陳亞藍(lán)，王雪青，*，李月嬌，宋文軍，王素英，趙國(guó)強(qiáng)，付慶偉

（1.天津市食品與生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院，天津300134；2.唐山遷西縣板栗產(chǎn)業(yè)研究發(fā)展中心，河北唐山064300）

板栗花黃酮的抗氧化作用及其對(duì)Hela細(xì)胞活力的影響

陳亞藍(lán)1，王雪青1，*，李月嬌1，宋文軍1，王素英1，趙國(guó)強(qiáng)2，付慶偉2

（1.天津市食品與生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院，天津300134；2.唐山遷西縣板栗產(chǎn)業(yè)研究發(fā)展中心，河北唐山064300）

采用水楊酸法、鄰苯三酚自氧化法和三價(jià)鐵離子法分別測(cè)定板栗花黃酮清除羥自由基（·OH）和超氧陰離子自由基（O2-·）的能力及其總還原力，以研究板栗花黃酮的抗氧化作用；采用MTT法測(cè)定純化板栗花黃酮對(duì)Hela細(xì)胞活性的影響。結(jié)果表明：板栗花黃酮具有較強(qiáng)的還原力并能有效清除·OH，其總還原力和·OH清除率顯著高于VC對(duì)照組（p＜0.05），可達(dá)0.605和94.97%；純化后板栗花黃酮的總還原力和清除·OH能力較純化前明顯增強(qiáng)。但板栗花黃酮對(duì)O2-·的清除率明顯低于VC對(duì)照組。同時(shí)純化后板栗花黃酮能顯著抑制Hela的細(xì)胞活力，在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，抑制率最高至81%，呈劑量-效應(yīng)性。因此，板栗花黃酮具有較強(qiáng)的抗氧化活性和抑制Hela細(xì)胞活力的作用，本文為板栗花的綜合利用與開(kāi)發(fā)提供了一定的數(shù)據(jù)支持。

板栗花，黃酮，抗氧化活性，Hela，細(xì)胞活力

板栗花，殼斗科栗屬植物板栗的雄花序，性甘、平、無(wú)毒。據(jù)《本草綱目》記載，板栗花可治療喉炎腫毒、瘰病和赤白痢疾。現(xiàn)代研究顯示板栗花含有黃酮、雌二醇、多糖等多種活性物質(zhì)［1］，特別是黃酮類(lèi)物質(zhì)含量高達(dá)9.08g/100g，為報(bào)道花中含量之首［2］。板栗屬于雌雄同株果樹(shù)，雌雄花比例在1∶2400～1∶4000之間［3］，因此會(huì)產(chǎn)生大量的雄花，特別是近年來(lái)隨著板栗種植面積不斷增加，每年有大量板栗花產(chǎn)生，對(duì)其進(jìn)行研究與開(kāi)發(fā)具有重要的社會(huì)意義與經(jīng)濟(jì)效益。

黃酮類(lèi)化合物是植物中廣泛存在的以2-苯基色原酮為母核的一類(lèi)化合物，由于母核上的羥基、甲氧基、烴氧基、異戊烯氧基等取代基不同，表現(xiàn)的活性也不同［4］。據(jù)報(bào)道黃酮類(lèi)化合物，如銀杏黃酮，葛根黃酮等，具有很好的清除自由基、抗氧化作用，對(duì)于與機(jī)體的氧化損傷密切相關(guān)的人類(lèi)一些慢性疾病，如高血壓、心臟病和癌癥等，黃酮類(lèi)化合物在抗炎癥、防癌等方面具很好的應(yīng)用［4-7］。黃酮類(lèi)化合物是植物的一大類(lèi)次生代謝產(chǎn)物，其種類(lèi)多，結(jié)構(gòu)各異，表現(xiàn)在生物利用率、抗氧化性及對(duì)人體的影響也有差異，因此從天然植物中篩選高活性的黃酮類(lèi)化合物，是目前食品與營(yíng)養(yǎng)等領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一。一些天然產(chǎn)物，如白藜蘆醇及其衍生物等［7-8］，均具有清除自由基的抗氧化作用，從而保護(hù)DNA、蛋白質(zhì)等機(jī)體生物大分子免受氧化損害，起到預(yù)防和治療動(dòng)脈粥樣硬化、心腦血管疾病和抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的作用［7-9］。關(guān)于板栗花黃酮的抗氧化活性近幾年有研究報(bào)道［10］，但其對(duì)腫瘤細(xì)胞的作用目前尚未見(jiàn)相關(guān)研究。因此，本實(shí)驗(yàn)從板栗花中提取黃酮，研究其體外抗氧化活性及對(duì)Hela細(xì)胞的影響，為板栗花黃酮的開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供參考。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

