zhǎng)狀況的方法。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

白地霉（編號(hào)：2.0498 Geotrichum candidum） 中國(guó)微生物菌種保藏中心；菌種保藏培養(yǎng)基10°Brix麥芽汁1000mL，瓊脂20g，pH6.0；液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)基Ⅰ：葡萄糖10g，MgSO4·7H2O 1g，KH2PO45g，酵母浸膏2g，尿素1g，加水定容至1L，pH6.0；培養(yǎng)基Ⅱ：10°Brix麥芽汁1000mL，pH6.0；固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基處理秸稈∶麩皮∶豆粕=6∶3∶1，固液比1∶1.5；麥角固醇標(biāo)準(zhǔn)溶液、氨基葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液用Sigma公司提供的標(biāo)準(zhǔn)品配制；醇?jí)A溶液50%KOH：無水乙醇（體積比2∶3）；正庚烷分析純；乙酰丙酮試劑3.5mL乙酰丙酮溶于50mL 1.2mol/L碳酸鈉溶液中，現(xiàn)用現(xiàn)配；對(duì)二甲氨基苯甲醛試劑1.333g對(duì)二甲氨基苯甲醛溶于25mL無水乙醇及25mL濃鹽酸的混合液中，棕色瓶保存，現(xiàn)用現(xiàn)配。

SPS202F型電子分析天平梅特勒-托利多稱重設(shè)備有限公司；ZDX-35BI型高壓蒸汽滅菌鍋上海申安醫(yī)療器械廠；DH4000AB型電熱恒溫培養(yǎng)箱、DL-I-15型高級(jí)臺(tái)式封閉電爐天津市泰斯特儀器有限公司；SHZ-C型水浴恒溫振蕩器上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠；HWS-250型恒溫恒濕箱、DZF-6020型真空干燥箱上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；SHZ-D（Ⅲ）循環(huán)水式真空泵鞏義市英峪予華儀器廠；PHS-2F型pH計(jì)、722N型可見分光光度計(jì)上海精科電子有限公司；BCM-1000型超凈工作臺(tái)蘇凈集團(tuán)安泰公司；LD5-10B型低速離心機(jī)北京雷勃爾離心機(jī)有限公司；UV-2802PC型紫外分光光度計(jì)尤尼克儀器有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1菌種培養(yǎng)方法斜面種子培養(yǎng)：將保存的白地霉菌種接入斜面麥芽汁培養(yǎng)基上，28℃下培養(yǎng)至菌苔長(zhǎng)滿斜面，置冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)：用生理鹽水沖洗斜面，并稀釋至孢子濃度為106～107cfu/mL（血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)）。在300mL三角瓶中加入100mL液體培養(yǎng)基Ⅰ，115℃滅菌30min后，接入白地霉孢子懸浮液5mL，30℃、180r/min恒溫振蕩培養(yǎng)48h。

固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)：在500mL三角瓶中加入固態(tài)培養(yǎng)基20g，滅菌后接入白地霉液體種子液2mL，30℃下恒溫靜置培養(yǎng)，每天搖動(dòng)三角瓶以防止結(jié)塊。

1.2.2純菌絲體的獲得培養(yǎng)結(jié)束后，將發(fā)酵液抽濾，并用蒸餾水充分洗滌濾紙上的濾出物，收集濾出物，然后置60℃真空干燥箱內(nèi)烘干至恒重，研缽研碎，置于干燥處保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

1.2.3.1麥角固醇標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制準(zhǔn)確配制濃度為100μg/mL的麥角固醇標(biāo)準(zhǔn)溶液，稀釋成梯度溶液，用紫外分光光度計(jì)測(cè)其282nm處吸光值，繪制麥角固醇濃度與吸光值的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3.2氨基葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制準(zhǔn)確配制濃度為100μg/mL的氨基葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，稀釋成梯度溶液，各取2mL樣液（空白為蒸餾水），分別加入1mL乙酰丙酮試劑，沸水浴30min，冷卻后加入2mL無水乙醇、1mL對(duì)二甲氨基苯甲醛試劑振蕩，再加入4mL無水乙醇，60℃保溫1h，用可見分光光度計(jì)測(cè)其530nm處吸光值［12］，繪制氨基葡萄糖濃度與吸光值的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.4微生物菌體量與麥角固醇以及氨基葡萄糖含量的關(guān)系

