胡亞亞，邢路娟，周光宏，張萬(wàn)剛

（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)肉品加工與質(zhì)量控制教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇南京210095）

不同提取方法對(duì)金華火腿粗肽液抗氧化活性的影響

胡亞亞，邢路娟，周光宏，張萬(wàn)剛*

（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)肉品加工與質(zhì)量控制教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇南京210095）

研究?jī)煞N提取方法（磷酸鹽和鹽酸）所得金華火腿粗肽液的抗氧化活性，以自由基的清除能力，金屬離子螯合能力，還原力以及總抗氧化能力為測(cè)定指標(biāo)，以還原型谷胱甘肽（GSH）作對(duì)照。結(jié)果表明：磷酸鹽法提取的金華火腿粗肽液（P）多肽含量顯著（p＜0.05）高于鹽酸法提取的金華火腿粗肽液（H）；質(zhì)量濃度低于5mg/mL時(shí)，P和H清除DPPH自由基與超氧陰離子自由基能力無(wú)顯著差異；P螯合金屬離子的能力顯著（p＜0.05）高于H和GSH；當(dāng)質(zhì)量濃度為4mg/mL時(shí)，P還原力顯著（p＜0.05）高于H；當(dāng)質(zhì)量濃度為1mg/mL時(shí)，P總抗氧化能力達(dá)到GSH的48%，顯著高于H（p＜0.05）。因此磷酸鹽所提取的金華火腿粗肽液抗氧化能力優(yōu)于鹽酸所提取的金華火腿粗肽液。

金華火腿，抗氧化肽，DPPH自由基清除率

自由基是一類具有高度氧化活性的帶有單個(gè)或多個(gè)不配對(duì)電子的分子或原子，化學(xué)性質(zhì)活躍［1］，過(guò)量會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞組織受到氧化脅迫，引起細(xì)胞和機(jī)體的損傷［2］。目前一些人工合成的抗氧化劑如BHT（butylated hydroxytoluene，二丁基羥基甲苯）、BHA（butylated hydroxyanisole，丁基羥基茴香醚）、TBHQ（tert-butylhydroquinone，特丁基對(duì)苯二酚）等雖能有效抑制脂質(zhì)氧化，但研究證實(shí)其有一定的毒性［3］。因此，越來(lái)越多的國(guó)家開(kāi)始尋求高效、無(wú)毒、安全的天然抗氧化劑替代合成抗氧化劑［4］。

金華火腿是我國(guó)著名的傳統(tǒng)肉制品，其在制作過(guò)程中，經(jīng)歷很長(zhǎng)時(shí)間發(fā)酵，在此期間蛋白質(zhì)發(fā)生強(qiáng)烈降解，生成許多肽類［5］。Escudero［6］用鹽酸溶液從西班牙干腌火腿中提取分離出具有抗高血壓和抗氧化活性的短肽。王娟［7］利用磷酸鹽提取金華火腿中的小肽并研究其結(jié)構(gòu)。對(duì)于金華火腿抗氧化肽的提取，Zhu［8］參照西班牙干腌火腿選用鹽酸作為提取液，但是西班牙干腌火腿和金華火腿之間加工方法和品質(zhì)等方面存在很大差異［9］，并且在強(qiáng)酸條件下，抗氧化肽的活性也會(huì)受到影響［8］，因此提取液對(duì)不同火腿抗氧化肽的提取可能會(huì)有很大影響。而對(duì)于不同提取方法對(duì)金華火腿粗肽液抗氧化活性的影響還未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)以兩種方法提取的金華火腿粗肽液為研究對(duì)象，通過(guò)對(duì)兩種金華火腿粗肽液自由基清除能力，螯合金屬離子能力，還原力以及總抗氧化能力等指標(biāo)的測(cè)定，確定金華火腿抗氧化活性肽的提取工藝，探討金華火腿粗肽液的抗氧化能力，為下一步研究金華火腿多肽的抗氧化機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

金華火腿購(gòu)自浙江省金字火腿食品有限公司；1，1-二苯基-2三硝基苯肼（DPPH）、還原型谷胱甘肽（GSH）、吩嗪甲酯硫酸鹽（PMS）、還原型輔酶（NADH）、菲咯嗪（Ferrozine） 均購(gòu)自Sigma公司，分析純；總抗氧化能力試劑盒購(gòu)于南京建成試劑公司；鄰苯二甲醛、β-巰基乙醇、氫氧化鈉、乙醇、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、鐵氰化鉀國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司，均為分析純。

