黃業(yè)傳，李　鳳，嚴(yán)　成

（西南科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，四川綿陽(yáng)621010）

高壓促進(jìn)豬肉肌內(nèi)脂肪氧化過(guò)程中脂肪氧化酶的作用

黃業(yè)傳，李鳳，嚴(yán)成

（西南科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，四川綿陽(yáng)621010）

為研究高壓促進(jìn)豬肉肌內(nèi)脂肪氧化過(guò)程中脂肪氧化酶（Lipoxygenase，LOX）的作用，以去除LOX的豬背最長(zhǎng)肌為原料，在其中加入事先從豬肉中提取的或外源LOX（大豆脂肪氧化酶），經(jīng)600MPa、50℃或350MPa、20℃處理并經(jīng)6d冷藏后，測(cè)定各樣品高壓處理和冷藏后LOX活性和TBARS值。結(jié)果表明：LOX對(duì)高壓下肌內(nèi)脂肪氧化的啟動(dòng)有重要作用，但其不會(huì)影響樣品冷藏后的最終氧化狀態(tài)（TBARS值）；在高壓處理后的冷藏中，LOX的作用不明顯，主要以脂肪自動(dòng)氧化為主，即使加入5倍濃度的外源LOX，也只引起樣品最終TBARS值的少量增加。因此，高壓促進(jìn)豬肉肌內(nèi)脂肪氧化中主要以自動(dòng)氧化為主，而LOX的作用很小。

高壓，豬肉，脂肪氧化，脂肪氧化酶

高壓技術(shù)在食品中的應(yīng)用始于100多年前，但當(dāng)時(shí)由于設(shè)備等方面的限制并沒(méi)有真正推廣。直到上世紀(jì)90年代，歐美和日本等發(fā)達(dá)國(guó)家開(kāi)始投入大量人力、物力和財(cái)力對(duì)高壓技術(shù)進(jìn)行研究。高壓處理能在低溫或常溫下抑制或殺滅食品中有害微生物和酶，從而延長(zhǎng)食品保質(zhì)期；或改善食品的功能特性，如嫩度、凝膠特性等［1］。相比于傳統(tǒng)的熱處理，高壓對(duì)食物營(yíng)養(yǎng)和感官品質(zhì)破壞更小，能最大限度保留食物的色、香、味和營(yíng)養(yǎng)成分［2-4］。但高壓處理也有對(duì)食品品質(zhì)不利的地方，如一定壓力下能加快肉中脂肪氧化，從而使肉品質(zhì)敗壞［5-7］。

壓力誘導(dǎo)肌肉脂肪氧化的原因很多學(xué)者進(jìn)行了研究，但結(jié)論并不一致，如可能與變性蛋白的協(xié)同作用［8］、高壓下金屬離子釋放［9-11］、高壓下酶活性變化［12］或細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)損壞有關(guān)［3，13-14］。存在這些爭(zhēng)議的關(guān)鍵原因之一是高壓促進(jìn)肌內(nèi)脂肪氧化中脂肪氧化酶（Lipoxygenase，LOX）的作用仍不清楚。氧化主要分為自動(dòng)氧化和酶促氧化，高壓下兩者的關(guān)系無(wú)人研究過(guò)，但一些學(xué)者研究了干腌肉制品加工中兩者的關(guān)系，如Zhou［15］、Huang［16］發(fā)現(xiàn)在金華火腿和煙熏臘肉生產(chǎn)中脂肪氧化主要是自動(dòng)氧化。而Jin［17］發(fā)現(xiàn)干腌培根加工中LOX能顯著促進(jìn)脂肪氧化。Kühn［18］認(rèn)為L(zhǎng)OX催化脂肪氧化有一定的滯后性，而German［19］的觀點(diǎn)則相反，認(rèn)為內(nèi)源LOX對(duì)脂肪氧化的啟動(dòng)極為重要，但在隨后的加工中以自動(dòng)氧化為主，Roozen［20］、Josephson［21］也證明了這一點(diǎn)。