1.2.4.1菌體中麥角固醇含量與菌體量的關(guān)系準(zhǔn)確稱取在同一培養(yǎng)條件下培養(yǎng)相同時(shí)間所得到的純菌體0.1、0.2、0.3、0.4、0.5g，提取菌體中的麥角固醇并測(cè)其吸光值，計(jì)算不同質(zhì)量菌體中麥角固醇的含量。

1.2.4.2菌體中氨基葡萄糖含量與菌體量的關(guān)系準(zhǔn)確稱取在同一培養(yǎng)條件下培養(yǎng)相同時(shí)間所得到的純菌體0.1、0.2、0.3、0.4、0.5g，提取菌體中的氨基葡萄糖并測(cè)其吸光值，計(jì)算不同質(zhì)量菌體中氨基葡萄糖的含量。

1.2.5培養(yǎng)條件對(duì)菌體中麥角固醇和氨基葡萄糖含量的影響

1.2.5.1培養(yǎng)時(shí)間對(duì)菌體中麥角固醇和氨基葡萄糖含量的影響將白地霉接種于液體培養(yǎng)基Ⅰ中，30℃，180r/min下培養(yǎng)，每12h進(jìn)行取樣分析，測(cè)定不同菌齡下白地霉單位菌體內(nèi)麥角固醇和氨基葡萄糖的含量。

1.2.5.2搖床轉(zhuǎn)速對(duì)菌體中麥角固醇和氨基葡萄糖含量的影響在液體發(fā)酵中，影響微生物生長(zhǎng)的主要因素為培養(yǎng)過程中的溶氧量（與搖床轉(zhuǎn)速相關(guān)）［8］。為研究培養(yǎng)條件對(duì)菌體中麥角固醇和氨基葡萄糖含量的影響，在此選擇不同的搖床轉(zhuǎn)速作為改變的培養(yǎng)條件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。在培養(yǎng)基Ⅰ中接種白地霉，選擇搖床轉(zhuǎn)速為160、180、200r/min，30℃培養(yǎng)48h后獲得純菌體，測(cè)定單位菌體內(nèi)麥角固醇和氨基葡萄糖的含量。

1.2.5.3培養(yǎng)基對(duì)菌體中麥角固醇和氨基葡萄糖含量的影響分別在培養(yǎng)基Ⅰ、培養(yǎng)基Ⅱ中接種等量的白地霉，30℃，180r/min下培養(yǎng)48h后獲得純菌絲體，測(cè)定單位菌體內(nèi)麥角固醇和氨基葡萄糖的含量。

1.2.6氨基葡萄糖含量與微生物菌體量的變化曲線

將白地霉接種于液體培養(yǎng)基Ⅰ中，30℃，180r/min下培養(yǎng)，每隔4h取樣，先通過抽濾烘干測(cè)其菌體干重，再檢測(cè)干燥后菌體中的氨基葡萄糖含量，根據(jù)氨基葡萄糖與菌體量的關(guān)系進(jìn)而推算出白地霉的菌體干重，每組實(shí)驗(yàn)做三次平行，取其平均值，通過兩種方法繪制生長(zhǎng)曲線并比較兩條曲線的變化情況。

1.2.7白地霉固態(tài)發(fā)酵過程中菌體量的變化按10%的接種量，將液態(tài)培養(yǎng)24h的白地霉種子液接入固體培養(yǎng)基中，30℃恒溫靜置培養(yǎng)，每天提取固體培養(yǎng)基中的氨基葡萄糖含量，并計(jì)算白地霉菌體量，繪制白地霉固態(tài)發(fā)酵菌體量隨時(shí)間的變化曲線。

1.3測(cè)定方法

1.3.1麥角固醇的提取和測(cè)定按照張博潤(rùn)等［13］的方法，并作出適當(dāng)修改。準(zhǔn)確稱取干菌體0.1g（空白不加）置于100mL磨口三角瓶中，加入20mL醇?jí)A溶液，85～90℃水浴中皂化3h，室溫下冷卻，加入20mL正庚烷進(jìn)行萃取，加瓶塞振蕩30s，靜置30min分層。取上清液0.5mL，加4.5mL 95%乙醇稀釋10倍，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定282nm處的吸光值。其單位干菌體細(xì)胞中麥角固醇的含量計(jì)算公式如下：

式中：c—根據(jù)樣品在282nm處的吸收值，從標(biāo)準(zhǔn)曲線中獲得麥角固醇的濃度（μg/mL）；N—稀釋倍數(shù)；V—萃取液的體積（mL）；w—菌體干重（g）。