板栗花河北省唐山遷西鮮板栗花，自然風(fēng)干后粉碎；Hela細(xì)胞天津商業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供；96孔板、MTT試劑、DMEM/HIGH GLUCOSE培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）、0.25%胰蛋白酶購(gòu)于life公司；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品上海永葉生物科技有限公司，98%；二甲基亞砜（DMSO）、無(wú)水乙醇、磷酸氫二鉀、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、鹽酸、抗壞血酸、鄰苯三酚、過(guò)氧化氫、硫酸亞鐵、水楊酸、鄰苯三酚、鐵氰化鉀天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司，均為分析純。

T6新世紀(jì)紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；3-18K高速離心機(jī)美國(guó)SIGMA公司；FHC-1200A超凈工作臺(tái)北京國(guó)儀合信商貿(mào)有限公司；240i細(xì)胞培養(yǎng)箱美國(guó)Thermo公司；SPECTRAMAX-M5酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀美國(guó)MD公司；Ti-u倒置熒光顯微鏡日本尼康公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1板栗花黃酮含量的測(cè)定以蘆丁作為標(biāo)準(zhǔn)品，參照文獻(xiàn)方法［11］并加以改進(jìn)。具體操作如下，采用亞硝酸鋁比色法測(cè)定，精密稱(chēng)取蘆丁對(duì)照品并用95%乙醇溶液溶解，精確配制成0.016、0.032、0.048、0.064、0.08mg/mL，分別精確吸取1mL置于50mL容量瓶中，加5%NaNO2溶液2mL，放置6min，加10%Al（NO3）3溶液2mL，放置6min，加4%NaOH溶液20mL，加水至刻度，搖勻，放置15min，于510nm處測(cè)吸光值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。純化前后的板栗花黃酮含量，分別將提取物在510nm處測(cè)其吸光值。

1.2.2粗提板栗花黃酮準(zhǔn)確稱(chēng)取一定質(zhì)量經(jīng)粉碎、過(guò)篩（80目）、干燥（100℃）的板栗花粉末置于1000mL的圓底燒瓶中，加入10倍量的石油醚進(jìn)行脫脂，待脫脂完全后過(guò)濾，棄去石油醚溶液，用70%的乙醇按固液比1∶30，回流提取兩次，合并兩次提取液，真空過(guò)濾，濾液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，得到的粗提液經(jīng)冷凍干燥得粉末，并測(cè)定其黃酮含量。

1.2.3純化板栗花黃酮以板栗花黃酮粗提液為原料，用D-101大孔樹(shù)脂分離純化。上樣液質(zhì)量濃度2mg/mL、上樣速率為2mL/min，過(guò)柱完后用5倍樹(shù)脂體積量（5BV）的蒸餾水以2mL/min的速度洗柱至出水無(wú)色，再用70%的乙醇以2mL/min的洗脫速度洗脫至無(wú)色透明，收集70%的乙醇洗脫液，減壓濃縮，干燥，稱(chēng)重，測(cè)定總黃酮含量。