T25勻漿機(jī)德國(guó)IKA公司；GM200刀式研磨儀德國(guó)Retsch；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上海亞榮生化儀器廠；ES2030冷凍干燥機(jī)日本Hitachi公司；Spectral Max M2e多功能酶標(biāo)儀美國(guó)伯騰儀器有限公司；Avanti J-E高速冷凍離心機(jī)美國(guó)Beckman Coulter公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1樣品處理火腿按照傳統(tǒng)加工工藝加工，包括腌制、浸泡、洗刷、整形、曬腿、成熟和后熟等過(guò)程。隨機(jī)選取后熟結(jié)束的火腿六塊，取股二頭肌編號(hào)，在分析測(cè)試前于－20℃冰柜保存。

1.2.2粗肽的提取磷酸鹽法參照王娟等［7］的方法進(jìn)行。具體操作為：取后熟結(jié)束的成品股二頭肌25g，絞碎后加入100mL磷酸緩沖液（pH7.0），冰浴勻漿4次（22000r/min，每次10s）。勻漿液于4℃條件下靜置2h后離心（4℃，12000×g，20min）。離心完畢后，取上清液加入三倍體積40%乙醇（V∶V），放置12h后再次離心（4℃，12000×g，20min），所得上清液用1mol/L氫氧化鈉調(diào)節(jié)至pH7.0。上清液經(jīng)冷凍干燥后置于－20℃保存?zhèn)溆?。此方法所得粗肽稱為金華火腿粗肽P。

鹽酸法參照Z(yǔ)hu等［10］的方法并有所修改。具體操作為：取后熟結(jié)束的成品股二頭肌25g，絞碎后加入100mL 0.01mol/L HCl，冰浴勻漿4次（22000r/min，每次10s）。勻漿液在4℃，12000×g條件下離心20min。所得上清液用雙層濾紙過(guò)濾后加入三倍體積乙醇，4℃條件下靜止2h后，在4℃，12000×g條件下離心20min。取上清液于40℃條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，所得濃縮液于冷凍干燥機(jī)中干燥后置于－20℃保存?zhèn)溆?。此方法所得粗肽液稱為金華火腿粗肽液H。

1.2.3肽含量的測(cè)定參照Church等［11］的方法并稍作修改。鄰苯二甲醛混合液的配制：取40mg鄰苯二甲醛（溶于1mL甲醇），25mL 100mmol/L硼砂，2.5mL 20%（w/w）SDS和100μL β-巰基乙醇，用去離子水調(diào)至總體積為50mL。取100μL樣品（包含5～100μg多肽）和2mL鄰苯二甲醛混合液混勻，室溫下孵育兩分鐘后340nm下測(cè)定吸光值。

1.2.4DPPH自由基清除率的測(cè)定參照You等［12］的方法并稍作修改。分別配制質(zhì)量濃度為1、2、3、4、5mg/mL的P和H粗肽液，以相應(yīng)質(zhì)量濃度的GSH為對(duì)照。具體方法如下，將DPPH溶于95%乙醇中，配制成0.2mmol/L的溶液。樣品組為0.5mL DPPH溶液與0.5mL肽液混合，振蕩混勻，室溫放置30min后，在517nm波長(zhǎng)處測(cè)定樣品吸光度值，記為A1；對(duì)照組為0.5mL DPPH溶液與0.5mL 95%乙醇混合，在517nm波長(zhǎng)處測(cè)定樣品吸光度值，記為A2；空白組為0.5mL肽液與0.5mL 95%乙醇混合，在517nm波長(zhǎng)處測(cè)定樣品吸光度值，記為A0。DPPH自由基的清除率按式（1）進(jìn)行計(jì)算。

1.2.5還原力的測(cè)定還原力的測(cè)定采用鐵氰化鉀還原體系，參照Escudero等［13］的方法并稍作修改。配制質(zhì)量濃度為1、2、3、4、5mg/mL的P和H粗肽液，以相應(yīng)質(zhì)量濃度的GSH為對(duì)照。具體方法如下，取0.5mL肽液、0.5mL 0.2mol/L磷酸緩沖液（pH6.6）和0.5mL 1%（w/v）鐵氰化鉀溶液混合，于50℃恒溫水浴鍋中保溫20min后快速冷卻。加入0.5mL 10%（w/v）醋酸，充分混勻，3000r/min離心10min。取0.5mL上清液，加0.5mL蒸餾水和0.1mL 0.1%（w/v）氯化鐵，充分混勻靜置10min后，在波長(zhǎng)700nm處測(cè)定其吸光度。