1.3.2氨基葡萄糖的提取和測(cè)定

1.3.2.1樣品預(yù)處理［14］準(zhǔn)確稱取干菌體0.3g（干固態(tài)培養(yǎng)基0.6g），加2mL 60%H2SO4，25℃浸泡24h，稀釋至1mol/L H2SO4，置于250mL三角瓶中，9.8×104Pa高壓加熱1h，冷卻后用1mol/L NaOH中和至pH7，定容到100mL。

1.3.2.2測(cè)定方法［12］Elson-Morgan法用于測(cè)定游離的氨基糖，氨基糖在堿性條件下與乙酰丙酮縮合形成生色原——2-甲基-3-二乙酰吡咯衍生物，生色原再與對(duì)二甲氨基苯甲醛在濃鹽酸乙醇溶液中生色，在530nm處有最大吸收值。取2mL樣液（空白為蒸餾水），加1mL乙酰丙酮試劑，沸水浴加熱30min，冷卻后加入2mL無水乙醇、1mL對(duì)二甲氨基苯甲醛試劑振蕩，再加入4mL無水乙醇，60℃保溫1h，530nm處測(cè)定吸光值。其單位干菌體細(xì)胞中氨基葡萄糖的含量為：

式中：c—根據(jù)樣品在530nm處的吸收值，從標(biāo)準(zhǔn)曲線中獲得氨基葡萄糖的濃度（μg/mL）；V—樣液的總體積（mL）；w—菌體干重（g）。

1.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

每組實(shí)驗(yàn)做三個(gè)平行，結(jié)果均以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析（One-Way ANOVA），比較數(shù)據(jù)間的差異性是否顯著，顯著水平為p＜0.05。

2　結(jié)果與分析

2.1麥角固醇與氨基葡萄糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線

麥角固醇含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示。由此得到麥角固醇含量與光吸收值的函數(shù)關(guān)系：麥角固醇含量（μg/mL）=35.84×A282。

圖1　麥角固醇標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1　Standard curve of ergosterol

氨基葡萄糖含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2所示。由此得到氨基葡萄糖含量與光吸收值的函數(shù)關(guān)系：氨基葡萄糖含量（μg/mL）=113.64×A530。

圖2　氨基葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2　Standard curve of glucosamine

2.2微生物菌體量與麥角固醇以及氨基葡萄糖含量的關(guān)系

一種細(xì)胞組分能否作為微生物菌體量的檢測(cè)指標(biāo)，首要的條件就是其在細(xì)胞中的含量應(yīng)與菌體量具有良好的線性關(guān)系。因此，首先對(duì)細(xì)胞中麥角固醇、氨基葡萄糖含量與菌體量的關(guān)系進(jìn)行考察。

2.2.1菌體中麥角固醇含量與菌體量的關(guān)系由圖3可知，在同一培養(yǎng)條件下培養(yǎng)相同時(shí)間所得到的不同質(zhì)量的白地霉菌體中，麥角固醇含量與菌體量之間呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，所得線性回歸方程為y= 3.106x-0.0314，相關(guān)系數(shù)R2=0.9962。

表1　培養(yǎng)時(shí)間對(duì)菌體中麥角固醇和氨基葡萄糖含量的影響Table 1　Effect of culture time on content of ergosterol and glucosamine

圖3　菌體生物量與麥角固醇含量的關(guān)系Fig.3　Correlation between mycelia biomass and ergosterol content

2.2.2菌體中氨基葡萄糖含量與菌體量的關(guān)系由圖4可知，在同一培養(yǎng)條件下培養(yǎng)相同時(shí)間所得到的不同質(zhì)量的白地霉菌體中，氨基葡萄糖含量與菌體量之間呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，所得線性回歸方程為y=37.834x+0.0716，相關(guān)系數(shù)R2=0.9945。

圖4　菌體生物量與氨基葡萄糖含量的關(guān)系Fig.4　Correlation between mycelia biomass and glucosamine content

2.3培養(yǎng)條件對(duì)菌體中麥角固醇和氨基葡萄糖含量的影響

一種細(xì)胞組分能否作為微生物菌體量的檢測(cè)指標(biāo)，其在細(xì)胞中的含量與微生物菌體量?jī)H有良好的線性關(guān)系還不夠，此組分在細(xì)胞中的含量還必須在微生物的整個(gè)生長(zhǎng)周期內(nèi)基本維持恒定，即與培養(yǎng)時(shí)間無關(guān)；而且在不同的培養(yǎng)條件下基本保持相同［15］。因此，接下來從培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)條件、培養(yǎng)基成分三方面對(duì)菌體中麥角固醇和氨基葡萄糖含量的穩(wěn)定性進(jìn)行了驗(yàn)證。