一些芽孢菌在1000MPa的壓力下仍很穩(wěn)定，而壓力結(jié)合一定溫度的熱處理對(duì)這些菌有較好的抑制效果，因而現(xiàn)在高壓技術(shù)在肉品中的應(yīng)用大多圍繞高壓結(jié)合一定的低溫?zé)崽幚磉M(jìn)行。本文擬研究高壓（350、600MPa）結(jié)合一定的熱處理（20、50℃）對(duì)豬肉中LOX活性和脂肪氧化（TBARS值）的影響，并著重探討兩者的關(guān)系，以明確高壓促進(jìn)肌內(nèi)脂肪氧化中LOX的作用。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

白玉黑土豬由綿陽(yáng)天農(nóng)生態(tài)食品開(kāi)發(fā)有限公司提供，共三頭，同一批飼養(yǎng)，接近商品成豬的重量時(shí)宰殺，宰殺后取背最長(zhǎng)肌，真空包裝后于-18℃保藏待用；大豆脂肪氧化酶（酶活為50000U/mg）、亞油酸Sigma公司；其他藥品均為國(guó)產(chǎn)分析純。

HPP.L2超高壓處理設(shè)備天津華泰森淼生物工程技術(shù)有限公司；FSH-2A勻漿機(jī)上海梅香儀器有限公司；5804R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)德國(guó)Eppendorf公司；U-3900H分光光度計(jì)日本Hitachi公司；JYSA800絞肉機(jī)山東九陽(yáng)電器有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1去LOX樣品的準(zhǔn)備參照靳國(guó)鋒［22］的方法，樣品先在4℃解凍24h，并去掉表面可見(jiàn)脂肪、筋膜及結(jié)締組織，然后用三倍體積（v/w）的冷去離子水（4℃）清洗三次，清洗后加3倍體積（v/w）50mmol/L的磷酸鈉緩沖液（pH7.4，4℃），并勻漿1min（10000r/min），勻漿結(jié)束后用塑料棒攪動(dòng)2min并靜置15min。然后在10000g、4℃條件下冷凍離心30min，離心結(jié)束后用3倍體積（v/w）50mmol/L磷酸鈉緩沖液（pH7.4，4℃）使沉淀再次懸浮，并繼續(xù)10000g條件下冷凍離心30min。重復(fù)懸浮、離心3次，最后一次所得沉淀即為去LOX肌肉，收集備用。

1.2.2LOX的提取和活性測(cè)定未去LOX的樣品先在4℃解凍24h，去掉表面可見(jiàn)脂肪、筋膜及結(jié)締組織，并用絞肉機(jī)絞碎；事先去LOX的樣品直接按以下程序提取。LOX的提取參考Jin等的方法［17］，并進(jìn)行一定修改。稱取一定量的碎肉，加入4倍體積的濃度為50mmol/L、pH7.4的磷酸鈉緩沖溶液，該溶液中還含有濃度為1mmol/L的二硫蘇糖醇（DTT）和乙二胺四乙酸（EDTA），然后用高速勻漿機(jī)在冰水浴中于15000r/min下勻漿4次，每次10s。經(jīng)四層紗布過(guò)濾后，勻漿物在10000g、4℃條件下離心1h，然后得到的上清液經(jīng)濾紙過(guò)濾后即為提取的LOX粗酶液。

亞油酸底物溶液的制備參考Gata等［23］的方法，將稱量好的140mg亞油酸溶解在5mL脫氧重蒸水中，再加入180μL吐溫20，然后用2mol/L的NaOH將溶液的pH調(diào)整到9.0，直到亞油酸完全溶解且pH保持穩(wěn)定，然后用脫氧重蒸水定容至50mL，該溶液于低溫、氮?dú)猸h(huán)境中貯藏備用。