1.2.4板栗花黃酮對(duì)羥基自由基清除率的測(cè)定參照高麗威報(bào)道的方法進(jìn)行［12］。在10mL具塞試管中加入樣液2mL，1mL 6mmol/L的FeSO4，1mL 6mmol/L的H2O2，混勻后靜置10min，隨后加入6mmol/L水楊酸1mL，搖勻放置30min于510nm處測(cè)吸光值，并設(shè)空白對(duì)照計(jì)算清除率。其清除率公式如下：

式中：A0表示空白對(duì)照的吸光度；Ax表示樣液的吸光度；Ai表示等體積蒸餾水代替水楊酸時(shí)吸光度值。

1.2.5板栗花黃酮對(duì)超氧陰離子清除率的測(cè)定超氧陰離子清除率的測(cè)定采用鄰苯三酚自氧化法［13-14］。具體操作如下：取4.5mL pH8.0的0.05mol/L磷酸鹽緩沖液置于25℃水浴中加熱20min，隨后加入1mL樣液和25mmol/L鄰苯三酚溶液0.4mL，混勻后于25℃水浴中反應(yīng)5min，最后加入80mmol/L的HCl溶液1mL搖勻，靜置3min以終止反應(yīng)，在420nm處測(cè)定吸光度值。超氧陰離子清除率計(jì)算公式如下：

式中：A1表示樣液的吸光值；A2表示等體積蒸餾水替代鄰苯三酚溶液的吸光值；A3表示空白對(duì)照組的吸光值。

1.2.6板栗花黃酮總還原力的測(cè)定參照文獻(xiàn)方法［13］并加以改進(jìn)。具體操作如下：取10mL具塞試管，加入2mL樣液，pH6.6的磷酸鹽緩沖液2.5mL，1%鐵氰化鉀溶液2.5mL，混勻置于50℃恒溫水浴鍋上水浴20min，加入10%（v/v）的三氯乙酸溶液2.5mL，取5mL混勻液和0.1%FeCl3溶液1mL定容50mL，在700nm處平行三次測(cè)吸光值。計(jì)算還原能力的公式如下：

還原力（A）=Ai-A0

式中：Ai表示樣液吸光值；A0表示空白對(duì)照組的吸光值。

1.2.7板栗花黃酮對(duì)Hela細(xì)胞活力的影響采用MTT法測(cè)細(xì)胞活力［15］。Hela細(xì)胞以DMEM/HIGH GLUCOSE培養(yǎng)基（含10%FBS及1%雙抗）培養(yǎng)，置于37℃，5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中，每2～3d傳代一次，取生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。將培養(yǎng)48h的對(duì)數(shù)期細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，按1×105個(gè)/200μL接種于96孔板，培養(yǎng)24h后，分為不添加純化板栗花黃酮的對(duì)照組和加入純化板栗花黃酮，使其終濃度分別為0.0001、0.001、0.01、0.1、1mg/mL五個(gè)實(shí)驗(yàn)組，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，同時(shí)，設(shè)無(wú)細(xì)胞的培養(yǎng)基為空白組，用于測(cè)定時(shí)調(diào)零。藥物作用24h后加入MTT溶液（終濃度為5mg/mL），孵育4h，終止培養(yǎng)，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，PBS洗滌3次。每孔加入150μL DMSO，振蕩使結(jié)晶物充分溶解，在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上以波長(zhǎng)490nm測(cè)各孔吸光度（OD值），計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率。公式如下：

式中：OD1表示實(shí)驗(yàn)組吸光度值；OD2表對(duì)照組吸收光度值。

2　結(jié)果與分析

2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的確定及純化前后板栗花黃酮的純度

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)如圖1所示，得線(xiàn)性回歸方程：y= 10.169x+0.0158，其中R2=0.9971。根據(jù)曲線(xiàn)得到粗提板栗花黃酮與純化后板栗花黃酮純度分別為14.36%，33.1%。

圖1　蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)Fig.1　Standard curve of rutin