2.3.1培養(yǎng)時(shí)間對(duì)菌體中麥角固醇和氨基葡萄糖含量的影響由表1可以看出，培養(yǎng)12h的菌體中麥角固醇和氨基葡萄糖含量與其他數(shù)據(jù)相差較大，這可能是因?yàn)榕囵B(yǎng)12h時(shí)白地霉菌絲體的量很少，通過過濾法收集菌體后烘干稱重所產(chǎn)生的相對(duì)誤差較大，故可以將此組數(shù)據(jù)舍去。將其余數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，結(jié)果表明在檢驗(yàn)水平α=0.05時(shí)，不同菌齡的白地霉單位菌體內(nèi)麥角固醇含量差異顯著（p＜0.05），而單位菌體內(nèi)氨基葡萄糖含量無顯著差異（p＞0.05），故可認(rèn)為菌齡對(duì)白地霉單位菌體內(nèi)麥角固醇含量有較大影響，而對(duì)單位菌體內(nèi)氨基葡萄糖含量影響不大。

2.3.2搖床轉(zhuǎn)速對(duì)菌體中麥角固醇和氨基葡萄糖含量的影響溶氧量是影響微生物生長(zhǎng)的主要因素，通過改變搖床轉(zhuǎn)速來改變?nèi)苎趿?，探究不同培養(yǎng)條件下單位菌體內(nèi)麥角固醇和氨基葡萄糖含量的變化。將表2數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，結(jié)果表明在檢驗(yàn)水平α=0.05時(shí)，不同搖床轉(zhuǎn)速下，白地霉單位菌體內(nèi)麥角固醇和氨基葡萄糖的含量均無顯著差異（p＞0.05），故可視作單位菌體內(nèi)麥角固醇和氨基葡萄糖含量在不同的搖床轉(zhuǎn)速下基本保持相同。

表2　搖床轉(zhuǎn)速對(duì)菌體中麥角固醇和氨基葡萄糖含量的影響Table 2　Effect of shaking speed on content of ergosterol and glucosamine

2.3.3培養(yǎng)基對(duì)菌體中麥角固醇和氨基葡萄糖含量的影響培養(yǎng)基Ⅰ是以葡萄糖為碳源，尿素為氮源，添加營(yíng)養(yǎng)鹽的合成培養(yǎng)基；培養(yǎng)基Ⅱ所采用的麥芽汁培養(yǎng)基為天然培養(yǎng)基，其主要成分來源于麥芽，兩種培養(yǎng)基的組成顯然不同。將表3數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，結(jié)果表明在檢驗(yàn)水平α=0.05時(shí)，對(duì)于不同的培養(yǎng)基組成，白地霉單位菌體內(nèi)麥角固醇含量差異較為顯著（p＜0.05），而單位菌體內(nèi)氨基葡萄糖含量無顯著差異（p＞0.05），因此可認(rèn)為培養(yǎng)基成分的不同對(duì)單位菌體內(nèi)氨基葡萄糖的含量幾乎沒有影響，而對(duì)單位菌體內(nèi)麥角固醇含量的影響則相對(duì)要大。

綜合以上三個(gè)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果得出：氨基葡萄糖在白地霉菌體中的含量相對(duì)穩(wěn)定，與菌齡、搖床轉(zhuǎn)速和培養(yǎng)基組成無關(guān)，可以作為衡量白地霉菌體量的檢測(cè)指標(biāo)；而麥角固醇雖不受搖床轉(zhuǎn)速的影響，但受菌齡和培養(yǎng)基成分的影響較大，不適合作為白地霉菌體量測(cè)定的指標(biāo)。

表3　培養(yǎng)基成分對(duì)菌體中麥角固醇和氨基葡萄糖含量的影響Table 3　Effect of different mediums on content of ergosterol and glucosamine

2.4氨基葡萄糖含量與微生物菌體量的變化曲線

由圖5可以看出，液體發(fā)酵后得到的白地霉純菌體，通過稱量不同培養(yǎng)時(shí)間的菌體干重繪制出來的生長(zhǎng)曲線，與通過檢測(cè)培養(yǎng)不同時(shí)間菌體內(nèi)氨基葡萄糖含量進(jìn)而推算出的菌體干重變化趨勢(shì)一致，最大偏差為0.271g，可以認(rèn)為，菌體中氨基葡萄糖的含量能夠較為準(zhǔn)確地反映白地霉菌體量的變化。