LOX的活性測(cè)定采用分光光度計(jì)法。量取0.2mL亞油酸底物溶液和2.9mL、濃度為50mmol/L、pH為5.5的檸檬酸緩沖溶液在20℃快速混合均勻，待其在234nm處吸光值穩(wěn)定后，加入0.1mL酶溶液，迅速混合均勻后測(cè)定1min吸光度的增加量。對(duì)照樣為0.2mL亞油酸底物溶液和3.0mL檸檬酸緩沖溶液（50mmol/L，pH為5.5）。1個(gè)酶活單位定義為每分鐘每克蛋白中引起吸光度值增加0.001的酶量。

1.2.3TBARS值測(cè)定TBARS值的測(cè)定參考Siu［24］的方法，結(jié)果表示為mg MDA（丙二醛）/kg樣品。

1.2.4樣品處理為研究高壓促進(jìn)豬肉肌內(nèi)脂肪氧化中LOX的作用，設(shè)計(jì)以下四組實(shí)驗(yàn)。

對(duì)照樣豬肉：原料使用前在4℃解凍24h，并去掉表面可見(jiàn)脂肪、筋膜及結(jié)締組織，用絞肉機(jī)絞碎并用聚乙烯塑料袋真空包裝，共15袋，每袋50g左右。

去LOX樣品，用聚乙烯塑料袋真空包裝，共15袋，每袋50g左右。

去LOX的樣品約750g，加入適量從豬背最長(zhǎng)肌中提取的LOX溶液，使LOX在樣品中的活性與對(duì)照樣豬肉相當(dāng)，達(dá)到8～9U，然后用聚乙烯塑料袋真空包裝，共15袋，每袋50g左右。

去LOX的樣品約750g，加入適量外源LOX（大豆LOX），使LOX在樣品中的活性是對(duì)照樣的5倍左右，達(dá)到40～45U，然后用聚乙烯塑料袋真空包裝，共15袋，每袋50g左右。

預(yù)備實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在600MPa、50℃的條件下處理20min豬肉樣品中的LOX會(huì)完全失活；前面的研究發(fā)現(xiàn)常溫下350MPa是導(dǎo)致豬肉脂肪氧化加劇的關(guān)鍵壓力點(diǎn)［25］，而在此條件下LOX活性變化不大，因此本研究中選取600MPa、50℃和350MPa、20℃作為處理?xiàng)l件。以上四組樣品，每組中的3袋準(zhǔn)備好后馬上測(cè)定其LOX活性；其余12袋分別平均分成兩份，每份6袋，其中一份在350MPa、20℃條件下進(jìn)行處理，另一份在600MPa、50℃進(jìn)行處理，處理時(shí)間均為20min，高壓處理以癸二酸二辛酯為壓力傳遞介質(zhì)。高壓處理后，每份的6袋樣品中3袋立即用來(lái)測(cè)定樣品中LOX活性和TBARS值，另外3袋在0～4℃條件下避光透氧冷藏6d后測(cè)定LOX活性與TBARS值。

1.3統(tǒng)計(jì)分析

用SPSS13.0軟件（SPSS Inc.，Chicago，Illinois，USA）作方差分析和多重比較，顯著水平為0.05。

2　結(jié)果與分析

2.1高壓處理和冷藏對(duì)樣品中LOX活性的影響

結(jié)果如表1所示，高壓處理前對(duì)照樣（1、5組）、去LOX+提取的LOX（3、7組）樣品中的LOX活性相當(dāng)，而兩組去LOX樣品（第2、6組）未檢出LOX活性，去LOX+外源LOX（4、8組）的兩組中LOX活性較高，因?yàn)榧尤肓嗽现屑s5倍濃度的外源LOX。高壓處理后，600MPa、50℃處理的樣品，除了第8組還有少量酶活外，其余三組均已檢不出酶活，說(shuō)明肉中的LOX在600MPa、50℃處理20min會(huì)全部失活。Seyderhelm［26］與Heinisch［27］分別報(bào)道了LOX在緩沖溶液中經(jīng)600MPa、45℃處理10min或在40℃處理30min會(huì)全部失活；Rodrigo［28］和Tedjo［29］也分別發(fā)現(xiàn)番茄和大豆中LOX的失活壓力為550和570MPa，這些都與本研究的結(jié)論基本一致。