2.2板栗花黃酮純化前后對(duì)羥基自由基清除能力

圖2是純化前后的板栗花黃酮對(duì)·OH清除能力的影響。從圖2可知，在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，隨著黃酮濃度的增加，清除·OH的能力逐漸增大，與濃度呈正相關(guān)。在0.15～0.4mg/mL范圍內(nèi)，純化后板栗花黃酮的·OH清除能力明顯高于總黃酮濃度相同的粗提板栗花黃酮（p＜0.05）。當(dāng)黃酮濃度為0.05mg/mL時(shí)，粗提板栗花黃酮和純化板栗花黃酮的·OH清除能力均達(dá)到50%以上，在濃度為0.1～0.4mg/mL范圍內(nèi)純化后的板栗花黃酮的·OH清除能力與同濃度的VC溶液相比有顯著性差異（p＜0.05），且純化后板栗花黃酮在濃度為0.4mg/mL時(shí)其清除能力高達(dá)94.97%，明顯高于VC對(duì)照組，說(shuō)明板栗花黃酮有較好的·OH清除能力。

圖2　板栗花黃酮對(duì)·OH的清除能力Fig.2　Scavenging·OH activity of the flavonoids from chestnut flower

2.3板栗花黃酮純化前后對(duì)超氧陰離子自由基的清除能力

O2-·是機(jī)體內(nèi)壽命最長(zhǎng)的自由基，其作為自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的引發(fā)劑，一旦自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)啟動(dòng)，會(huì)給機(jī)體造成進(jìn)一步的危害。由圖3可知，純化前后板栗花黃酮對(duì)超O2-·的清除能力隨溶液濃度增加而增強(qiáng)，在0.05～1mg/mL范圍內(nèi)，VC的清除能力明顯強(qiáng)于純化前后板栗花黃酮（p＜0.05）。在相同濃度時(shí)，純化前后板栗花黃酮對(duì)O2-·的清除能力無(wú)顯著性差異（p＞0.05）。

圖3　板栗花黃酮對(duì)超氧陰離子自由基的清除能力Fig.3　Scavenging O2-·activity of the flavonoids from chestnut flower

2.4板栗花黃酮純化前后總還原力

圖4　板栗花黃酮總還原能力Fig.4　Total reducing power of the flavonoids from chestnut flower

板栗花黃酮的總還原力見(jiàn)圖4。由圖4可知，純化前后板栗花黃酮的總還原力明顯強(qiáng)于VC（p＜0.05），且隨板栗花黃酮濃度的增加而增加，表現(xiàn)出良好的劑量-效應(yīng)關(guān)系，是較好的電子供應(yīng)者。當(dāng)板栗花黃酮濃度在0.05～0.3mg/mL范圍內(nèi)時(shí)，同濃度的純化前后的板栗花黃酮總還原力明顯高于VC的總還原力，差異顯著（p＜0.05），且純化板栗花黃酮總還原力強(qiáng)于粗提板栗花黃酮（p＜0.05），最高可達(dá)0.605。在黃酮含量為0.1mg/mL時(shí)純化后板栗花黃酮總還原力高出板栗花黃酮粗提液80.07%，說(shuō)明純化后板栗花黃酮還原力效果升高顯著（p＜0.05）。

2.5板栗花黃酮對(duì)Hela細(xì)胞活性的影響

純化板栗花黃酮對(duì)Hela細(xì)胞活性影響見(jiàn)表1，從表1可知，隨著黃酮濃度的增加，細(xì)胞的抑制率也隨之增大，表現(xiàn)出與黃酮的濃度呈正相關(guān)。當(dāng)黃酮濃度由0.01～1mg/mL，抑制率由40%增加到81%，呈劑量依賴(lài)性作用方式，其對(duì)Hela細(xì)胞的IC50為100.38μg/mL。

表1　板栗花黃酮對(duì)Hela細(xì)胞活力的影響（±s）Table 1　Effect of the flavonoids-purified from chestnut flower on Hela cellular viability（±s）

表1　板栗花黃酮對(duì)Hela細(xì)胞活力的影響（±s）Table 1　Effect of the flavonoids-purified from chestnut flower on Hela cellular viability（±s）