1.2.6超氧陰離子自由基清除率的測(cè)定清除超氧陰離子自由基采用硝基四氮唑藍(lán)還原法，參照Liu等［14］的方法并稍作修改。具體方法如下，用50mmol/L的Tris-HCl（pH8.0）緩沖液將粗肽配制成質(zhì)量濃度為1、2、3、4、5mg/mL的P和H粗肽液，以相應(yīng)質(zhì)量濃度的GSH為對(duì)照。取1.5mL肽液，依次加入0.5mL 300μmol/L NBT（以pH8.0的Tris-HCl緩沖液配制），0.5mL 468μmol/L NADH（以pH8.0的Tris-HCl緩沖液配制）和0.5mL 60μmol/L PMS（以pH8.0的Tris-HCl緩沖液配制），立即混勻，并于25℃水浴5min后，560nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光值。以緩沖液代替樣品作為空白對(duì)照。超氧陰離子自由基的清除率按式（2）進(jìn)行計(jì)算。

式中，A1—添加抗氧化肽吸光度值；A0—空白吸光度值。

1.2.7螯合金屬離子能力的測(cè)定參考Xie等［15］的方法并稍作修改。具體方法為，配制質(zhì)量濃度為1、2、3、4、5mg/mL的P和H粗肽液，以相應(yīng)質(zhì)量濃度的GSH為對(duì)照。取1mL待測(cè)溶液，加入0.05mL濃度為2mmol/L的FeCl2，充分混勻后加入0.2mL濃度為5mmol/L的菲咯嗪試劑，混勻。室溫靜置10min，在562nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值為A1。以去離子水代替樣品作為空白管，所測(cè)吸光度值為A0。Fe2+螯合率按式（3）進(jìn)行計(jì)算。

1.2.8總抗氧化能力的測(cè)定按試劑盒說(shuō)明書(shū)上方法測(cè)定總抗氧化能力。

1.2.9數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析實(shí)驗(yàn)重復(fù)6次，采用SPSSStatistics 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，用One-Way ANOVA方法進(jìn)行方差分析，采用Duncan’s multiple range test進(jìn)行多重比較，顯著水平設(shè)為p＜0.05。

2　結(jié)果與分析

2.1金華火腿粗肽液肽含量

表1　兩種方法提取后金華火腿粗肽液肽含量Table 1　Peptide contents of Jinhua ham extracts from two extraction methods

表1列出了磷酸鹽法和鹽酸法提取金華火腿粗肽液肽含量的結(jié)果。由表1可知，P肽含量顯著高于H肽含量（p＜0.05）。磷酸提取法所得肽含量比Zhu［10］用鹽酸提取法所得金華火腿提取液肽含量高11倍，說(shuō)明鹽酸方法提取可能對(duì)金華火腿多肽的分離不完全，磷酸鹽方法提取金華火腿粗肽優(yōu)于鹽酸方法。

2.2金華火腿粗肽液清除DPPH自由基的能力

圖1　不同濃度抗氧化提取物清除DPPH自由基的能力Fig.1　The effect of different concentrations of antioxidant extracts on the DPPH radical scavenging activities

圖1列出了粗肽液P、粗肽液H和GSH對(duì)DPPH自由基清除能力的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。如圖1所示，用兩種方法提取得到的粗肽液都有清除DPPH自由基的能力，但低于GSH的清除能力（p＜0.05），且P與H清除DPPH自由基的能力差異不顯著。隨著肽濃度的增加，粗肽液清除DPPH自由基的能力顯著增加（p＜0.05）。在質(zhì)量濃度為1mg/mL時(shí)，粗肽液P的清除率約為8.9%，H的清除率為11.9%，而濃度達(dá)到5mg/mL時(shí)，DPPH自由基清除率分別達(dá)到了44.2%和46.0%。金華火腿中所含肽大多為5～16個(gè)氨基酸組成，具有一定的疏水性，因此隨著濃度的增加，對(duì)DPPH自由基的親和能力逐漸增加［16］。在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，兩種提取方法對(duì)DPPH自由基清除能力影響差異不顯著，且都具有較高的DPPH自由基清除率。