350MPa、20℃處理的樣品保留較高酶活，其中對(duì)照樣中酶活還升高了7.84%，說(shuō)明有部分酶被激活，激活作用可能是部分酶在高壓下從溶酶體中釋放出來(lái)［30-31］或高壓下酶的結(jié)構(gòu)發(fā)生了有利于活性增加的變化［32］。第3和4組中酶活在高壓處理后都有所下降但不顯著，因此第1組中酶活升高可能主要是由于高壓下酶從溶酶體中釋放所致。一方面，壓力下，酶會(huì)變性失活，另一方面溶酶體膜破壞后部分酶釋放出來(lái)，因此酶活是增加還是減小取決于哪種因素占主導(dǎo)作用。350MPa、20℃下對(duì)照樣酶活增加說(shuō)明此時(shí)酶的釋放占主導(dǎo)，第3、4組樣品可能在去除LOX過(guò)程中溶酶體已破壞，進(jìn)而在高壓處理時(shí)溶酶體中無(wú)酶可釋放，因此酶活有所降低。經(jīng)過(guò)6d冷藏后，各樣品中酶活都有所降低，第1、3和4組分別降低了15.97%、20.66%和26.15%，其中后兩者的降低達(dá)到顯著（p＜0.05）水平，說(shuō)明未經(jīng)提取的肉樣中的LOX在冷藏中更穩(wěn)定，可能是其處于完整的肌肉結(jié)構(gòu)中，肌肉成分對(duì)其有保護(hù)作用。

2.2350MPa處理和冷藏對(duì)樣品脂肪氧化的影響

350MPa處理后各樣品的TBARS值如圖1所示，可以看出，去LOX的樣品TBARS值顯著（p＜0.05）低于其他組，其他組都含有內(nèi)源或外源的LOX，因此可推測(cè)LOX對(duì)高壓下脂肪氧化啟動(dòng)有重要作用?？赡苁怯捎谥狙趸饕譃樽詣?dòng)氧化和酶促氧化，自動(dòng)氧化需要有一個(gè)中間過(guò)程，啟動(dòng)相對(duì)較慢；而酶促氧化啟動(dòng)較迅速，其啟動(dòng)后，生成的一些氧化產(chǎn)物和游離基可迅速帶動(dòng)自動(dòng)氧化，因此可使整個(gè)脂肪氧化的進(jìn)度加快。去LOX的樣品中沒(méi)有LOX，因此完全是自動(dòng)氧化，由于自動(dòng)氧化啟動(dòng)較慢，因此處理結(jié)束時(shí)其TBARS值顯著（p＜0.05）低于其他三組。去LOX+外源LOX的樣品TBARS值最高，比對(duì)照樣高出11.29%，但差異不顯著；而比去LOX+提取的LOX的樣品高出39.86%，差異顯著（p＜0.05）。可能是去LOX+外源LOX的樣品中加入了高濃度的（原料中的5倍）外源LOX，而LOX對(duì)脂肪氧化啟動(dòng)有重要作用，因此其脂肪氧化的速度更快。

圖1　350MPa處理后各樣品TBARS值Fig.1　The TBARS values of samples following pressure treatment of 350MPa

表1　高壓處理和冷藏對(duì)各樣品LOX活性的影響（n=3）Table 1　Effect of high-pressure treatment and cold-storage on the activity of LOX in samples（n=3）