注：*與對(duì)照組比較，p＜0.05。

實(shí)驗(yàn)組　　濃度（mg/mL）　OD值　　抑制率（%）空白組　0　0　-對(duì)照組　0　0.39±0.005　-實(shí)驗(yàn)組1　0.0001　0.32±0.013　18±0.027實(shí)驗(yàn)組2　0.001　0.29±0.013　27±0.037實(shí)驗(yàn)組3　0.01　0.23±0.003*　40±0.135實(shí)驗(yàn)組4　0.1　0.19±0.008*　53±0.017實(shí)驗(yàn)組5　1　0.07±0.008*　81±0.019

3　討論

本研究中板栗花黃酮同樣顯示出有很強(qiáng)的還原能力，純化后的板栗花黃酮還原力大于純化前，而且二者均大于VC對(duì)照，且呈劑量依賴(lài)性的特點(diǎn)（圖4），與文獻(xiàn)［16］報(bào)道結(jié)果相近。在清除羥基自由基能力方面，純化后板栗花黃酮的羥基自由基清除能力高于純化前，而二者明顯高于VC對(duì)照組，特別是純化后的板栗花黃酮在0.4mg/mL濃度時(shí)羥基自由基清除率高達(dá)94.97%，顯示出超強(qiáng)的清除羥自由基的能力，該結(jié)果優(yōu)于文獻(xiàn)［17］的報(bào)道。這可能是因?yàn)樘崛『图兓に嚥煌瑢?dǎo)致的結(jié)果，通過(guò)對(duì)黃酮類(lèi)物質(zhì)的分離與純化，改變了黃酮的圖譜，從而顯示出了清除能力差異。黃酮類(lèi)化合物通過(guò)本身含有的多酚羥基與羥自由基反應(yīng)，形成穩(wěn)定的半醌式自由基結(jié)構(gòu)，從而中斷自由基的鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，以發(fā)揮清除自由基的抗氧化作用，而且不同的黃酮類(lèi)化合物，由于酚羥基活性基團(tuán)數(shù)量與位點(diǎn)不同，導(dǎo)致不同來(lái)源的黃酮化合物清除自由基能力的差異［18］。而在超氧陰離子自由基的清除過(guò)程中，純化前后板栗花黃酮都明顯弱于抗壞血酸的作用效果，反映出黃酮類(lèi)物質(zhì)不能與超氧陰離子有效的結(jié)合，這與文獻(xiàn)［19］中芒萁黃酮的體外抗氧化趨勢(shì)一致。

許多研究報(bào)道，黃酮類(lèi)物質(zhì)具有抑制腫瘤細(xì)胞增生的能力。如甘草黃酮對(duì)Hela細(xì)胞的增殖具有顯著的抑制及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的效果，200μg/mL劑量的甘草黃酮抑制腫瘤細(xì)胞增殖的效果最佳［20］；大薊黃酮能誘導(dǎo)人子宮癌Hela細(xì)胞的凋亡，其對(duì)Hela細(xì)胞的IC50為85.12μg/mL［21］。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)純化后的板栗花黃酮能顯著抑制Hela細(xì)胞毒活性，其對(duì)Hela細(xì)胞的IC50為100.38μg/mL，說(shuō)明板栗花黃酮同其他植物黃酮一樣，具有較好的抗腫瘤效果。