圖5　白地霉實(shí)測(cè)菌體量和推算菌體量的變化曲線Fig.5　The changed curve of Geotrichum candidum actual biomass and calculated biomass

2.5白地霉固態(tài)發(fā)酵過程中菌體量的變化

白地霉在固態(tài)發(fā)酵過程中由于菌絲體與培養(yǎng)基纏繞在一起不容易直接測(cè)定，故在確定了其菌體量檢測(cè)方法之后，進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵時(shí)，便可利用氨基葡萄糖法測(cè)定其菌體量的變化情況，結(jié)果如圖6所示。

圖6　白地霉固態(tài)發(fā)酵過程中菌體量的變化Fig.6　Mycelia development of Geotrichum candidum during solid state fermentation process

由于氨基葡萄糖是真菌細(xì)胞壁的主要成分，固態(tài)基質(zhì)中并不存在氨基葡萄糖，因此通過檢測(cè)培養(yǎng)基中的氨基葡萄糖含量，并根據(jù)公式來計(jì)算菌體量的方法是可行的。由圖6可以看出，在白地霉固態(tài)發(fā)酵過程中，前3d菌體生物量顯著增加，第3d菌體量達(dá)到最大，為0.2702g/g干物質(zhì)，稍后基本保持恒定變化較小，第6d開始下降，這可能是由于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)被大量消耗，營(yíng)養(yǎng)不足，導(dǎo)致菌體大量死亡，此種方法較好地反映了白地霉固態(tài)發(fā)酵過程中菌體量的變化，為解決固態(tài)發(fā)酵菌體量檢測(cè)困難的問題提供了依據(jù)。

3　結(jié)論

本文對(duì)白地霉細(xì)胞組分中的特殊物質(zhì)——麥角固醇和氨基葡萄糖含量是否適合作為白地霉菌體量的檢測(cè)指標(biāo)進(jìn)行了一系列研究，最終得出了較為準(zhǔn)確的白地霉菌體量檢測(cè)方法。

3.1不同質(zhì)量的白地霉菌體中，麥角固醇和氨基葡萄糖含量與菌體量呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)均達(dá)到0.99以上。

3.2通過檢驗(yàn)白地霉單位菌體內(nèi)麥角固醇和氨基葡萄糖含量的穩(wěn)定性，得到白地霉菌體量的檢測(cè)指標(biāo)。單位菌體內(nèi)氨基葡萄糖在白地霉生長(zhǎng)過程中較為穩(wěn)定，不受培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)基成分、搖床轉(zhuǎn)速的影響，適合作為白地霉菌體量的檢測(cè)指標(biāo)；而單位菌體內(nèi)麥角固醇受培養(yǎng)時(shí)間和培養(yǎng)基成分的影響較大，即不同菌齡和在不同培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的白地霉，其單位菌體內(nèi)麥角固醇含量波動(dòng)較大，不適宜作為白地霉菌體量的檢測(cè)指標(biāo)。

3.3利用氨基葡萄糖法測(cè)得的白地霉菌體量與干重法測(cè)得的菌體量變化趨勢(shì)相同，兩種方法較為一致地顯示了白地霉在生長(zhǎng)過程中菌體量的變化情況，因此菌體中氨基葡萄糖含量能夠較好地反映白地霉的生長(zhǎng)狀況。

3.4將此方法應(yīng)用到白地霉固態(tài)發(fā)酵過程中，通過檢測(cè)固體培養(yǎng)基中的氨基葡萄糖含量間接得到微生物菌體量，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在第3d菌體量達(dá)到最大，

為0.2702g/g干物質(zhì)，說明氨基葡萄糖法檢測(cè)白地霉固態(tài)發(fā)酵菌體量是可行的。

［1］孫丙升.產(chǎn)香白地霉發(fā)酵無醇類啤飲料的研究［D］.濟(jì)南：山東輕工業(yè)學(xué)院，2009.

［2］范廣璞.白酒中生香酵母的篩選及培養(yǎng)條件的研究［J］.中國(guó)釀造，2008，14：44-47.

［3］Sugama S，Okazaki N.Growth estimation of Aspergillus oryzae cultured on solid meida［J］.J Ferment Technol，1979，57：408-412.