350MPa處理的樣品經(jīng)6d冷藏后TBARS值如圖2所示，剛經(jīng)高壓處理后，去LOX組的TBARS值顯著（p＜0.05）低于去LOX+提取的LOX組（圖1），而經(jīng)過(guò)6d冷藏后，兩者并無(wú)顯著差異，這說(shuō)明LOX雖然對(duì)脂肪氧化啟動(dòng)有重要作用，但不會(huì)影響貯藏后樣品最終的TBARS值，對(duì)樣品最終TBARS值起決定作用的是自動(dòng)氧化?？赡苁怯捎诿复傺趸瘜?duì)底物的專一性較強(qiáng)，且需要酶與底物接觸時(shí)才能發(fā)生反應(yīng)，而自動(dòng)氧化一旦啟動(dòng)后速度較快；也可能是由于后期自動(dòng)氧化對(duì)酶促氧化的抑制作用，因?yàn)樯傻拇罅繗溥^(guò)氧化物會(huì)氧化LOX的巰基而使其失活［33］，LOX失活后，其分子中所含的鐵離子釋放出來(lái)，反而又會(huì)加速自動(dòng)氧化［34］。經(jīng)6d冷藏后，去LOX+提取的LOX組顯著（p＜0.05）低于對(duì)照組，可能是由于LOX提取過(guò)程中，一些水溶性的助氧化物質(zhì)比如金屬離子發(fā)生了部分損失；而在處理后兩者沒(méi)有顯著差異（圖1），可能是處理時(shí)間較短，損失的水溶性成分不足以造成顯著影響，而且啟動(dòng)階段自動(dòng)氧化的作用也不及貯藏階段，啟動(dòng)階段LOX發(fā)揮了重要作用。加提取LOX組的TBARS值顯著（p＜0.05）低于加外源LOX組，可能是由于高濃度的外源脂肪酶引起的脂肪氧化；加外源LOX的樣品冷藏中LOX活性幾乎是加提取LOX組的5倍，但最終TBARS值只比其高36.48%，說(shuō)明TBARS值的增加程度與加入的LOX濃度不呈比例，因此冷藏中起主要作用的仍是自動(dòng)氧化。加外源LOX組與對(duì)照組沒(méi)有顯著差異可能是由于一方面前者中高濃度的LOX增加了脂肪氧化，但同時(shí)樣品在去LOX過(guò)程中部分助氧化物質(zhì)損失掉，兩相抵消了。

圖2　350MPa處理樣品經(jīng)6d冷藏后的TBARS值Fig.2　The TBARS values of samples after 6 day cold-storage following pressure treatment of 350MPa

2.3600MPa處理和冷藏對(duì)樣品脂肪氧化的影響

600MPa、50℃處理后各樣品的TBARS值如圖3所示，可以看出，與350MPa處理時(shí)類似，去LOX的樣品中TBARS值低于其他組，但與去LOX+提取的LOX和對(duì)照樣差異不顯著，而350MPa時(shí)去LOX的樣品顯著低于另外兩組，可能是因?yàn)?00MPa、50℃下LOX迅速失活，因此發(fā)揮作用的時(shí)間較短，不及350MPa處理明顯。同樣，去LOX+外源LOX的樣品處理后TBARS值最高，可能是加入的酶濃度越高失活所需的時(shí)間也更長(zhǎng)，到高壓處理結(jié)束時(shí)仍保留有部分LOX活性（5.58%），因此LOX對(duì)脂肪氧化的啟動(dòng)更明顯。

圖3　600MPa處理后各樣品TBARS值Fig.3　The TBARS values of samples following pressure treatment of 600MPa

600MPa、50℃處理樣品經(jīng)6d冷藏后的TBARS值如圖4，可以看出，雖然對(duì)照樣的TBARS值高于其他三組，但差異不顯著，對(duì)照樣中TBARS值稍高可能是由于去除LOX過(guò)程中一些助氧化物質(zhì)的損失。350MPa處理時(shí)，加入外源LOX的樣品冷藏后TBARS值最高，而600MPa處理后，加入外源LOX的樣品TBARS值低于對(duì)照樣，可能是由于600MPa、50℃條件下加入的外源LOX幾乎全部失活，因此在冷藏中發(fā)揮作用的LOX較少，而350MPa處理的樣品中殘留的LOX活性較高，因此冷藏中發(fā)揮作用的LOX也較多。

圖4　600MPa處理樣品經(jīng)6d冷藏后的TBARS值Fig.4　The TBARS values of samples after 6 day cold-storage following pressure treatment of 600MPa