黃酮類(lèi)物質(zhì)的抗腫瘤作用機(jī)制與其抗氧化、清除自由基的作用密切相關(guān)。而黃酮類(lèi)化合物清除自由基作用強(qiáng)弱受其結(jié)構(gòu)影響，如C2，C3位雙鍵，酚羥基取代模式及數(shù)目和羥基甲氧基取代以及B環(huán)上存在鄰二酚羥基等，從而影響其抗癌效果［22］?，F(xiàn)有研究表明，黃酮類(lèi)化合物對(duì)腫瘤細(xì)胞有細(xì)胞毒作用，而對(duì)正常細(xì)胞無(wú)毒性和致突作用，反而有抗氧化和正向的免疫調(diào)節(jié)作用［23］。松樹(shù)皮中提取的黃酮類(lèi)化合物能誘導(dǎo)MCF27細(xì)胞凋亡，但對(duì)正常細(xì)胞無(wú)作用［24］；圣草酚對(duì)Vero細(xì)胞毒性很小卻能有效地抑制皮膚癌細(xì)胞A375、喉癌細(xì)胞HEp2、乳腺癌細(xì)胞MCF27、肝癌細(xì)胞HepG2和宮頸癌細(xì)胞Hela的增殖［25］。因此，黃酮類(lèi)化合物這種選擇性毒性對(duì)于研究和開(kāi)發(fā)板栗花黃酮有重要作用。

4　結(jié)論

板栗花資源豐富，板栗花黃酮具有強(qiáng)的還原能力和清除·OH能力，可顯著抑制Hela細(xì)胞的生長(zhǎng)，并呈劑量依賴(lài)性的特點(diǎn)。因此，板栗花黃酮具有抗氧化和抑制腫瘤細(xì)胞增生的功效，本研究結(jié)果為板栗花的綜合利用與開(kāi)發(fā)提供了很好的應(yīng)用前景。然而關(guān)于板栗花黃酮的精細(xì)結(jié)構(gòu)解析，構(gòu)效關(guān)系以及其抗腫瘤作用機(jī)制有待進(jìn)一步探究。

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Effect of the flavonoids from chestnut flower on antioxidant activity and cellular viability of Hela line

CHEN Ya-lan1，WANG Xue-qing1，*，LI Yue-jiao1，SONG Wen-jun1，WANG Su-ying1，ZHAO Guo-qiang2，F(xiàn)U Qing-wei2
（1.Tianjin Key Laboratory of Food Biotechnology，College of Biotechnology and Food Science，Tianjin University of Commerce，Tianjin 300134，China；2.Qianxi Chestnut Industry Research and Development Center，Tangshan 064300，China）

Antioxidant activity of the flavonoids from chestnut flower was studied by determining free radicals scavenging abilities including superoxide anion free radicals（O2-·）and hydroxyl free radicals（·OH），and total inducing power using the salicylic acid assay，pyrogallol autoxidation assay and ferric reducing antioxidant assay，respectively.And the influence of flavonoids-purified on the Hela cellular viability was also investigated by MTT assays.The results showed that the scavenging·OH ability and total reducing power of flavonoids from chestnut flower were obviously stronger than those of the VCcontrol，and the flavonoids-purified sample exhibited the better scavenging·OH ability and total reducing power compared to the flavonoids-cruded sample.The highest scavenging ability on·OH and the strongest total reducing power were 0.605 and 94.97%，respectively.However，the scavenging ability of before or after flavonoids-purified samples on O2-· was less effective than that of VCcontrol.Furthermore，MTT data suggested that the purified flavonoids sample exhibited the powerful cytotoxic activity on Hela cells which appeared to be concentration dependent，and the highest inhibitory cellular viability was 81%within the experimental concentration.Therefore，the flavonoids from chestnut flower had the stronger antioxidant activity and inhibit the growth of Hela cells，and those findings provided the data to support for the comprehensively utilizating and developing chestnut flower.

chestnut flower；flavonoids；antioxidant activity；Hela；cellular viability

TS255.1

A

1002-0306（2015）14-0165-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.14.026

2014－09－26

陳亞藍(lán)（1991-），女，碩士研究生，研究方向：天然活性物質(zhì)的研究與開(kāi)發(fā)。

王雪青（1964-），女，博士，教授，研究方向：天然活性物質(zhì)的研究與開(kāi)發(fā)。

天津市高等學(xué)校創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)建設(shè)規(guī)劃資助項(xiàng)目（TD12-5049）；天津市高校科技發(fā)展基金資助項(xiàng)目（20120603）；唐山遷西縣板栗產(chǎn)業(yè)研究發(fā)展中心資助項(xiàng)目（G11034）。