［4］Narahaaara H，Kyoama Y.Growth and enzyme production in a solid-state culture of Aspergillus oryzae［J］.J Ferment Technol，1982，60：311-319.

［5］Carrizalez V，Rodriguez H，Sarrdina I.Determination of specific growth of molds on semi-solid cultures［J］.Biotechnol Bioeng，1981，23：321-333.

［6］Matcham S E，Jordan B R，Wood D A.Methods for assessmentof fungal growth on solid substrates［J］.Soc Appl Bacterioc Tech Ser，1984，19：6-18.

［7］蘇東海，石堅(jiān)，劉萍，等.秸稈固態(tài)發(fā)酵酒精過程中參數(shù)的測(cè)定［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2005，31（6）：1-5.

［8］高修功，章克昌.纖維素酶固態(tài)發(fā)酵過程中菌體生長(zhǎng)量的測(cè)定［J］.工業(yè)微生物，1994，24（3）：26-30，34.

［9］Koliander B，Hampel W，Roehr M.Indirect estimation of biomass by rapid ribonucleic acid determination［J］.Appl Microbiol Biotechnol，1984，19：272-276.

［10］Pant D，Adholeya A.Enhanced production of ligninolytic enzymes and decolorization of molasses distillery wastewater by fungi under solid state fermentation［J］.Biodegradation，2007，18（5）：647-659.

［11］Palanivel Velmurugan，Hyun Hur，Vellingiri Balachandar，et al.Monascus pigment production by solid-state fermentation with corn cob substrate［J］.Journal of Bioscience and Bioengineering，2011，112：590-594.

［12］蘇暢，夏文水，姚惠源.氨基葡萄糖和乙酰氨基葡萄糖的測(cè)定方法［J］.食品工業(yè)科技，2003，24（6）：74-75.

［13］張博潤(rùn)，何秀萍，鐵翠娟，等.麥角固醇高產(chǎn)菌株的構(gòu)建及其培養(yǎng)優(yōu)化條件的研究［J］.生物工程學(xué)報(bào)，1999，15（1）：46-51.

［14］路秀玲，趙樹欣，劉忠華.紅曲霉固態(tài)發(fā)酵中生物量的測(cè)定方法［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2000，27（6）：45-49.

［15］魏培蓮，岑沛霖，盛春琦.3種固態(tài)發(fā)酵生物量測(cè)定方法的比較［J］.食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2006，25（1）：60-64，69.

Study on Geotrichum candidum biomass detection methods in fermentation process

ZHANG Liang-yu1，ZHAO Qiang-qiang1，HAO Ling-zhen1，LIU Zhu-bing2，GUAN Bin1，*，KONG Qing1，F(xiàn)AN Jin-shi2
（1．College of Food Science and Engineering，Ocean University of China，Qingdao 266003，China；2．College of Chemical Engineering，Qingdao University of Science&Technology，Qingdao 266042，China）

The detection methods of Geotrichum candidum biomass in its fermentation process were discussed in this study.The feasibility of whether the cell components in Geotrichum candidum-ergosterol and glucosamine could be used as indicators for biomass estimation in fermentation was examined and analyzed.The experimental results showed that glucosamine could be a good biomass indicator as it remained constant in cells with the changes of culture time，culture condition and medium.Ergosterol amount changed with the different culture time and medium type；therefore，it could not accurately represent the changes of biomass.The growth curve of Geotrichum candidum measured by glucosamine method was in accordance with the growth curve by dry weight，so it could be able to reflect the changes of Geotrichum candidum biomass accurately.This method was also applied to the process of solid-state fermentation，getting the variation of Geotrichum candidum biomass in its process of solid-state fermentation quickly.So in solid-state fermentation，glucosamine could be used as the indicator to calculate Geotrichum candidum biomass indirectly，which provided the basis for biomass detection in solid-state fermentation.

Geotrichum candidum；biomass；ergosterol；glucosamine

TS201.3

A

1002-0306（2015）14-0184-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.14.030

2014－10－13

張良雨（1990-），女，碩士研究生，主要從事發(fā)酵工程方面的研究。

管斌（1957-），男，博士，教授，主要從事發(fā)酵工程方面的研究。

“十二五”農(nóng)村領(lǐng)域國(guó)家科技計(jì)劃（2013BAD10B02-06）；青島市公共領(lǐng)域科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（11-2-3-63-nsh）；啤酒生物發(fā)酵工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放課題（K2012002）。