2.3金華火腿粗肽液清除超氧陰離子自由基的能力

粗肽液P、粗肽液H和GSH對(duì)超氧陰離子自由基清除能力的實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示。超氧陰離子自由基本身并不活潑，但卻是機(jī)體產(chǎn)生自由基的根源，它既可以作為還原劑又可以作為氧化劑，還可以作為親核物和配體參與反應(yīng)，導(dǎo)致機(jī)體氧化損傷［17］。由圖2所示，用兩種方法提取得到的粗肽液都有超氧陰離子清除能力，但低于GSH的清除能力（p＜0.05）。在質(zhì)量濃度小于5mg/mL時(shí)，H和P的超氧陰離子清除能力差異不顯著（p＞0.05）。在質(zhì)量濃度為5mg/mL時(shí)，P（74.9%）顯著低于H（80.9%），分別達(dá)到GSH（94.4%）超氧陰離子自由基清除率的79%和86%（p＜0.05）。研究表明一些側(cè)鏈有氨基或羧基的特定氨基酸（如Lys、Asp和Glu）具有清除自由基的作用，能夠增強(qiáng)肽的抗氧化性［18］。金華火腿中有較高含量的谷氨酸和賴氨酸［19］，因此隨著濃度的增加，其清除超氧陰離子自由基的能力逐步增加。在低質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，兩種提取方式所得金華火腿粗肽液對(duì)超氧陰離子自由基清除能力差異不顯著，都有較高的清除率。

2.4金華火腿粗肽液的還原力

圖2　不同濃度抗氧化提取物清除超氧陰離子自由基的能力Fig.2　The effect of different concentrations of antioxidant extracts on the superoxide anion radical scavenging activities

圖3　不同濃度抗氧化提取物的還原力Fig.3　The effect of different concentrations of antioxidant extracts on reducing power

圖3列出了粗肽液P、粗肽液H和GSH還原力的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。由圖3所示，GSH還原力最強(qiáng)，極顯著高于金華火腿粗肽提取液P和H（p＜0.01）。三種抗氧化物質(zhì)還原力隨著質(zhì)量濃度的增大逐漸增加，并存在明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系。在質(zhì)量濃度低于2mg/mL時(shí)，金華火腿提取液P還原力和H無(wú)顯著差異。當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到3mg/mL時(shí)，金華火腿提取液P還原力顯著高于金華火腿提取液H（p＜0.05）；在4mg/mL時(shí)，P的還原力極顯著高于H（p＜0.01）；在質(zhì)量濃度達(dá)到5mg/mL時(shí)，P還原力是H的1.8倍。還原力在一定程度上代表抗氧化物質(zhì)提供電子的能力，還原力強(qiáng)的物質(zhì)是優(yōu)良的電子供體。一般自由基的清除是通過(guò)抗氧化物提供電子并生成穩(wěn)定的物質(zhì)而實(shí)現(xiàn)的，因此抗氧化物質(zhì)提供電子能力的強(qiáng)弱能夠反映其抗氧化能力的強(qiáng)弱［20］。所以，在質(zhì)量濃度較高的范圍內(nèi)，P還原力比H高。

2.5金華火腿粗肽液螯合Fe2+的能力

圖4　不同濃度抗氧化提取物螯合Fe2+的能力Fig.4　The effect of different concentrations of antioxidant extracts on the Fe2+-chelating ability

粗肽液P、粗肽液H和GSH螯合Fe2+能力的實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示。有研究表明過(guò)渡金屬（Fe2+和Cu2+）是產(chǎn)生自由基的媒介，可以催化活性氧的產(chǎn)生，如羥自由基和超氧陰離子自由基［21］。抗氧化劑能影響金屬離子的催化活性，進(jìn)而抑制其催化氧化的過(guò)程，因而測(cè)定其金屬離子的螯合能力是評(píng)價(jià)物質(zhì)抗氧化活性的有效方法。由圖4可知，隨著質(zhì)量濃度的增加，H螯合Fe2+的能力顯著增加（p＜0.05），由質(zhì)量濃度為1mg/mL時(shí)的13.3%增至質(zhì)量濃度5mg/mL時(shí)的33.5%。P的抗氧化能力隨著質(zhì)量濃度的增加變化不顯著，并且粗肽液P表現(xiàn)出很強(qiáng)的Fe2+螯合能力，在質(zhì)量濃度為1mg/mL時(shí)其螯合能力高達(dá)92.1%。在質(zhì)量濃度達(dá)到2mg/mL時(shí)，P和H都極顯著高于GSH（p＜0.01）。與GSH相比，金華火腿粗肽液具有極強(qiáng)的金屬離子螯合能力，這可能與其中含有大量的酸性氨基酸和中性氨基酸有關(guān)，其側(cè)鏈中包含的氨基和羧基能夠與Fe2+緊密結(jié)合，從而減少Fe2+的含量，抑制了自由基的產(chǎn)生。這一特點(diǎn)對(duì)于其發(fā)揮抗氧化作用起著至關(guān)重要的作用［22］。