高壓促進(jìn)肌肉肌內(nèi)脂肪氧化中自動(dòng)氧化和酶促氧化的關(guān)系還無(wú)人作過(guò)報(bào)道，但很多學(xué)者對(duì)肉品加工中脂肪自動(dòng)氧化和酶促氧化的關(guān)系作了研究，Zhou［15］、Huang［16］分別報(bào)道在金華火腿和煙熏臘肉生產(chǎn)中自動(dòng)氧化作用更大，這與本研究的結(jié)論是一致的；而Jin［17］發(fā)現(xiàn)在干腌培根加工中LOX能顯著促進(jìn)脂肪氧化。關(guān)于LOX的作用，German［19］認(rèn)為內(nèi)源LOX對(duì)脂肪氧化啟動(dòng)極為重要，但在隨后的加工中自動(dòng)氧化占優(yōu)，Roozen［20］和Josephson［21］利用模型系統(tǒng)也證明了這一點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)若LOX在開(kāi)始階段失活，脂肪氧化初速度會(huì)減慢，但總的氧化程度不會(huì)降低，這與本研究的結(jié)論一致，但Kühn［18］報(bào)道的結(jié)論相反，認(rèn)為L(zhǎng)OX在催化脂肪氧化中具有一定的滯后性，因?yàn)長(zhǎng)OX中所含的Fe2+轉(zhuǎn)變?yōu)镕e3+后LOX才有活性，而Fe2+向Fe3+的轉(zhuǎn)變需要在脂肪酸氫過(guò)氧化物的作用下才能產(chǎn)生。

3　結(jié)論

3.1600MPa、50℃處理時(shí)豬肉中LOX全部失活，而350MPa、20℃處理對(duì)LOX活性沒(méi)有顯著影響，甚至存在部分激活作用；LOX在6d冷藏過(guò)程中較穩(wěn)定。

3.2LOX對(duì)脂肪氧化的啟動(dòng)有重要作用，但其不會(huì)對(duì)產(chǎn)品冷藏后的最終TBARS值產(chǎn)生顯著影響，冷藏中以自動(dòng)氧化為主。

3.3樣品中加入高濃度外源LOX會(huì)在一定程度上促進(jìn)高壓下的脂肪氧化，但對(duì)TBARS值的提高與加入的酶濃度不呈正比。

3.4高壓促進(jìn)肌內(nèi)脂肪氧化過(guò)程中，脂肪氧化主要以自動(dòng)氧化為主，LOX的作用十分有限。

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Effect of lipoxygenase on the intramuscular lipid oxidation in pork due to high pressure treatment

HUANG Ye-chuan，LI Feng，YAN Cheng
（College of Life Science and Engineering，Southwest University of Science and Technology，Mianyang 621010，China）

To investigate the effect of lipoxygenase（LOX）on the intramuscular lipid oxidation in pork due to high pressure treatment，porcine longissimus muscle which had been removed of LOX was used as material，after addition of some LOX extracted from fresh porcine longissimus muscle or exogenous LOX（from soybean），the samples were treated at 600MPa-50℃ or 350MPa-20℃ before 6 days storage at 4℃，then the activities of LOX and TBARS values in all samples after high pressure treatment and after cold storage were analyzed.The results showed that LOX had important role on the start-up of intramuscular lipid oxidation due to high pressure treatment，but it had no effect on the last oxidation state（TBARS value）of chilled samples.During cold storage after high pressure treatment，the lipid oxidation was mainly the auto-oxidation，and the role of LOX was very limited，even 5 times of exogenous LOX was added，the TBARS value of the chilled samples only increased a little.So the role of LOX on the intramuscular lipid oxidation in pork due to high pressure treatment was very limited compared to auto-oxidation.

high pressure；pork；lipid oxidation；lipoxygenase

TS251.1

A

1002-0306（2015）14-0147-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.14.022

2014－10－20

黃業(yè)傳（1975-），男，博士，副教授，研究方向：肉制品食品加工與酶工程。

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（31271892）。