2.6金華火腿粗肽液的總抗氧化能力

圖5列出了粗肽液P、粗肽液H和GSH總抗氧化能力的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。物質(zhì)的總抗氧化能力是其清除不同種類自由基，或是其不同活性成分清除不同自由基的總和。目前用于測(cè)定物質(zhì)體外抗氧化能力的方法大多是針對(duì)某一種自由基而言，無(wú)法全面反映其總抗氧化能力［23］。由圖5可知，P總抗氧化能力高于H，但顯著低于GSH（p＜0.05），隨著質(zhì)量濃度的增加，P總抗氧化能力顯著增加（p＜0.05）。在質(zhì)量濃度為1mg/mL時(shí)，P（0.7U/mL）極顯著（p＜0.01）高于H（0.1U/mL），達(dá)到GSH（1.6U/mL）總抗氧化能力的48%。因此，P的總抗氧化能力比H高。

圖5　不同濃度抗氧化提取物的總抗氧化能力Fig.5　The effect of different concentrations of antioxidant extracts on T-AOC

3　結(jié)論

磷酸鹽提取的金華火腿粗肽液多肽含量顯著（p＜0.05）高于鹽酸提取的金華火腿粗肽液，其抗氧化活性隨著質(zhì)量濃度的增加而增加，清除自由基能力與鹽酸提取的金華火腿粗肽液相當(dāng)，而還原力，螯合Fe2+能力和總抗氧化能力顯著高于鹽酸提取的金華火腿粗肽液（p＜0.05）。鹽酸所提供的強(qiáng)酸性環(huán)境，會(huì)對(duì)抗氧化肽活性造成不可逆的損傷，而磷酸鹽在平衡滲透壓、維持離子強(qiáng)度和調(diào)節(jié)pH方面都有更好作用，這可能是磷酸鹽提取的金華火腿粗肽液的抗氧化能力優(yōu)于鹽酸提取的金華火腿粗肽液的主要原因。因此，磷酸鹽提取法更適合于金華火腿中抗氧化肽的提取。

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Effect of extraction methods on the antioxidant activity of crude peptides from Jinhua ham

HU Ya-ya，XING Lu-juan，ZHOU Guang-hong，ZHANG Wan-gang*
（Key Laboratory of Meat Products Processing and Quality Control，Ministry of Education，Nanjing Agricultural University，Nanjing 210095，China）

Crude peptides were extracted by two solutions from Jinhua ham and evaluated for antioxidant activity by radical scavenging，metal ion chelating，reducing power and the total antioxidant capacity（T-AOC）with GSH as control.The results showed that the crude peptide extract from Jinhua ham using PBS as solution（crude peptide P）presented higher peptide content than crude peptide extract using HCl as solution（crude peptide H）.The DPPH radical scavenging capacity and the superoxide anion radical scavenging activities of crude peptide P did not differ significantly from that of crude peptide H below 5mg/mL.In addition，the crude peptide P showed higher metal ion chelating activity than crude peptide H and GSH，which presented higher reducing power than crude peptide H at 4mg/mL（p＜0.05）.Total antioxidant capacity of crude peptide P reached 48%of GSH at 1mg/mL，which was significantly higher than crude peptide H（p＜0.05）.In conclusion，crude peptide P had higher antioxidant activity than crude peptide H.

Jinhua ham；antioxidant peptide；DPPH radical scavenging ratio

TS251.1

A

1002-0306（2015）14-0115-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.14.014

2014－12－05

胡亞亞（1990-），男，碩士研究生，研究方向：肉品加工與質(zhì)量控制。

張萬(wàn)剛（1977-），男，教授，研究方向：畜產(chǎn)品加工與質(zhì)量控制。

南京農(nóng)業(yè)大學(xué)人才引進(jìn)項(xiàng)目（804085）；“十二五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2012BAD28B03）。